本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種治療肺鱗癌和小細胞肺癌的中藥復(fù)合物。

背景技術(shù)：

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。最新世界癌癥報告顯示：2012年約有1400萬癌癥新發(fā)病例及800萬死亡病例，且2012年中國新增癌癥病例306萬(約占全球20％)，癌癥死亡220萬例(約占全球25％)，其中肺癌發(fā)病率最高。另據(jù)2015年中國癌癥數(shù)據(jù)分析報告顯示，肺癌的發(fā)病率及死亡率仍居我國癌癥第一位，且男性明顯高于女性，農(nóng)村高于城市，西南地區(qū)死亡率高于北部和西北部。多數(shù)肺癌患者就診時已屬晚期，化療雖可延長生命，但患者生活及預(yù)后質(zhì)量差。故急需醫(yī)學(xué)界尋找新的治療思路。

肺癌從病理角度可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類。非小細胞肺癌最多見，約占80％，大多起源于支氣管，臨床常見病理類型有鱗癌、未分化癌、腺癌及細支氣管肺泡癌四種，其中鱗癌最為常見，與吸煙密切相關(guān)，但發(fā)展速度比較緩慢、病程較長，對放化療較敏感，在治療上，肺鱗癌以手術(shù)為主，術(shù)后放化療為輔。小細胞肺癌為肺癌的特殊類型，約占肺癌的20％，起源于支氣管粘膜或腺上皮內(nèi)的嗜銀細胞，或支氣管粘膜上皮中可向神經(jīng)內(nèi)分泌分化的干細胞；小細胞肺癌腫瘤細胞生長迅速，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，常伴內(nèi)分泌異常或類癌綜合癥，是一種預(yù)后較差的高度惡性腫瘤。由于小細胞肺癌患者早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移且對放化療敏感，極易出現(xiàn)耐藥及復(fù)發(fā)，因而治療小細胞肺癌以全身化療為主，放療、手術(shù)為輔。

中醫(yī)古籍中關(guān)于肺癌并無專一的論述，散見于“肺積”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等病證。如《靈樞·百病始生》“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣”，《醫(yī)宗必讀·積聚篇》“積之成也，正氣不足，而后邪踞之”等。肺癌的發(fā)生不外乎虛、痰、瘀、毒，腫瘤乃正虛與邪毒互相作用的結(jié)果，虛實、寒熱錯雜，濕痰瘀毒膠結(jié)，日久形成腫塊。

多項研究表明腫瘤生長過程中，生長因子與特異性受體相結(jié)合會激活細胞下游信號通路，促使細胞分裂增殖。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白家族參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)，其活性的增加常與多種癌癥相關(guān)，其激活的結(jié)果是在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，它與細胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白AKT和PDK1結(jié)合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308導(dǎo)致AKT活化。AKT是PI3K下游主要的效應(yīng)物，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進而調(diào)節(jié)細胞的功能。mTOR是一個關(guān)鍵激酶PI3K的下游，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、生長、存活和血管生成。已有研究表明PI3K-Akt-mTOR信號通路在腫瘤干細胞的自身修復(fù)及抗放、化療中起著重要作用，被認為是腫瘤治療失敗、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源，故而PI3K-Akt-mTOR信號通路的研究不可忽視。

當前肺癌的患病率及死亡率仍高居不下，其早期診斷還很困難，現(xiàn)有治療肺癌的多種西藥和中藥使用療效并不盡人意，特別是用于治療肺鱗癌和小細胞肺癌，總體生存率較低。因此，改進肺鱗癌和小細胞肺癌治療方法和研發(fā)創(chuàng)新高效藥物勢在必行。本研究從臨床治療肺癌的533味有效中藥中分別篩選出對人肺鱗癌細胞SK-MES和小細胞肺癌細胞NCI-H69增殖有抑制作用的中藥，并通過正交試驗設(shè)計結(jié)合導(dǎo)師經(jīng)驗組成最佳方劑。運用MTT檢測、流式細胞術(shù)及Western blot分析等技術(shù)，觀察清熱化痰散結(jié)方及拆方對人肺鱗癌細胞SK-MES和小細胞肺癌細胞NCI-H69細胞增殖、細胞形態(tài)、細胞周期及PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，并評價其治療肺鱗癌和小細胞肺癌的臨床療效，從分子層面初步探討中醫(yī)藥治療肺癌的作用機制，為臨床治療肺癌提供高效中醫(yī)方藥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種治療肺鱗癌和小細胞肺癌的中藥復(fù)合物，可有效解決治療肺鱗癌和小細胞肺癌的用藥問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該中藥復(fù)合物是由重量百分比計的：重樓3.5％-14％、蟾皮1.8％-4.5％、穿山龍7％-11.00％、椿皮4.9％-59.1％和山慈菇21％-28.1％構(gòu)成的復(fù)合物。

