本發(fā)明是抗體偶聯(lián)藥物領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及腦淀粉樣蛋白抗體多肽偶聯(lián)雌激素的結(jié)合物。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默氏癥是全世界范圍內(nèi)最常見的神經(jīng)退行性疾病之一。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。自從1986年Fillit首先報(bào)道雌激素治療7例AD患者3例有效后，越來越多的研究證明雌激素能夠治療此病。其作用機(jī)制可能為：促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長并增加神經(jīng)生長因子及其受體的表達(dá)；抑制β淀粉樣蛋白的沉淀；拮抗β淀粉樣蛋白的毒性作用。有研究表明雌激素治療阿爾茨海默病與腦內(nèi)的煙堿性乙酰膽堿受體(nAchR)表達(dá)的增加有關(guān)。使用雌激素藥物治療老年癡呆癥主要用來緩解女性患者的癥狀，并可以延緩或防止患者病情的繼續(xù)發(fā)展。雌激素同時(shí)，的抗氧化作用可以減少淀粉樣蛋白沉積對(duì)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，防止神經(jīng)細(xì)胞死亡。盡管如此，對(duì)絕經(jīng)婦女而言，長期服用雌激素會(huì)導(dǎo)致子宮癌的發(fā)生，或血栓性自身免疫疾病。因此不得不放棄雌激素的治療。其原因在于，雌激素為全身性用于，而非特異性作用與腦部神經(jīng)細(xì)胞。從而導(dǎo)致副作用的發(fā)生。因此，發(fā)明人希望能夠?qū)⒋萍に嘏c特異性的抗體偶聯(lián)，從而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞的靶向作用，提高療效，減少毒副作用。

研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默氏癥的的臨床發(fā)病特征是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞死亡的細(xì)胞外淀粉樣蛋白斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維結(jié)節(jié)。整合在神經(jīng)細(xì)胞膜內(nèi)的APP蛋白(Amyloid Precursor Protein，淀粉樣前體蛋白)在正常狀態(tài)和發(fā)病狀態(tài)下的不同加工過程是導(dǎo)致疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。在正常狀態(tài)下，APP最初是由α-分泌酶裂解并產(chǎn)生sAPPα和C-末端片段C83。sAPPα與正常的突觸通訊相關(guān)，對(duì)于突觸的形成、學(xué)習(xí)和記憶、感情活動(dòng)和神經(jīng)細(xì)胞存活等生命活動(dòng)和過程至關(guān)重要。在發(fā)病狀態(tài)下，APP被β-分泌酶和γ-分泌酶裂解并產(chǎn)生一個(gè)叫大腦淀粉樣蛋白(Aβ)40/42的胞外片段。這個(gè)片段具有神經(jīng)毒性，經(jīng)常會(huì)發(fā)生聚集并發(fā)生多聚化，造成神經(jīng)細(xì)胞上離子通道的阻塞，引起鈣離子動(dòng)態(tài)平衡的破壞、線粒體的氧化應(yīng)激、能量代謝的破壞和糖類代謝調(diào)節(jié)的異常，并最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。當(dāng)前，大量的研究已經(jīng)把焦點(diǎn)放在針對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的治療上，主要是試圖抑制Aβ的產(chǎn)生、減少Aβ的沉積，同時(shí)增加腦組織對(duì)Aβ的清除能力。(1)Aβ免疫治療：1999年，Schenk等研究小組首次用AI3為免疫原，對(duì)具有纖維狀A(yù)β沉積的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫治療，治療后減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)B淀粉樣肽沉積的形成。使用抗Aβ抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫也發(fā)現(xiàn)，抗AB單克隆抗體能夠阻止Aβ的形成，并且能夠降低已經(jīng)形成的B淀粉樣纖維。這一作用可能是通過抗Aβ抗體和老年斑部位的Aβ結(jié)合，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ進(jìn)行清除。

如果能將抗Aβ抗體和雌激素偶聯(lián)，不僅能發(fā)揮兩者的雙重作用，同時(shí)，可以促進(jìn)雌激素的靶向性，降低毒副作用。但是抗Aβ抗體本身的分子量較大，具有抗原性，長期用于人體會(huì)產(chǎn)生中和反應(yīng)，降低藥效。因此，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)，純度較高的小分子Aβ抗體多肽與雌激素偶聯(lián)的結(jié)合物，促進(jìn)雌激素的腦靶向性，提高療效，降低毒副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明提供一種特異性強(qiáng)，純度較高的小分子淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素偶聯(lián)的結(jié)合物，促進(jìn)雌激素的腦靶向性，提高療效，降低毒副作用。

技術(shù)方案

本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種小分子淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物，其特征在于：(1)雌激素溶于100mmol/L NaIO4溶液中，4℃避光反應(yīng)30-60分鐘；(2)加乙二醇，得A液；(3)將A液加入到pH為9.0-10.0的所述淀粉樣蛋白抗體多肽的溶液中，4℃反應(yīng)2小時(shí)；(4)加入50mg/ml NaBO4溶液，4℃反應(yīng)過夜；(5)用含有MgCl2 10mmol/L，2-巰基乙醇10mmol/L、NaCl 100mmol/L的50mmol/L磷酸緩沖液透析，即得。所述的雌激素包括雌二醇和雌三醇；所述的淀粉樣蛋白抗體多肽采用化學(xué)合成法制備；所述偶聯(lián)結(jié)合物，在制備用于治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選為在制備用于治療阿爾茨海默氏癥藥物中的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明的小分子淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物，可用于促進(jìn)雌激素的腦靶向性，提高療效，降低毒副作用。有益效果在于(1)提高雌激素在體內(nèi)腦組織的濃度；同時(shí)降低雌激素在全血，以及心、肝、脾、肺、腎等組織的分布；(2)提高老年癡呆模型動(dòng)物的空間記憶功能；(3)影響老年癡呆模型動(dòng)物的SOD和MDA含量，延緩腦功能衰老；(4)淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物能與海馬區(qū)腦細(xì)胞結(jié)合。

