本發(fā)明涉及一種海藻寡糖在制備用于治療或預(yù)防腸病毒71型感染的組合物中的用途，其中該組合物典型地可作為醫(yī)藥組合物、食品添加物及清潔衛(wèi)生用品的添加物。特別地，本發(fā)明的海藻寡糖是由來自石花菜的寡糖與來自青海菜的寡糖的組合。
背景技術(shù)：
：腸病毒71型屬于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，腸病毒屬(enterovirus)，是目前已知的腸病毒中最后被發(fā)現(xiàn)的一種。腸病毒71型感染腦髓及腦干造成突發(fā)性中樞神經(jīng)的病癥，如：昏睡、急躁、呼吸困難、腦炎、無菌性腦膜炎、手足口癥、皰疹性咽峽炎以及心臟衰竭休克，容易造成兒童重癥，對兒童危害極大。在物理化學(xué)特性上，腸病毒71型病毒顆粒不易受酸堿影響，故其感染力在酸性環(huán)境下，可被穩(wěn)定的保留下來。由于腸病毒71型不具由脂質(zhì)所形成的外套膜(envelope)結(jié)構(gòu)，屬于種裸病毒，故對乙醇具有耐受性，使得酒精無法發(fā)揮抑制作用。此外，一般家庭常用的清潔劑對腸病毒71型亦無殺菌效果。目前也沒有藥物或疫苗可以有效的對抗腸病毒71型所引起的感染。石花菜(gelidiumsp.)是一種紅藻，其所產(chǎn)生的洋菜具較高的膠強度，其質(zhì)量通常被認(rèn)為是最好的，并具較高的販賣價格。青海菜，是一種綠藻，藻體為薄膜狀，單層細胞的膜狀體，藻體呈黃綠色或淡黃色，邊緣為波狀或皺褶。有研究指出高硫酸基含量的青海菜寡糖對倉鼠腎臟細胞bhk-21不具細胞毒性，且具有抗日本腦炎病毒(japaneseencephalitisvirus,jev)的活性。有報導(dǎo)顯示海藻多糖具有增強免疫力、抑制腫瘤細胞、抗氧化和抗病毒等藥理活性，但對于抗病毒的藥理機制尚不明確，尤其針對腸病毒少有深入探討。因此，針對腸病毒71型，仍有需要找出可有效對抗其感染的活性成分，特別是來自日常生活的天然食材，不但可達治療功效，亦有無毒及容易取得的優(yōu)點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一種石花菜與青海菜的組合寡糖在制備用于治療或預(yù)防腸病毒71型感染的組合物的用途。具體而言，本發(fā)明的組合物可提高對于腸病毒71型感染的抑制率，例如，提高細胞感染病毒后的存活率及抑制病毒斑形成。在部分具體實施例中，該來自石花菜的寡糖與該來自青海菜的寡糖中硫酸根含量達10％(w/w)以上。在部分具體實施例中，該來自石花菜的寡糖與該來自青海菜的寡糖分子量低于5kda。在部分具體實施例中，該來自石花菜的寡糖是經(jīng)由如下步驟制得：(a-1)將海洋菌株培養(yǎng)于含有由石花菜所制得的海藻多糖的細菌培養(yǎng)液，使該海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶，然后將所獲得的含有該糖分解酶的海洋菌株培養(yǎng)物進行分離，去除菌體，獲得含有該糖分解酶的粗酵素液，其中該海洋菌株是選自泡囊假單胞菌(pseudomonasvesicularis)、殺鮭產(chǎn)氣單胞菌(aeromonassalmonicida)及其組合所組成的群組；(b-1)提供由石花菜的海藻所制得的海藻多糖樣本；(c-1)于步驟(b-1)的海藻多糖樣本中，加入步驟(a-1)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)，得到所述來自石花菜的寡糖。在部分具體實施例中，該來自青海菜的寡糖是經(jīng)由如下步驟制得：(a-2)將海洋菌株培養(yǎng)于含有由青海菜所制得的海藻多糖的細菌培養(yǎng)液，使該海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶，然后將所獲得的含有該糖分解酶的海洋菌株培養(yǎng)物進行分離，去除菌體，獲得含有該糖分解酶的粗酵素液，其中該海洋菌株是選自泡囊假單胞菌(pseudomonasvesicularis)、殺鮭產(chǎn)氣單胞菌(aeromonassalmonicida)及其組合所組成的群組；(b-2)提供由青海菜的海藻所制得的海藻多糖樣本；(c-2)于步驟(b-2)的海藻多糖樣本中，加入步驟(a-2)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)，得到所述來自青海菜的寡糖。