本發(fā)明原料豐富，組方科學(xué)，易生產(chǎn)制備，成本低，效果好，有效用于治療肺鱗癌和小細胞肺癌，是治療肺癌藥物上的創(chuàng)新。

附圖說明

圖1為本發(fā)明重樓抑制SK-MES細胞增殖的量效關(guān)系；

圖2為本發(fā)明蟾皮抑制SK-MES細胞增殖的量效關(guān)系；

圖3為本發(fā)明穿山龍抑制SK-MES細胞增殖的量效關(guān)系；

圖4為本發(fā)明椿皮抑制SK-MES細胞增殖的量效關(guān)系；

圖5為本發(fā)明山慈菇抑制SK-MES細胞增殖的量效關(guān)系；

圖6為本發(fā)明重樓抑制NCI-H69細胞增殖的量效關(guān)系；

圖7為本發(fā)明蟾皮抑制NCI-H69細胞增殖的量效關(guān)系；

圖8為本發(fā)明穿山龍抑制NCI-H69細胞增殖的量效關(guān)系；

圖9為本發(fā)明椿皮抑制NCI-H69細胞增殖的量效關(guān)系；

圖10為本發(fā)明山慈菇抑制NCI-H69細胞增殖的量效關(guān)系；

圖11為本發(fā)明清熱方抑制SK-MES細胞增殖量效關(guān)系；

圖12為本發(fā)明化痰方抑制SK-MES細胞增殖量效關(guān)系；

圖13為本發(fā)明散結(jié)方抑制SK-MES細胞增殖量效關(guān)系；

圖14為本發(fā)明清熱化痰散結(jié)方抑制SK-MES細胞增殖量效關(guān)系；

圖15為本發(fā)明清熱方抑制NCI-H69細胞增殖量效關(guān)系；

圖16為本發(fā)明化痰方抑制NCI-H69細胞增殖量效關(guān)系；

圖17為本發(fā)明散結(jié)方抑制NCI-H69細胞增殖量效關(guān)系；

圖18為本發(fā)明清熱化痰散結(jié)方抑制NCI-H69細胞增殖量效關(guān)系；

圖19為本發(fā)明各方對SK-MES細胞增殖抑制作用時效曲線對比；

圖20為本發(fā)明各方對NCI-H69細胞增殖抑制作用時效曲線對比。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細說明，

本發(fā)明在具體實施中可由以下實施例給出：

實施例1：本發(fā)明治療肺鱗癌和小細胞肺癌的中藥復(fù)合物是由重量百分比計的：重樓3.68％、蟾皮1.93％、穿山龍7.28％、椿皮59.02％和山慈菇28.09％組成。

實施例2：本發(fā)明治療肺鱗癌和小細胞肺癌的中藥復(fù)合物還可由重量百分比計的：重樓13.81％、蟾皮4.49％、穿山龍11.00％、椿皮49.24％和山慈菇21.46％組成。

實施例3：本發(fā)明治療肺鱗癌和小細胞肺癌的中藥復(fù)合物還可由重量百分比計的：重樓9％、蟾皮3％、穿山龍9％、椿皮54％和山慈菇25％組成。

本發(fā)明是運用MTT法分別檢測533味中藥對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69增殖抑制的作用，篩選出均能抑制兩種細胞增殖的藥物，根據(jù)《中藥學(xué)》藥物功效、正交試驗設(shè)計結(jié)果和臨床經(jīng)驗優(yōu)選出最佳方劑；用倒置顯微鏡觀察各方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69細胞形態(tài)的影響；運用流式細胞術(shù)檢測各方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69細胞周期的影響；運用Western blot法分析各方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響。對納入研究的60例中晚期肺鱗癌和小細胞肺癌患者隨機分為對照組和治療組各30例，對照組僅采用西醫(yī)方案化療，治療組在對照組的基礎(chǔ)上同時給予清熱化痰散結(jié)方配合治療。連續(xù)治療3個月后，觀察對照組和治療組患者治療前后中醫(yī)癥候變化、瘤體變化、中位生存期和1年生存率、生活質(zhì)量改善以及不良反應(yīng)發(fā)生情況。

①篩選出5味對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69增殖均有抑制作用的藥物。②優(yōu)選出最佳方劑清熱化痰散結(jié)方。③清熱化痰散結(jié)方及其拆方均能抑制人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69的增殖，以本發(fā)明方作用最強，呈劑量依賴和時間依賴關(guān)系，對SK-MES細胞增殖抑制作用強弱依次為：本發(fā)明方﹥散結(jié)方﹥清熱方﹥化痰方，對NCI-H69細胞增殖抑制作用強弱依次為：本發(fā)明方﹥清熱方﹥散結(jié)方﹥化痰方。④清熱化痰散結(jié)方及其拆方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69的細胞周期都有明顯影響。SK-MES和NCI-H69細胞：清熱化痰散結(jié)方及其拆方S期細胞比率明顯增加，SK-MES細胞作用強弱依次為化痰方>清熱方>本發(fā)明方>散結(jié)方，散結(jié)方不僅可以作用于S期，還可以作用于G2期；NCI-H69細胞：作用強弱依次為化痰方>清熱方>散結(jié)方>本發(fā)明方，本發(fā)明方不僅可以作用于S期，還可以作用于G2期。⑤人肺鱗癌SK-MES和小細胞肺癌NCI-H69中均有PI3K、Akt、mTOR蛋白表達，清熱方、化痰方、散結(jié)方及本發(fā)明方對PI3K、Akt、mTOR蛋白均有不同程度的抑制作用，兩種細胞mTOR和PI3K蛋白表達均顯示各方效果強弱依次為：本發(fā)明方﹥散結(jié)方﹥清熱方﹥化痰方；兩種細胞Akt蛋白表達均顯示各方效果強弱依次為：本發(fā)明方﹥清熱方﹥散結(jié)方﹥化痰方。⑥與對照組相比，中藥治療組在中醫(yī)臨床癥候療效、瘤體變化、生活質(zhì)量、中位生存期、1年生存率、全身狀況及對化療不良反應(yīng)等方面與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

①清熱化痰散結(jié)方及其拆方均能抑制人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69的增殖。②清熱化痰散結(jié)方及其拆方主要將人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69阻滯于S期從而抑制細胞增殖。③清熱化痰散結(jié)方及其拆方均能抑制人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達，進而抑制人肺癌細胞的增殖。④在肺癌的病變中，熱毒、痰濁、瘀結(jié)與PI3K-Akt-mTOR信號通路蛋白表達密切相關(guān)。⑤清熱化痰散結(jié)方能夠高效治療中晚期肺鱗癌和小細胞肺癌患者，在提高療效，縮小或抑制腫瘤病灶，改善臨床癥狀和生活質(zhì)量，延長生存期等方面都具有較好的作用。也就是說本發(fā)明是申請人經(jīng)科學(xué)研究、試驗和對實踐總結(jié)作出的創(chuàng)造性勞動結(jié)晶，具體有關(guān)資料如下：

