本發(fā)明涉及化合物Ternatusine A的新用途，尤其涉及Ternatusine A在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃熱病毒(yellow fever virus，YFV)屬于黃熱毒科黃病毒屬的成員。黃熱病毒能夠引起黃熱病，該病為急性傳染病。國際上已將黃熱病定為檢疫傳染病，中國也將其定為甲類傳染病。1648年，每周的YUCATAN半島首次證實(shí)黃熱病的流行。17～19世紀(jì)，此病通過交通運(yùn)輸被帶到歐洲及北美，在差不多兩個世紀(jì)內(nèi)，黃熱病成為美、非、歐三大洲一些地方最嚴(yán)重的瘟疫之一，造成大量人群死亡。20世紀(jì)以來，本病在北美及歐洲未再發(fā)生，但在中、南美、非洲的一些國家和地區(qū)仍不時流行。據(jù)WHO(1983)報告，1979～1982年期間，黃熱病在非洲發(fā)生50例，南美洲發(fā)生695例，估計(jì)實(shí)際病例數(shù)為上述報告數(shù)的35～480倍。埃及伊蚊是主要傳播媒介。迄今為止，中國尚無病例的報道，但是這并不能使我們放松對該病毒的警惕，因?yàn)橹袊臍夂颉⒌乩憝h(huán)境復(fù)雜，蚊蟲種類繁多，具備傳播條件，同時隨著國際交流的日益頻繁，YFV傳入中國境內(nèi)的可能性非常大。

因此，我們應(yīng)該高度重視對黃熱病毒的研究，加強(qiáng)對其的科研力度，做好相關(guān)知識和藥物的儲備。

本發(fā)明涉及的化合物Ternatusine A是一個2012年發(fā)表(Zhilai Zhan,et al.,Ternatusine A,a New Pyrrole Derivative with an Epoxyoxepino Ring from Ranunculus ternatus.ORGANIC LETTERS,2013,15(8):1970–1973.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型，目前的用途治療老年癡呆(Zhilai Zhan,et al.,Ternatusine A,a New Pyrrole Derivative with an Epoxyoxepino Ring from Ranunculus ternatus.ORGANIC LETTERS,2013,15(8):1970–1973.)，對于本發(fā)明涉及的Ternatusine A在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的用途屬于首次公開，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類型，而且其對于治療或預(yù)防黃熱病毒感染活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時用于治療或預(yù)防黃熱病毒感染顯然具有顯著的進(jìn)步。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種Ternatusine A在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的應(yīng)用，Ternatusine A在10.0uM濃度下對YFV的抑制率為94.6％。而Ternatusine A在濃度為100uM條件下，Vero細(xì)胞的存活率為92.1％。Ternatusine A能夠有效地抑制黃熱病毒的增殖，但是對細(xì)胞毒性很小，可進(jìn)一步開發(fā)為治療這些病毒感染引起的疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

所述化合物Ternatusine A結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：

對于本發(fā)明涉及的Ternatusine A在制備治療或預(yù)防黃熱病毒感染藥物中的用途屬于首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑制活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時用于子宮內(nèi)膜癌的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所涉及化合物Ternatusine A的制備方法參見文獻(xiàn)(Zhilai Zhan,et al.,Ternatusine A,a New Pyrrole Derivative with an Epoxyoxepino Ring from Ranunculus ternatus.ORGANIC LETTERS,2013,15(8):1970–1973.)

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

實(shí)施例1：本發(fā)明所涉及化合物Ternatusine A片劑的制備：

取20克化合物Ternatusine A加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。

實(shí)施例2：本發(fā)明所涉及化合物Ternatusine A膠囊劑的制備：

取20克化合物Ternatusine A加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克，混勻，裝膠囊制成1000粒。

下面通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明其藥物活性。

實(shí)驗(yàn)例1：

A.Ternatusine A對Vero細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)是YFV的易感細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1：接種Vero細(xì)胞：用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種體積100ul；

2：培養(yǎng)Vero細(xì)胞：在37℃，5％(v/v)CO2培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2天；

3：加入Ternatusine A：吸棄每個孔中的DMEM培養(yǎng)基，向各個孔中加入100ul用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(0uM，0.4uM，1.2uM，3.7uM，11uM，33uM，100uM，300uM)的Ternatusine A，對照孔加不加含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100ul；

4：呈色：培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5％(v/v)CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，然后加入Formazan溶解液，在37℃，5％(v/v)CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育4小時，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan全部溶解；

5：測量：在570nm測定吸收值(表1)。

表1不同濃度的Ternatusine A對Vero細(xì)胞的毒性

B.Ternatusine A對YFV的抑制實(shí)驗(yàn)：

以Vero細(xì)胞為培養(yǎng)病毒YFV的細(xì)胞，MOI為0.1，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接入Vero細(xì)胞，24小時后細(xì)胞長至單層(細(xì)胞覆蓋孔底的面積約為80％～90％)，吸出培養(yǎng)基，接入病毒樣品200ul，37℃吸附2小時。吸附完成后，吸棄各孔中的病毒液，用DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入用含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的指定濃度(0uM，0.04uM，0.12uM，0.37uM，1.1uM，3.3uM，10.0uM)的Ternatusine A，于37℃、5％(v/v)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42小時，收集各個孔中的上清，做病毒噬斑實(shí)驗(yàn)。

病毒噬斑實(shí)驗(yàn)：在24孔板中接入Vero細(xì)胞，24小時后細(xì)胞長至單層(細(xì)胞覆蓋孔底的面積約為80％～90％)，吸棄各孔中的培養(yǎng)基，接入用含3％(v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10倍系列稀釋的病毒樣品200ul，37℃吸附2小時。吸附完成后將各個孔的上清板吸棄，用10％(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基洗去未吸附的病毒。加入新鮮的45℃預(yù)熱的半固定培養(yǎng)基[A成分：3％(v/v)FBS，2×MEM培養(yǎng)基，青霉素(美國AMRESCO)和鏈霉素(美國AMRESCO)終濃度分別為100U/ml，0.1mg/ml；B成分：1％(w/v)的瓊脂糖(法國Biowest)。A成分：B成分＝1:1(v/v)]，于37℃、5％(v/v)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72小時。待噬斑形成后用結(jié)晶紫(美國AMRESCO)染色(2％(w/v)結(jié)晶紫溶于10％(v/v)甲醛)，2小時后用流水沖去結(jié)晶紫和瓊脂糖，在顯微鏡下對每孔產(chǎn)生的細(xì)胞噬斑，根據(jù)噬斑數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：plaque formation unit噬斑形成單位)。PFU＝病毒稀釋度×P/V，(P：空蝕斑數(shù)目；V：接種量)。在2次不同的時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表2)。

表2不同濃度的Ternatusine A對YFV滴度降低及抑制作用

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明通過對YFV的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ternatusine A對YFV具有很好的抑制作用，從本質(zhì)上證明了Ternatusine A在治療YFV感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景。