在部分具體實施例中，步驟(a-1)的細菌培養(yǎng)液中所含的海藻多糖、或步驟(b-1)的海藻多糖樣本是石花菜通過熱萃處理后獲得的石花菜多糖萃取液；步驟(a-2)的細菌培養(yǎng)液中所含的海藻多糖、或步驟(b-1)的海藻多糖樣本是青海菜通過熱萃處理后獲得的青海菜多糖萃取液。此處所述熱萃處理后也可進一步加入酸處理。在部分具體實施例中，上述方法進一步包括步驟(d-1)或步驟(d-2)，其為將步驟(c-1)所得來自石花菜的寡糖、或步驟(c-2)所得來自青海菜的寡糖依分子量大小予以分離，獲得一經(jīng)分離的組分。在部分具體實施例中，該經(jīng)分離的組分的分子量為5kda以下。在部分具體實施例中，將步驟(c-1)所得來自石花菜的寡糖、步驟(c-2)所得來自青海菜的寡糖、或步驟(d-1)、步驟(d-2)所得經(jīng)分離的組分經(jīng)干燥處理。在部分具體實施例中，該組合物是用于口服。本發(fā)明的各個具體實施例的細節(jié)說明見具體實施方式。本發(fā)明的其它特征將會通過各個具體實施例中的詳細說明而清楚呈現(xiàn)。然相信本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員基于上述
發(fā)明內(nèi)容即可最大程度利用本發(fā)明。因此，具體實施方式中的實施例說明僅僅是作為示例說明之用，不能以任何方式限制其余的
發(fā)明內(nèi)容。附圖說明圖1為不同濃度的組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)對于腸毒病71型的抑制效果，其中，(a)為組合寡糖gel3-5kda+mon3kda抗病毒的預(yù)防試驗，(b)為組合寡糖gel3-5kda+mon3kda抗病毒的共同試驗，(c)為組合寡糖gel3-5kda+mon3kda抗病毒的治療試驗；a：表示與b有顯著差異。b：表示與a有顯著差異。c：表示與a和b有顯著差異。ab：表示與c有顯著差異。bc：表示與a有顯著差異。圖2為不同濃度的組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)對于腸毒病71型的病毒斑抑制效果。圖3為組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖，0.2mg/ml)以不同處理方式(預(yù)處理、病毒吸附、和病毒感染)后對于腸毒病71型的病毒斑抑制效果。具體實施方式本發(fā)明分析石花菜與青海菜組合寡糖，首次證實其針對腸病毒71型的感染有良好的抑制效果。石花菜與青海菜寡糖無毒且容易取得，相較于有毒性且昂貴的化學(xué)藥物有更高的接受度，特別是針對高危險的嬰幼兒而言。因此，本發(fā)明對于腸病毒71型的治療及防治應(yīng)用作出了貢獻。除非另有指明，所有在此處使用的技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有如同本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員一般所了解的意義。本發(fā)明公開了一種石花菜與青海菜組合寡糖用于制備供治療或預(yù)防腸病毒71型感染的組合物的用途。本發(fā)明的石花菜與青海菜組合寡糖是包括來自石花菜的寡糖與來自青海菜的寡糖的組合。在部分具體實施例中，來自石花菜的寡糖與該來自青海菜的寡糖中硫酸根含量達10％(w/w)以上。在部分具體實施例中，來自石花菜的寡糖與該來自青海菜的寡糖分子量低于5kda，例如，介于5kda與3kda之間或3kda以下。在部分具體實施例中，來自石花菜的寡糖與來自青海菜的寡糖是分別將由石花菜、青海菜制得的海藻多糖樣本經(jīng)酵素水解所制得，其中該酵素是泡囊假單胞菌(pseudomonasvesicularis)及/或殺鮭產(chǎn)氣單胞菌(aeromonassalmonicida)的海洋菌株受來自石花菜或青海菜的海洋多糖誘導(dǎo)而產(chǎn)生的。本文所述泡囊假單胞菌及殺鮭產(chǎn)氣單胞菌是常見的水產(chǎn)動物感染性細菌，可通過常規(guī)方式從河口、海水沿岸等環(huán)境中分離，也可從陸上淡水、廢水、土壤等其它環(huán)境中分離，并可利用洋菜培養(yǎng)基進一步篩選出分解洋菜能力較佳的菌株。