1材料

1.1實驗材料

1.1.1實驗藥物

533味候選中藥全部購自河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，經(jīng)鑒定為正品。

1.1.2細胞株

人肺鱗癌細胞株SK-MES、小細胞肺癌NCI-H69購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。

1.1.3主要試劑

95％乙醇(分析純)(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)、胎牛血清(PAA公司)、MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)、MTT、DMSO(Amresco公司)、細胞周期檢測試劑盒(南京凱基公司)；Anti-PI3K(韓國浦項科技大學(xué)信號傳導(dǎo)實驗室惠贈)、Anti-Akt、Anti-mTOR(兔抗人多克隆抗體，Abgent公司)、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP(北京博奧森公司)、硝酸纖維素膜(Bio-Rad公司)、ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruze公司)。其它化學(xué)試劑均為分析純，商業(yè)購得。

1.1.4主要儀器

Heraeus細胞培養(yǎng)箱(Kendro公司)、倒置顯微鏡(Zeiss公司)、ROTINA 35型離心機(Hettich公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、超純水制備器(LABCONCO公司)、ELx800型酶標儀(BIO-TEK公司)、BioMate紫外可見分光光度計(Thermo公司)、蛋白電泳系統(tǒng)(BIO-RAD公司)、FACSCalibur流式細胞儀(BD公司)。

1.2臨床資料

觀察病例為2014年3月-2016年3月河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院收治的中晚期肺鱗癌和小細胞肺癌患者60例，所有患者符合衛(wèi)生部《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》肺癌的診斷標準和國際肺癌研究中心(IASLC)制定的第七版國際肺癌TNM分期標準；排除標準：患者不能合作或不能堅持治療者；肺癌腦轉(zhuǎn)移者；哺乳期婦女；患精神障礙疾病者；有嚴重心、肝、腎等臟器功能衰竭者；合并活動性結(jié)核及其他嚴重感染性疾病者；過敏體質(zhì)及對多種藥物過敏者。采用隨機數(shù)字表法將患者分為對照組和治療組各30例，其中治療組男20例，女10例，平均年齡56.82±13.63歲，肺鱗癌18例，小細胞肺癌12例；對照組男22例，女8例，年齡54.43±12.36歲，肺鱗癌20例，小細胞肺癌10例。兩組在性別、年齡等一般資料方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義﹙P>0.05﹚，具有可比性。

2方法

2.1藥物制備

2.1.1藥物提?。好课逗蜻x中藥各50克，250ml 95％乙醇浸泡，避光保存，每天搖晃1～2次，浸泡7天后開始提純藥物：用過濾漏斗真空抽濾藥液，將過濾的藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(58℃)濃縮至50ml左右，濃縮后的藥液倒入坩堝中，置58℃恒溫水浴鍋上繼續(xù)濃縮，待藥液無乙醇味呈膏狀放入真空干燥箱干燥(58℃)，收集各藥的干燥醇提物并用十萬分之一天平稱量，裝入1.5ml離心管內(nèi)，進行標記(藥物名稱、凈重及稱量時間)，置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2藥物配制

取適量(0.2g～0.3g)醇提藥物干燥物，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，制成濃度為300ug/ul的藥液，放在振蕩器上震蕩至完全溶解，再分別用不含血清的MEM或RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為4000μg/ml的貯存液1.5ml，0.22μm濾膜過濾，做好藥物名稱及不同培養(yǎng)基的標記，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細胞培養(yǎng)

從液氮中迅速取出凍存的細胞株SK-MES和NCI-H69，1min內(nèi)水浴使之快速解凍。吸出細胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，分別補加10ml MEM或RPMI1640培養(yǎng)基，吹打混勻，1000rpm×10min離心，棄上清，加入不含血清的培養(yǎng)基5ml，吹打混勻，細胞計數(shù)，SK-MES細胞用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基以0.75×10⁶個細胞/皿(10ml細胞懸液)接種于培養(yǎng)皿中，NCI-H69細胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基以2×10⁶個細胞/瓶(20ml細胞懸液)接種于75ml細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO₂、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SK-MES細胞3～4天傳代1次，NCI-H69細胞2～3天傳代1次。

2.3MTT法檢測細胞增殖活性

用MTT法檢測單味藥及組方后的清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES和NCI-H69細胞增殖抑制的量效和時效關(guān)系。

2.3.1單味藥的篩選及其量效關(guān)系檢測

SK-MES細胞：取對數(shù)生長期的細胞，以0.75×10⁶個/板的細胞密度接種于96孔平面培養(yǎng)板，200μl/孔，置于37℃、5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁24h后，棄上清，分別加入各備選藥物(各藥物濃度均為100μg/ml)，200μl/孔，每個藥物3個復(fù)孔，同時加入含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基200μl/孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄上清，每孔加入100μl含10％MTT的MEM培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱4個小時后，棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μl DMSO，放置于搖床上晃動15分鐘待孔內(nèi)臺盼藍充分溶解混勻后用酶標儀(波長設(shè)置為570nm/630nm)測光吸收值(即OD值)，將結(jié)果輸入excel表格，按照公式計算：抑制率(％)＝(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100％，計算出各藥物對SK-MES細胞的抑制率，得出抑制率高的藥物。

NCI-H69細胞：以2×10⁶個/板的細胞密度接種于96孔平面培養(yǎng)板，每孔100μl，放置培養(yǎng)箱平衡30分鐘后加入備選藥物(各藥物濃度均為100μg/ml)，100μl/孔，每個藥物3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組3個復(fù)孔加入含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基100μl/孔，置于37℃、5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，1000rpm×10min離心，棄上清，每孔加入100μl含10％MTT的RPMI1640培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱4個小時后，1000rpm×10min離心，棄上清，每孔加入150μl DMSO，放置于搖床上晃動15分鐘待孔內(nèi)臺盼藍充分溶解混勻后用酶標儀(波長設(shè)置為570nm/630nm)測光吸收值(即OD值)，按上述公式計算出各藥物對NCI-H69細胞的抑制率，得出抑制率高的藥物。

將初篩的抑制率高的藥物再次進行復(fù)篩直至結(jié)果穩(wěn)定，選取均能明顯抑制兩種細胞增殖且抑制率穩(wěn)定的5味藥物分別進行濃度梯度量效實驗，按照上述抑制率計算公式求得各濃度組抑制率，運用excel表格的繪圖功能及SPSS18.0軟件繪制量效關(guān)系曲線圖，求得對兩種細胞均有明顯抑制作用藥物的IC₅₀值。

2.3.2通過正交試驗確定組方

根據(jù)《中藥學(xué)》每味中藥的功效、性味，對SK-MES和NCI-H69細胞增殖均有較強抑制作用的5味中藥初步分為三組：清熱方(重樓、蟾皮)，化痰方(穿山龍、椿皮)，散結(jié)方(山慈菇)。根據(jù)初步分組進行正交實驗設(shè)計，以對SK-MES和NCI-H69抑制率均較高的5味中藥的IC50值為各藥的實驗濃度，選出效果最好的藥物組合方案作為本發(fā)明方組合。

2.3.3清熱化痰散結(jié)方及其拆方對肺癌細胞SK-MES和NCI-H69量效關(guān)系檢測

清熱化痰散結(jié)方及其拆方分別以其單味藥IC50值的0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4倍共8個濃度進行配制后分別作用于兩種細胞，設(shè)置對照組，每組3個復(fù)孔，通過MTT法檢測量效關(guān)系，繪制量效、擬合曲線，并求得兩種細胞清熱化痰散結(jié)本發(fā)明方及拆方組的IC50值。

SK-MES細胞本發(fā)明方的最高濃度為單味藥IC50值的1倍，倍比稀釋8個濃度，NCI-H69細胞本發(fā)明方的最高濃度為單味藥IC50值的2倍，倍比稀釋8個濃度進行實驗，兩種細胞的清熱方、化痰方、散結(jié)方的最高濃度為單味藥IC50值的4倍，倍比稀釋8個濃度。

2.3.4清熱化痰散結(jié)方及其拆方對肺癌細胞SK-MES和NCI-H69時效關(guān)系檢測

以清熱化痰散結(jié)方及其拆方的IC₅₀濃度分別作用于兩種細胞，設(shè)對照組，每組3個復(fù)孔，運用MTT檢測法檢測5個不同時間點(12h、24h、36h、48h和72h)各組對細胞的抑制率，繪制時效曲線。

2.3.5倒置顯微鏡下觀察清熱化痰散結(jié)方及其拆方對肺癌細胞SK-MES和NCI-H69細胞形態(tài)影響

SK-MES細胞以0.75×10⁶個細胞/皿接種于Φ10cm培養(yǎng)皿，NCI-H69細胞以2×10⁶個細胞/皿接種于Φ10cm培養(yǎng)皿內(nèi)，均設(shè)置空白對照組、清熱方、化痰方、散結(jié)方、清熱化痰散結(jié)本發(fā)明方5組，置于37℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，以各治法組IC₅₀值的藥物濃度處理細胞，空白對照組加入新的含10％胎牛血清的MEM或RPMI1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長形態(tài)，并對每組細胞鏡下拍照。

2.4清熱化痰散結(jié)方及其拆方對肺癌細胞SK-MES和NCI-H69細胞周期影響

SK-MES和NCI-H69細胞接種及各組處理同上2.3.5。SK-MES細胞加藥繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，棄上清，PBS清洗細胞兩次，每皿加3ml 0.25％胰蛋白酶消化，3～5分鐘后倒置顯微鏡下觀察細胞開始脫壁，加3ml含血清培養(yǎng)基終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)至15ml離心管內(nèi)進行離心，2000rpm/min，5min，棄上清；NCI-H69細胞加藥繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，將細胞懸液轉(zhuǎn)至50ml離心管內(nèi)進行離心，2000r/min，5min，棄上清。之后兩種細胞分別按細胞周期試劑盒步驟要求處理細胞，最后300目尼龍濾膜直接過濾到流式檢測管中，每樣本獲取2×10⁴個細胞熒光信號，激發(fā)波長488nm，用CellQuest Pro獲取、MODFIT軟件檢測SK-MES和NCI-H69細胞周期分布。

2.5Western-blot法分析清熱化痰散結(jié)方及其拆方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69PI3K、Akt、mTOR蛋白表達影響

SK-MES和NCI-H69細胞接種及各組處理同上2.3.5。SK-MES細胞加藥繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，棄上清，收獲細胞；NCI-H69細胞加藥繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，將細胞懸液轉(zhuǎn)至50ml離心管內(nèi)進行離心，棄上清，收獲細胞。兩種細胞分別提取蛋白，Bradford法測蛋白濃度，20ug/孔上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉1h，加入一抗反應(yīng)4h，洗滌30min，加入二抗反應(yīng)2h，洗滌30min，用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光、顯影、定影、洗片，重復(fù)3次。