本文所述“石花菜”是指石花菜屬(gelidium)的藻類，屬于紅藻，常見種類包括：安曼司石花菜(gelidiumamansii)、太平洋石花菜(gelidiumpacificum)、匍匐石花菜(gelidiumpusillum)等。本文所述“青海菜”是指礁膜屬(monostroma)的藻類，屬于綠藻，常見種類包括：礁膜(monostromanitidum)、寬礁膜(monostromaoxyspermum)。本文所述“細菌培養(yǎng)液”是指一般用于培養(yǎng)海洋細菌的培養(yǎng)液，例如，海洋液體培養(yǎng)基(marinebroth，mb)。在部分具體實施例中，來自石花菜的寡糖是經(jīng)由如下步驟制得：(a-1)將海洋菌株培養(yǎng)于含有由石花菜所制得的海藻多糖的細菌培養(yǎng)液，使該海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶，然后將所獲得的含有該糖分解酶的海洋菌株培養(yǎng)物進行分離，去除菌體，獲得含有該糖分解酶的粗酵素液，其中該海洋菌株是選自泡囊假單胞菌(pseudomonasvesicularis)、殺鮭產(chǎn)氣單胞菌(aeromonassalmonicida)及其組合所組成的群組；(b-1)提供由石花菜的海藻所制得的海藻多糖樣本；(c-1)于步驟(b-1)的海藻多糖樣本中，加入步驟(a-1)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)，得到所述來自石花菜的寡糖；在部分具體實施例中，來自青海菜的寡糖是經(jīng)由如下步驟制得：(a-2)將海洋菌株培養(yǎng)于含有由青海菜所制得的海藻多糖的細菌培養(yǎng)液，使該海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶，然后將所獲得的含有該糖分解酶的海洋菌株培養(yǎng)物進行分離，去除菌體，獲得含有該糖分解酶的粗酵素液，其中該海洋菌株是選自泡囊假單胞菌(pseudomonasvesicularis)、殺鮭產(chǎn)氣單胞菌(aeromonassalmonicida)及其組合所組成的群組；(b-2)提供由青海菜的海藻所制得的海藻多糖樣本；(c-2)于步驟(b-2)的海藻多糖樣本中，加入步驟(a-2)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)，得到所述來自青海菜的寡糖。在部分具體實施例中，步驟(a-1)或步驟(a-2)添加于細菌培養(yǎng)液中的海藻多糖、或步驟(b-1)或步驟(b-2)的海藻多糖樣本是所述海藻通過熱萃處理后獲得的海藻多糖萃取液。在部分具體實施例中，海藻可通過熱萃處理方法獲得海藻多糖或海藻多糖樣本。在進行熱萃處理前，海藻是干燥樣本為較佳，例如，海藻洗凈后通過風(fēng)干、日光曬、或置于烘箱(例如，60℃)中進行干燥。再進一步切成適當(dāng)大小或研磨成細粉為較佳，以方便操作，例如小于40目。干燥的海藻樣本可溶于水中加熱至100-150℃，以溶出多糖成份，較佳為100-121℃，約10分鐘以上，例如20-40分鐘。此處所述熱萃處理后也可進一步加入酸處理。更進一步說明，在部分具體實施例中，在步驟(a-1)或步驟(a-2)中，將海洋細菌培養(yǎng)于含有來自石花菜或青海菜的海藻多糖的細菌培養(yǎng)液，使其受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶。具體培養(yǎng)條件可為23-27℃培養(yǎng)1-3天。接著將步驟(a-1)或步驟(a-2)所得的細菌培養(yǎng)液進行分離，去除菌體，獲得含有由海洋細菌受誘導(dǎo)產(chǎn)生的糖分解酶的粗酵素液。此處所述細菌培養(yǎng)物的分離可使用一般分離方法，例如，過濾或離心。根據(jù)本發(fā)明，步驟(c-1)是于步驟(b-1)的海藻多糖樣本中，加入步驟(a-1)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)，得到海藻寡糖。根據(jù)本發(fā)明，步驟(c-2)是于步驟(b-2)的海藻多糖樣本中，加入步驟(a-2)所得的粗酵素液，進行水解反應(yīng)，得到海藻寡糖。