2.6治療方法和療效評價

2.6.1治療方案

對照組：化療方案：肺鱗癌選用TP方案(紫杉醇135mg/m²，d1；順鉑75mg/m²，d1、2、3)；小細胞肺癌采用EP方案(DDP 60mg/m²，d1；VP-16 120mg/m²，d1、2、3)。以21d為1個周期，連用4個周期。治療組：從化療第1天開始給予清熱化痰散結(jié)方治療，并隨癥加減。中藥均購自河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，水煎溫服，每日1劑，分2次，每次約150-180mL，連服4個周期。兩組在治療期間均不使用其他抗腫瘤藥物。

2.6.2療效評價

(1)中醫(yī)癥候變化：參照衛(wèi)生部《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》制定癥狀分級量化：①顯效：癥狀總積分比治療前積分減少≥70％；②有效：癥狀總積分比治療前積分減少≥30％而<70％；③無效：癥狀總積分比治療前積分減少<30％或者增加。(2)瘤體變化：根據(jù)WHO實體瘤療效評價標準(RECIST)分為：①完全緩解(CR)；②部分緩解(PR)；③穩(wěn)定(SD)；④進展(PD)，其中CR+PR為有效(RR)。(3)中位生存期和1年生存率：按月計算，患者以確診時間為起點，終點為隨訪結(jié)束(2016年3月)、失訪或死亡時間。(4)生活質(zhì)量狀況：按卡氏評分標準計分：①改善：治療后增加≥10分；②降低：較治療前減少≥10分；③穩(wěn)定：較治療前增加或減少<10分。(5)全身狀況及對化療不良反應(yīng)評價：主要觀察咳嗽、氣急、胸痛、發(fā)熱、神疲乏力、食欲不振、自汗或盜汗等的變化。觀察化療后患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、頭痛、肝功能異常、腎功能異常等不良反應(yīng)的發(fā)生率。

3統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，采用回歸分析或曲線擬合(R2值)、方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。臨床療效評價數(shù)據(jù)分析，符合參數(shù)檢驗條件者，計量資料用t檢驗，計數(shù)資料用χ²檢驗，不符合參數(shù)檢驗條件者，采用秩和檢驗。生存率按壽命表法計算，生存期按時序檢驗法比較。

1最佳抑制肺癌細胞增殖的藥物

運用MTT檢測法，將533味中藥以100ug/ml的藥物濃度分別作用于人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69，篩選出對SK-MES及NCI-H69細胞增殖均有最佳抑制作用的藥物有重樓、蟾皮、穿山龍、椿皮、山慈菇。

2單味藥對SK-MES、NCI-H69細胞增殖抑制作用的量效關(guān)系

MTT法測定5種藥物不同濃度分別對SK-MES和NCI-H69細胞增殖的抑制率。運用excel繪圖工具繪制量效關(guān)系曲線，并依據(jù)SPSS18.0軟件求出單味藥的IC₅₀值，見表1～表2。以單味藥的濃度為橫坐標，以不同濃度的該藥對SK-MES和NCI-H69細胞增殖的抑制率為縱坐標，進行繪圖表示見圖1～圖10。

表1 5種藥物不同濃度對SK-MES細胞增殖的影響

表2 5種藥物不同濃度對NCI-H69細胞增殖的影響

運用SPSS軟件的回歸分析，求得：

SK-MES細胞各藥物的IC50值分別為：重樓12.157ug/ml、蟾皮6.37ug/ml、穿山龍24.025ug/ml、椿皮194.878ug/ml、山慈菇為92.768ug/ml。

NCI-H69細胞各藥物的IC50值分別為：重樓39.182ug/ml、蟾皮12.726ug/、穿山龍31.193ug/ml、椿皮139.674ug/ml、山慈菇為60.875ug/ml。

3正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果

SK-MES與NCI-H69細胞的正交試驗設(shè)計方案及步驟相同：將重樓、蟾皮、穿山龍、椿皮、山慈菇5味中藥按功效組成清熱化痰散結(jié)方，該方分成3組：清熱方(重樓、蟾皮)；化痰方(穿山龍、椿皮)；散結(jié)方：(山慈菇)。選用L₂₇(3¹³)正交表安排實驗(見表3)。共得27次實驗方案：根據(jù)正交試驗設(shè)計，需作27次實驗，具體試驗方案安排及結(jié)果如下(見表4～7)：1重樓、穿山龍、山慈菇，2重樓、穿山龍，3重樓、穿山龍、山慈菇，4重樓、椿皮、山慈菇，5重樓、椿皮，6重樓、椿皮、山慈菇，7重樓、椿皮、穿山龍、山慈菇，8重樓、椿皮、穿山龍，9重樓、椿皮、穿山龍、山慈菇，10蟾皮、穿山龍、山慈菇，11蟾皮、穿山龍，12蟾皮、穿山龍、山慈菇，13蟾皮、椿皮、山慈菇，14蟾皮、椿皮，15蟾皮、椿皮、山慈菇，16蟾皮、椿皮、穿山龍、山慈菇，17蟾皮、椿皮、穿山龍，18蟾皮、椿皮、穿山龍、山慈菇，19重樓、蟾皮、穿山龍、山慈菇，20重樓、蟾皮、穿山龍，21重樓、蟾皮、穿山龍、山慈菇，22重樓、蟾皮、椿皮、山慈菇，23重樓、蟾皮、椿皮，24重樓、蟾皮、椿皮、山慈菇，25重樓、蟾皮、椿皮、穿山龍、山慈菇，26重樓、蟾皮、椿皮、穿山龍，27重樓、蟾皮、椿皮、穿山龍、山慈菇。每組方案設(shè)置3個復(fù)孔作用于SK-MES細胞，并設(shè)置三個復(fù)孔為空白對照組，加藥后48小時用MTT法檢測OD值，觀察藥物間的協(xié)同作用關(guān)系，利用方差分析，結(jié)合導(dǎo)師司富春教授的經(jīng)驗篩選出最佳組合方案。

表3清熱化痰散結(jié)方對SK-MES、NCI-H69細胞的正交試驗因素水平表

表4清熱化痰散結(jié)方對SK-MES細胞正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表5清熱化痰散結(jié)方對SK-MES細胞的正交試驗方差分析表

由方差分析可知A、B、C是結(jié)果的主要影響因子，因素影響大小依次為B>A>C>BC>ABC>AC>AB，結(jié)合表4SK-MES細胞的正交試驗結(jié)果及導(dǎo)師司富春教授的經(jīng)驗得出最佳組合為清熱化痰散結(jié)本發(fā)明方。

表6清熱化痰散結(jié)方對NCI-H69細胞的正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表7清熱化痰散結(jié)方對NCI-H69細胞的正交試驗方差分析表

由方差分析可知A、B、C是結(jié)果的主要影響因子，因素影響大小依次為A≥B≥C＞BC＞AC＞ABC＞AB，結(jié)合表6NCI-H69細胞及導(dǎo)師司富春教授的經(jīng)驗得出最佳組合為清熱化痰散結(jié)本發(fā)明方。

4清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞增殖抑制的量效關(guān)系

分別以各方的濃度(單味藥IC50值的倍數(shù))為橫軸，以藥物對SK-MES、NCI-H69細胞增殖的抑制率為縱軸，繪制量效曲線見圖11～圖18，并計算出SK-MES、NCI-H69細胞各治法組的IC50值。清熱化痰散結(jié)方及其拆方能夠不同程度地抑制SK-MES、NCI-H69細胞增殖，且其對SK-MES、NCI-H69細胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強，表現(xiàn)出明顯的量效依賴，見表8～表9。

運用SPSS軟件的回歸分析，求得：SK-MES細胞清熱方、化痰方、散結(jié)方、本發(fā)明方的IC50值分別是各治法組單味藥IC50值的0.283倍、0.854倍、0.223倍、0.13倍。根據(jù)該結(jié)果可以看出各組對細胞增殖抑制強弱為：本發(fā)明方﹥散結(jié)方﹥清熱方﹥化痰方。

運用SPSS軟件的回歸分析，求得：NCI-H69細胞清熱方、化痰方、散結(jié)方、本發(fā)明方的IC50值分別是各治法組單味藥IC50值的0.219倍、0.44倍、0.332倍、0.106倍。根據(jù)該結(jié)果可以看出各組對細胞增殖抑制強弱為：本發(fā)明方﹥清熱方﹥散結(jié)方﹥化痰方。

表8各方對人肺鱗癌SK-MES細胞增殖抑制作用的量效關(guān)系

表9各方對小細胞肺癌NCI-H69細胞增殖抑制作用的量效關(guān)系

5清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞增殖抑制的時效關(guān)系

清熱化痰散結(jié)方及其拆方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69增殖抑制作用的時效關(guān)系見表10～表11，圖19～圖20。

表10各方對SK-MES細胞增殖抑制作用的時效關(guān)系

由表10、圖19可以看出各方對肺鱗癌SK-MES細胞株的抑制作用隨著時間的增長而增強，不同藥物在不同時段表現(xiàn)出明顯的時效依賴。清熱方在初始時抑制率較強，但增勢緩慢，增勢主要在36h～72h之間，其余各方增勢主要在24h～72h之間，化痰方增勢最為顯著，其次本發(fā)明方，再者散結(jié)方。

表11各方對NCI-H69細胞增殖抑制作用的時效關(guān)系

由表11和圖20可以看出各方對小細胞肺癌NCI-H69細胞株的抑制作用隨著時間的增長而增強，不同藥物在不同時段表現(xiàn)出明顯的時效依賴。清熱方與化痰方在12h～36h之間時增勢緩慢，在36h～72h是增勢開始升高；散結(jié)方及本發(fā)明方在24h以后增勢就開始升高，其中散結(jié)方更為顯著。

6清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞細胞形態(tài)的影響

肺鱗癌SK-MES細胞：空白對照組細胞呈梭型貼壁生長，分布均勻，細胞數(shù)量較多；各方對SK-MES細胞均有抑制作用，細胞數(shù)量少于空白對照組，且不同程度地漂有死細胞。清熱方細胞呈梭形生長，細胞間接觸松散，細胞皺縮?；捣郊毎仕笮紊L，形態(tài)變小，細胞間隙變大；散結(jié)方細胞較對照組偏小，部分細胞膜皺縮發(fā)泡且細胞透光度增高，死細胞較多；本發(fā)明方細胞數(shù)目有所減少，細胞間隙變大，細胞出現(xiàn)皺縮。

小細胞肺癌NCI-H69細胞：觀察可見空白對照組細胞懸浮聚團生長，細胞數(shù)量較多；各方對NCI-H69細胞均有抑制作用，細胞數(shù)量少于空白對照組，細胞聚團生長較對照組少，單個細胞存在現(xiàn)象較為普遍，死細胞較多，其中散結(jié)方的細胞偏小。

7清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞細胞周期的影響

表12不同方對SK-MES細胞細胞周期(FCM)的影響

由表12可以看出，與空白對照組相比，清熱方、化痰方、散結(jié)方及本發(fā)明方G1期的細胞百分比均下降，化痰方下降最為明顯；S期的細胞百分比均升高，其中化痰方最為明顯，清熱方次之，之后依次是散結(jié)方、本發(fā)明方；G2期除清熱方下降明顯外，其余無明顯變化。提示清熱化痰散結(jié)方及其拆方主要將SK-MES細胞阻滯于S期從而抑制細胞增殖，抑制作用強弱依次為化痰方>清熱方>本發(fā)明方>散結(jié)方。