具體而言，在水解反應(yīng)中，來自步驟(a-1)或步驟(a-2)的粗酵素液的添加量約為反應(yīng)總體積的5-15％(v/v)，反應(yīng)時間可為1-3天，反應(yīng)溫度可為23-27℃。在部分具體實施例中，本發(fā)明的方法可進一步包括步驟(d-1)或步驟(d-2)，就是將步驟(c-1)或步驟(c-2)所得的海藻寡糖依分子量大小予以分離。糖類分子的分離是本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，例如，超過濾系統(tǒng)(ultrafiltration)。在特定具體實施例中，步驟(c-1)或步驟(c-2)所得的海藻寡糖可經(jīng)分離成分子量為5kda以下的寡糖，例如，分子量在5kda與3kda之間的寡糖或3kda以下的寡糖。在特定具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的海藻寡糖具有對抗腸病毒71型的活性。在部分具體實施例中，步驟(c-1)、步驟(c-2)或步驟(d-1)、步驟(d-2)所得的海藻寡糖可經(jīng)干燥處理，以便于保存。在部分具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的石花菜寡糖與青海菜寡糖產(chǎn)率為2至5％(v/v)，較佳為5-10％(v/v)。根據(jù)本發(fā)明，石花菜寡糖與青海菜寡糖組合在一起，具有較佳抗病毒活性。在部分具體實施例中，石花菜寡糖與青海菜寡糖的比例為約1～10：10～1。在特定具體實施例中，石花菜寡糖與青海菜寡糖的比例為1：1(例如，0.1mg石花菜寡糖干燥粉末加上0.1mg青海菜寡糖干燥粉末)。在部分具體實施例中，試驗組在各項組別(預(yù)防，治療，共同加入病毒與寡糖處理)中的細胞存活率較控制組提高40-50％。本發(fā)明通過下面的具體實施例進一步的說明，下面的具體實施例的提供僅作為示范目的，而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能根據(jù)本發(fā)明了解，不脫離本發(fā)明的精神和范圍，而對本發(fā)明所公開的具體實施例中進行許多改變，仍然能獲得相同或相似的結(jié)果。實施例1：石花菜粉末與青海菜粉末的制備及熱處理本實施例分別選擇安曼司石花菜(gelidiumamansii)及礁膜(monostromanitidum)作為本發(fā)明的石花菜與青海菜的海藻來源，將上述海藻經(jīng)過熱處理，萃取出多糖，獲得來自石花菜或青海菜的海藻多糖液。具體而言，分別將石花菜或青海菜洗凈并烘干，再進行研磨，分別獲得石花菜粉末與青海菜粉末，取5g石花菜及5g青海菜粉末分別加入100ml水中，并于滅菌釜中以121℃熱萃10至30分鐘，分別獲得來自石花菜或青海菜的海藻多糖液。實施例2：通過來自石花菜的多糖與來自青海菜的多糖誘導(dǎo)海洋菌株產(chǎn)生糖分解酶本實施例是將海洋菌株分別培養(yǎng)于含有來自石花菜的多糖的細菌培養(yǎng)液和來自青海菜的多糖的細菌培養(yǎng)液，使其受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶，得到粗酵素液。具體而言，將實施例1制得的來自石花菜海藻多糖液和來自青海菜的海藻多糖液以0.15％(v/v)的濃度分別加入海洋細菌培養(yǎng)液(marinebroth,mb)中，將泡囊假單胞菌(ma103)及殺鮭產(chǎn)氣單胞菌(maef108)接種于其中，于25℃培養(yǎng)24小時，使該等海洋菌株受誘導(dǎo)產(chǎn)生糖分解酶。然后，將培養(yǎng)物進行分離，去除菌體，取得含有該糖分解酶的上清液，得到粗酵素液，分別為該等海洋菌株通過來自石花菜的多糖誘導(dǎo)得到的粗酵素液(下稱粗酵素液g)、以及該等海洋菌株通過來自青海菜的多糖誘導(dǎo)得到的粗酵素液(下稱粗酵素液m)。實施例3：將來自石花菜的海藻多糖及來自青海菜的海藻多糖通過粗酵素液進行水解并進行分離處理本實施例是將來自石花菜的多糖樣本及來自青海菜的多糖樣本由對應(yīng)的粗酵素液水解，產(chǎn)生寡糖，然后進行分離處理，獲得不同分子量范圍的海藻寡糖水解部分。