表13不同方對NCI-H69細胞細胞周期(FCM)的影響

由表13可以看出，與空白對照組相比，清熱方、化痰方、散結(jié)方及本發(fā)明方G1期的細胞百分比均下降，化痰方下降最為明顯；S期的細胞百分比均升高，其中化痰方最為明顯，其次是清熱方，之后是散結(jié)方、本發(fā)明方；G2期除化痰方下降明顯、本發(fā)明方略有升高外，其余兩組無明顯變化(細胞周期圖見附錄2圖16-20)。提示清熱化痰散結(jié)方及其拆方主要將NCI-H69細胞阻滯于S期從而抑制細胞增殖，抑制作用強弱依次為化痰方>清熱方>散結(jié)方>本發(fā)明方。

8清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表達影響

查閱Pubmed關(guān)于肺癌細胞SK-MES和NCI-H69磷脂酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的相關(guān)文獻，得知二種細胞內(nèi)均有Akt、mTOR、PI3K蛋白表達，其分子量依次為55KD、283KD、85KD。

8.1清熱化痰散結(jié)方及其拆方對人肺癌細胞SK-MES PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響

用各方IC50值的藥物濃度分別作用于SK-MES細胞48小時，與空白對照組相比，各方對SK-MES細胞中的PI3K、Akt、mTOR蛋白表達均有不同程度的抑制作用，對PI3K蛋白表達作用強弱依次為：本發(fā)明方>散結(jié)方>清熱方>化痰方，對Akt蛋白表達作用強弱依次為：本發(fā)明方>清熱方>散結(jié)方>化痰方，對mTOR蛋白表達作用強弱依次為：本發(fā)明方>散結(jié)方>清熱方>化痰方。

8.2清熱化痰散結(jié)方及其拆方對人肺癌細胞NCI-H69PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響

用各方IC50值的藥物濃度分別作用于NCI-H69細胞48小時，與空白對照組相比，各方對NCI-H69細胞中的PI3K、Akt、mTOR蛋白表達均有不同程度的抑制作用，對PI3K蛋白表達作用強弱依次為：本發(fā)明方>散結(jié)方>清熱方>化痰方，對Akt蛋白表達作用強弱依次為：：本發(fā)明方>清熱方>散結(jié)方>化痰方，對mTOR蛋白表達作用強弱依次為：本發(fā)明方>散結(jié)方>清熱方>化痰方。

9清熱化痰散結(jié)方對肺鱗癌和小細胞肺癌的臨床療效評價

9.1中醫(yī)癥候療效

兩組治療后中醫(yī)臨床癥狀總有效率比較，治療組優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表14。

表14中醫(yī)臨床癥狀療效比較

注：與對照組比較，*P<0.05，表15-表17同此。

9.2瘤體情況變化

兩組治療前后實體瘤近期療效有效率比較，治療組優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表15。

表15實體瘤近期療效比較

9.3中位生存期和1年生存率

兩組生存率比較，治療組優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表16。

表16中位生存期和1年生存率比較

9.4生活質(zhì)量狀況

兩組治療后生存質(zhì)量提高穩(wěn)定率(提高+穩(wěn)定)比較，治療組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表17。

表17生活質(zhì)量比較

9.5全身狀況及對化療不良反應(yīng)比較

與治療組治療前及對照組治療后比較，治療組治療前出現(xiàn)的食欲不振、咳嗽、氣急、胸痛、發(fā)熱、神疲乏力、自汗或盜汗等癥狀明顯改善，均有顯著性差異(P＜0.05)；治療組不良反應(yīng)發(fā)生率為26.7％(8/30)，對照組不良反應(yīng)發(fā)生率為50.0％(15/30)，與對照組比較，治療組不良反應(yīng)發(fā)生率明顯低于對照組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示治療組患者對化療的耐受力優(yōu)于對照組患者。

結(jié)論：

1抑制肺癌細胞株SK-MES和NCI-H69細胞增殖的中藥篩選

將533味中藥以100ug/ml的藥物濃度分別作用于人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69，MTT法檢測得出重樓、蟾皮、穿山龍、椿皮、山慈菇均能最佳抑制SK-MES和NCI-H69細胞增殖。

2清熱化痰散結(jié)方的方義和臨床療效分析

根據(jù)《中藥學(xué)》的藥物功效、正交試驗結(jié)果及臨床經(jīng)驗，將對SK-MES細胞株和NCI-H69細胞株最佳抑制作用的重樓、蟾皮、穿山龍、椿皮、山慈菇5味藥物進行組方，命名為清熱化痰散結(jié)方，該方分為清熱方(重樓、蟾皮)、化痰方(穿山龍、椿皮)及散結(jié)方(山慈菇)。

在這個清熱化痰散結(jié)方中，共涵蓋了5味中藥：重樓清熱解毒；蟾皮清熱解毒；穿山龍清肺化痰、祛濕通絡(luò)；椿皮清熱燥濕兼止血；山慈菇清熱解毒、消癰散結(jié)。肺癌早期癥狀有刺激性干咳，咳痰，痰中帶血，胸痛、胸悶、氣急，晚期癥狀為反復(fù)發(fā)作咳嗽，發(fā)熱，胸痛，咯血，喘鳴，食欲減退，消瘦?？瑞ひ禾登姨抵袔а?，可見血、熱焦灼；痰阻胸中，氣機不暢，不通則痛，導(dǎo)致胸悶、胸痛、氣急。中醫(yī)講肺為貯痰之器，痰積聚日久易化熱成塊，此清熱化痰散結(jié)方，清熱、化痰、散結(jié)藥物相配伍，可清熱解毒、化痰通絡(luò)、散結(jié)消癰，故而該方可有效治療肺癌，縮小或抑制腫瘤病灶，改善臨床癥狀，副作用少，減輕腫瘤給患者帶來的痛苦，提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期。