具體而言，在由實施例1制得的來自石花菜的海藻多糖液及來自青海菜的海藻多糖液中，分別加入由實施例2得到的粗酵素液g及粗酵素液m(粗酵素液于海藻多糖液的體積百分比為約10％，例如，于約1,000ml的海藻多糖液中加入約100ml的粗酵素液)，于室溫下反應(yīng)1-2天，使多糖水解，產(chǎn)生石花菜的海藻寡糖水解液及青海菜的海藻寡糖水解液。然后，使用5kda與3kda卡匣濾膜，分別將海藻寡糖水解液通過超過濾系統(tǒng)進行分離，取得超過濾分離液，分別獲得分子量為3-5kda的海藻寡糖水解部分及分子量低于3kda的海藻寡糖水解部分。最后，將所得海藻寡糖水解部分通過冷凍干燥系統(tǒng)，得到海藻寡糖干燥粉末，保存于干燥箱中以供后續(xù)實驗使用。表1列出所述各種海藻寡糖干燥粉末及其制法。表1各種海藻寡糖干燥粉末及其制法組合寡糖是將石花菜寡糖與青海菜寡糖組合在一起，以gel3-5kda+mon3kda進行以下實驗，即石花菜寡糖干燥粉末3-5kda與青海菜寡糖干燥粉末<3kda的組合(重量比例為1：1)，在細胞實驗中將不含fbs的細胞培養(yǎng)液稀釋調(diào)整至適當(dāng)濃度(例如，0.2mg/ml，為兩種寡糖粉末總重(mg)/細胞培養(yǎng)液體積(ml))。實施例4：硫酸根含量分析使用實施例3的寡糖樣品，將其溶于濃度1m的0.5mlhcl中，于100℃反應(yīng)1小時后，通過烘箱蒸干至無水分。加入0.5ml的去離子水(ddh2o)回溶后，再加入2ml絕對酒精、1ml的氯化鋇緩沖液(bacl2buffer，含有2m的醋酸10ml、0.05m的氯化鋇2ml、0.02m的碳酸氫鈉8ml，并由絕對酒精定量至100ml)以及1.5ml玫棕酸鈉溶液(na-rhodizonatesolution，含有0.25mg/ml的na2c6o6、100mg抗壞血酸，并由絕對酒精定量至100ml)混勻。避光反應(yīng)20分鐘，最后測量a520并換算成硫酸根含量。利用上述方法檢測石花菜寡糖與青海菜寡糖，其硫酸根含量如表2所示。表2石花菜寡糖與青海菜寡糖硫酸根含量硫酸根含量石花菜寡糖(3-5kda)13.4％青海菜寡糖(<3kda)17.8％實施例5：細胞及病毒培養(yǎng)腸病毒71型的病毒株取自一名于2001年7月間因腸病毒71型重癥死亡的兩歲大女嬰的喉頭檢體，該病毒株為mel701，由中興大學(xué)陳全木老師實驗室提供。另一方面，將非洲綠猴腎細胞(africangreenmonkeykidneycells；vero細胞，atccccl-18)，培養(yǎng)于rpmi-1640培養(yǎng)液中(含2％fbs，ph7.0)，當(dāng)細胞生長約八分滿時進行繼代培養(yǎng)。先移除細胞培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(phosphatebuffersaline，pbs)洗去殘留的血清和細胞代謝物，再加入胰蛋白酶與乙二胺四醋酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)作用3至5分鐘，用胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)中止反應(yīng)，用細胞培養(yǎng)液沖下細胞，收集于離心管中，離心，去除上清液收集細胞沉淀，再用培養(yǎng)液回溶，進行細胞計數(shù)。將mel701病毒株接種于vero細胞(含2％fbsrpmi-1640培養(yǎng)液)中，以倒立式顯微鏡觀察細胞型態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)80％以上細胞病變現(xiàn)象(cytopathiceffect，cpe)時，收集含病毒的培養(yǎng)液，儲存于-80℃的冰箱，供后續(xù)實驗使用。實施例6：病毒感染vero細胞存活試驗將verocell以1.0×103cells/well種入96孔盤中，培養(yǎng)隔夜，待細胞貼覆后，探討于不同時間點添加寡糖樣品對病毒吸附的影響，分為三組：(1)預(yù)防處理(prevention)：將細胞加入不同濃度的組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)(由不含fbs的細胞培養(yǎng)液稀釋)，于培養(yǎng)箱中作用1hr后，移除培養(yǎng)液，加入病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicitiesofinfection,m.o.i.)