3清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞量效和時效的影響

分別用清熱化痰散結(jié)方及其拆方作用于人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69 48小時后，結(jié)果表明各方對人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強，呈現(xiàn)劑量依賴，其中本發(fā)明方對細胞增殖的抑制作用最強，表明了各藥物對細胞的增殖抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用。

SK-MES細胞：清熱方、化痰方、散結(jié)方、本發(fā)明方的IC50值分別是各治法組單味藥IC50值的0.283倍、0.854倍、0.223倍、0.13倍，作為后續(xù)實驗的工作濃度，各方對細胞增殖抑制強弱為：本發(fā)明方﹥散結(jié)方﹥清熱方﹥化痰方；NCI-H69細胞：清熱方、化痰方、散結(jié)方、本發(fā)明方的IC50值分別是各治法組單味藥IC50值的0.219倍、0.44倍、0.332倍、0.106倍，作為后續(xù)實驗的工作濃度，各方對細胞增殖抑制強弱為：本發(fā)明方﹥清熱方﹥散結(jié)方﹥化痰方。

清熱化痰散結(jié)方及其拆方對肺癌細胞SK-MES和NCI-H69增殖抑制作用均隨時間的增加而升高，呈現(xiàn)時效依賴，為臨床用藥提供了依據(jù)。

SK-MES細胞：清熱方在初始時抑制率較強，但增勢緩慢，增勢主要在36h～72h之間，其余各方增勢主要在24h～72h之間，化痰方增勢最為顯著，其次本發(fā)明方、散結(jié)方，到72h時，四方的抑制率較為接近；NCI-H69細胞：清熱方與化痰方在12h～36h之間時增勢緩慢，在36h～72h是增勢開始升高；散結(jié)方及本發(fā)明方在24h以后增勢就開始升高，其中散結(jié)方更為顯著，到72h時，四方的抑制率均較為接近。

4清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞細胞形態(tài)的影響

該清熱化痰散結(jié)方及其拆方分別作用于兩種細胞后，細胞形態(tài)變化有所異同。肺鱗癌為貼壁細胞，肉眼鏡下觀較易看出其差異，但由于懸浮細胞聚團生長，故而肉眼鏡下觀其更大的差異不易看出，但就其整體而言，細胞聚團生長的減弱、單個細胞散在存在的情況是其共同現(xiàn)象。表明不同藥物組抑制肺鱗癌及小細胞肺癌生長的作用機制有所差異，同時也說明熱毒、痰濁、瘀結(jié)在肺鱗癌及小細胞肺癌發(fā)生過程中有著不可忽視的重要作用。

5清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞細胞周期的影響

SK-MES和NCI-H69細胞周期檢測結(jié)果表明清熱化痰方主要將這兩種細胞阻滯于S期從而抑制腫瘤細胞的生長，對SK-MES細胞作用強弱依次為化痰方>清熱方>本發(fā)明方>散結(jié)方，對NCI-H69作用強弱依次為化痰方>清熱方>散結(jié)方>本發(fā)明方。

對SK-MES和NCI-H69兩種細胞而言，化痰方及清熱方均主要作用于S期，對于SK-MES細胞，散結(jié)方不僅可以作用于S期，還可以作用于G2期，對于小細胞肺癌，本發(fā)明方不僅可以作用于S期，還可以作用于G2期。可見，不同藥物組分能作用在不同的細胞周期，但主要是作用于S期阻止DNA的合成，抑制腫瘤細胞的生長致其凋亡。不同藥物組抑制細胞周期中的不同時相，為中醫(yī)藥對腫瘤治療尋找新的藥物作用靶點提供了更多的可能性。

6清熱化痰散結(jié)方及其拆方對SK-MES、NCI-H69細胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響

多項研究數(shù)據(jù)表明PI3K-Akt-mTOR信號通路在腫瘤干細胞的自身修復(fù)及抗放、化療中起著重要作用，這被認為是治療失敗、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源。研究肺癌中PI3K-Akt-mTOR信號傳導(dǎo)變化，對于探討肺癌分子病機具有重要意義。本發(fā)明方作用于肺癌細胞SK-MES和NCI-H69 48小時后，運用Western blot分析法，與空白對照組相比，各方對SK-MES和NCI-H69細胞中的PI3K、Akt、mTOR蛋白表達均有不同程度的抑制作用。SK-MES和NCI-H69細胞中PI3K蛋白表達結(jié)果表明：各方作用強弱依次為：本發(fā)明方>散結(jié)方>清熱方>化痰方；SK-MES和NCI-H69細胞中Akt蛋白表達結(jié)果表明：各方作用強弱依次為：本發(fā)明方>清熱方>散結(jié)方>化痰方；SK-MES和NCI-H69細胞中mTOR蛋白表達結(jié)果表明：各方作用強弱依次為：本發(fā)明方>散結(jié)方>清熱方>化痰方。由以上結(jié)果可以推斷出肺癌中的熱毒、痰濁、瘀結(jié)與這些蛋白的表達相關(guān)，且抑制腫瘤生長的作用機制有所不同。

從而充分證明本發(fā)明能有效抑制人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69的增殖；將人肺癌細胞SK-MES和NCI-H69阻滯于S期從而抑制細胞增殖；能抑制細胞PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達，進而抑制腫瘤細胞的增殖，在肺癌的病變中，熱毒、痰濁、瘀結(jié)與PI3K-Akt-mTOR信號表達及轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強密切相關(guān)；能夠高效治療中晚期肺鱗癌和小細胞肺癌患者，在提高療效，縮小或抑制腫瘤病灶，改善臨床癥狀和生活質(zhì)量，延長生存期，是治療肺鱗癌和小細胞肺癌上的創(chuàng)新，經(jīng)濟和社會效益巨大。