＝0.1的腸病毒與細胞，感染1hr；(2)治療處理(post-treatment)：將細胞與m.o.i.＝0.1的腸病毒感染1hr后移除培養(yǎng)液，再添入不同濃度的組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)液培養(yǎng)1hr；(3)共同培養(yǎng)處理(co-cultured)：將病毒與不同濃度的組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)液于4℃共同培養(yǎng)1hr，再將此混合物與細胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1hr。以上作用完后，吸除上清液，加入100μl含2％fbs的rpmi培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，利用mttassay方法測定其細胞存活率。圖1顯示組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)在腸病毒的預(yù)防、治療與共同處理的結(jié)果。結(jié)果顯示，石花菜與青海菜組合寡糖展現(xiàn)良好的對抗腸病毒71型感染的效果，呈現(xiàn)劑量依賴反應(yīng)，尤其在0.2mg/ml濃度下，細胞存活率皆達約80-100％，抗病毒效果相當(dāng)優(yōu)異。為證明本發(fā)明的抗病毒效果是基于紅藻寡糖與綠藻寡糖的組合產(chǎn)生的協(xié)同效果。在本實施例中，以單獨龍須菜(gracilariasp.)寡糖(與石花菜同為紅藻)和單獨的石莼(ulvalactuca)寡糖(與青海菜同為綠藻)進行病毒感染vero細胞存活試驗，在預(yù)防處理及治療處理所得細胞存活率僅達約67-74％。參見表3。表3以單獨的紅藻寡糖或單獨的紅藻寡糖進行病毒感染vero細胞存活試驗的結(jié)果實施例7：病毒斑抑制試驗(plaqueinhibitionassay)將vero細胞種于6孔培養(yǎng)皿中(1×105細胞/孔)，置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中，待細胞培養(yǎng)至六、七分滿，抽掉培養(yǎng)液，用pbs沖洗細胞一次。用rpmi-1640培養(yǎng)液(不含胎牛血清)稀釋成不同濃度，各自與細胞于37℃培養(yǎng)作用1小時后，再加入病毒液(50pfu/孔)，于37℃感染1小時。最后加入含2％瓊脂糖膠(agarose)的rpmi-1640培養(yǎng)液，待其凝固，置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四至五天后，用10％的福爾馬林固定，挖除凝膠，用1％的結(jié)晶紫染色，用自來水沖洗后對病毒斑數(shù)目進行計數(shù)。病毒斑抑制率(％)的計算方式為：(vc-vcs)/vc×100％，其中vc是未加入組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)的病毒感染組的病毒斑數(shù)；vcs是加入組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)的病毒感染組的病毒斑數(shù)。實驗數(shù)據(jù)由三次獨立實驗所獲得，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±sem)顯示。實驗結(jié)果如圖2所示，可以看出，組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖，0.2mg/ml)對腸病毒71型的病毒斑抑制率達69％以上。此外，用組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖，0.2mg/ml)測試不同的添加階段對于抗病毒能力的影響。具體而言，在預(yù)處理組(pre-treated)中，細胞先與組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)培養(yǎng)1小時，再添加病毒液(50pfu/孔)感染一個小時；在病毒吸附組(adsorption)中，細胞同時與病毒液(50pfu/孔)連同組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)在37℃共同培養(yǎng)1小時；在病毒感染后組(post-infection)中，細胞先與病毒(50pfu/孔)培養(yǎng)感染1小時，移除培養(yǎng)液，添加組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)，再培養(yǎng)1小時。利用病毒斑分析計數(shù)病毒斑生成抑制率。實驗數(shù)據(jù)由三次獨立實驗所獲得，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±sem)顯示。實驗結(jié)果如圖3所示，可以看出，在預(yù)處理、吸附階段及感染后添加組合寡糖(石花菜寡糖與青海菜寡糖)對于腸病毒均展現(xiàn)優(yōu)異抑制效果，抑制率分別可達62％、88％、及70％。實施例8：石花菜與青海菜寡糖于腸道細胞中的運輸試驗將caco-2細胞(人類結(jié)腸癌細胞株)接種于孔徑為0.4μm的插入式細胞培養(yǎng)皿(transwell)中，并通過細胞電阻電壓奧姆儀(-ers-2voltohmmeter)測量穿越上皮電阻值(transepithelialelectricalresistance,teer)以判別caco-2細胞單層膜是否完整。培養(yǎng)第14天時，穿越上皮電阻值達672.5cm2即代表細胞單層膜生長完整，可進行腸道吸收及運輸測試。分別將不同濃度(0.5mm、2.5mm、5mm、10mm、25mm、50mm)的葡萄糖運輸液加入貼附有caco-2單層膜細胞的transwell上層，并在下層加入不含葡萄糖的運輸液，歷經(jīng)不同反應(yīng)時間，測定其下層運輸液的總糖量，結(jié)果如表4所示。在下層運輸液所測得的總糖量隨時間變化而上升。然而濃度為0.5mm葡萄糖運輸液組別的下層液則無此變化，推斷此葡萄糖運輸液運輸至下層液的濃度低于總糖量測定的極限值。表450mm葡萄糖運輸液在不同反應(yīng)時間于transwell下層所測得的糖含量變化反應(yīng)時間(分鐘)總糖含量(mg/ml)運輸率(％)10.23±0.12350.50±0.096101.01±0.1111301.92±0.1321603.34±0.1637905.10±0.0557實驗結(jié)果如表4所示，可以看出，隨著反應(yīng)時間增加，50mm的葡萄糖運輸液由上層運輸至下層的運輸率為3％至57％，且隨著葡萄糖運輸液濃度的增加，通過測量上層運輸液的總糖量可知不影響caco-2細胞吸收葡萄糖；通過測量下層運輸液結(jié)果可知隨著上層運輸液加入葡萄糖運輸液的濃度越高，運輸至下層運輸液的葡萄糖量也隨之增高，因此選擇濃度為50mm的葡萄糖運輸液作為后續(xù)石花菜、與青海菜寡糖于腸道吸收運輸試驗的正控制組。分別以不同濃度(10mg/ml、4mg/ml、1mg/ml)的石花菜寡糖與青海菜寡糖進行caco-2細胞的細胞毒性試驗，得知石花菜寡糖與青海菜寡糖對caco-2的細胞存活率均高于99％，由此可知石花菜寡糖與青海菜寡糖對于caco-2細胞無毒性影響，且對于細胞生長有所幫助。從實驗結(jié)果可知，1mg/ml的海藻寡糖濃度并不影響caco-2細胞存活率，因此選擇此濃度的海藻寡糖進行腸道細胞吸收與運輸試驗。在transwell上層分別加入濃度為1mg/ml的石花菜寡糖與青海菜寡糖運輸液，在transwell下層加入不含海藻寡糖的運輸液，于時間點0min、30min、90min分別取出上、下層運輸液，測定其總糖量變化。實驗結(jié)果如表5所示，可以看出，隨著反應(yīng)時間增加，transwell上層運輸液中的石花菜寡糖與青海菜寡糖的總糖量有下降的趨勢(分別由0.33和2.25mg/ml下降至0.10和0.07mg/ml)。反應(yīng)90min后，transwell的細胞中的總糖量分別測得為0.16和2.17mg/ml。綜合以上結(jié)果可得知，石花菜寡糖與青海菜寡糖可經(jīng)由caco-2細胞自transwell上層被caco-2細胞吸收。表5石花菜寡糖gel3-5kda與青海菜寡糖mon3-5kda在不同時間下caco-2細胞的總糖量變化與吸收運輸比例當(dāng)前第1頁12