具體實(shí)施方式

多肽由上海生工吉爾合成。

實(shí)施例1

制備淀粉樣蛋白抗體多肽與雌二醇的偶聯(lián)結(jié)合物：100μg雌二醇溶于100mmol/L NaIO4溶液中，4℃避光反應(yīng)30分鐘；加乙二醇，得A液；將A液加入到pH為9.0的淀粉樣蛋白抗體多肽溶液中，4℃反應(yīng)2小時(shí)；加入50mg/ml NaBO4溶液，4℃反應(yīng)過夜；用含有MgCl2 10mmol/L，2-巰基乙醇10mmol/L、NaCl 100mmol/L的50mmol/L磷酸緩沖液透析，凍干，即得。

實(shí)施例2

制備淀粉樣蛋白抗體多肽與雌三醇的偶聯(lián)結(jié)合物：500μg雌二醇溶于100mmol/L NaIO4溶液中，4℃避光反應(yīng)60分鐘；加乙二醇，得A液；將A液加入到pH為9.0的淀粉樣蛋白抗體多肽溶液中，4℃反應(yīng)2小時(shí)；加入50mg/ml NaBO4溶液，4℃反應(yīng)過夜；用含有MgCl2 10mmol/L，2-巰基乙醇10mmol/L、NaCl 100mmol/L的50mmol/L磷酸緩沖液透析，凍干，即得。

實(shí)施例3

淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物對(duì)老年癡呆模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

3個(gè)月齡ICR雌性小鼠，小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。(1)空白組；(2)結(jié)合物低劑量組；(3)結(jié)合物中劑量組；(4)結(jié)合物高劑量組；(5)雌激素陽性組。建立人阿爾茨海默氏癥模型，除空白組，各組小鼠每日頸背部皮下注射無菌D-半乳糖1000mg/Kg，組相應(yīng)劑量的D-半乳糖溶液，0.01ml/g體重?？瞻讓?duì)照組每日注射等量生理鹽水，連續(xù)注射8周。在造模開始的第7天，分別尾靜脈給藥給藥。給藥方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組為結(jié)合物設(shè)3個(gè)劑量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，陽性組為0.2mmol/Kg的雌激素，每天給藥，連續(xù)7周。8周后，最后一次給藥后1小時(shí)，進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)。將事先訓(xùn)練過的實(shí)驗(yàn)組小鼠放入直徑100cm，高50cm，水深30cm的小圓形水池的池壁，池中有站臺(tái)，站臺(tái)直徑8cm，高度在29cm，沒于水下1cm，觀察小鼠從放入池壁到找到平臺(tái)的時(shí)間為潛伏期，記錄潛伏期，并進(jìn)行計(jì)算。

結(jié)果顯示，結(jié)合物在劑量0.05、0.1、0.2mmol/Kg時(shí)可以顯著性減少小鼠找到平臺(tái)的潛伏期，其潛伏期分別為28.3±5.3、18.7±2.9、8.4±1.98秒，與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)。由此可見，結(jié)合物可以提高老年癡呆模型小鼠的空間記憶功能。

實(shí)施例3

淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物對(duì)老年癡呆模型動(dòng)物腦中SOD和MDA含量的影響。

3個(gè)月齡ICR雌性小鼠，小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只。(1)空白組；(2)結(jié)合物低劑量組；(3)結(jié)合物中劑量組；(4)結(jié)合物高劑量組；(5)雌激素陽性組；(6)模型對(duì)照組。建立人阿爾茨海默氏癥模型，除空白組，各組小鼠每日頸背部皮下注射無菌D-半乳糖1000mg/Kg；空白對(duì)照組每日注射等量生理鹽水，連續(xù)注射8周。在造模開始的第7天，分別尾靜脈給藥給藥。給藥方案為：空白組和模型對(duì)照組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組為結(jié)合物設(shè)3個(gè)劑量：0.05、0.1、0.2mmol/Kg，陽性組為0.2mmol/Kg的雌激素，每天給藥，連續(xù)7周。8周后，最后一次給藥后1小時(shí)，取小鼠全腦，勻漿、離心、取上清，采用SOD和MDA試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定腦中SOD和MDA含量。

結(jié)果顯示，結(jié)合物在劑量0.05、0.1、0.2mmol/Kg時(shí)可以顯著性提高老年癡呆模型小鼠腦中SOD含量，同時(shí)降低MDA含量。由此可見，結(jié)合物可以通過影響老年癡呆模型小鼠血清中腦抗氧化因子SOD和氧化物MDA的含量，延緩腦功能減退。

表1 實(shí)施例1結(jié)合物對(duì)老年癡呆模型動(dòng)物腦中SOD和MDA的含量的作用

*P<0.05，**P<0.01與模型組相比。

實(shí)施例4

淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物在小鼠體內(nèi)的分布。

6-8w齡ICR雌性小鼠，小鼠隨機(jī)分成3組，每組6只。(1)空白組；(2)結(jié)合物組；(3)雌激素陽性組。給藥。給藥方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組為0.2mmol/Kg劑量的結(jié)合物，陽性組為0.2mmol/Kg的雌激素，尾靜脈給藥，每天給藥，連續(xù)7天。14天后，將小鼠處死后，分別取全血，以及心、肝、脾、肺、腎、腦等組織。全血肝素抗凝，將肝素抗凝血離心沉淀血細(xì)胞，取上清血漿0.5ml，采用放射免疫試劑盒(購自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)檢測小鼠血漿及各組織中雌激素的濃度。

表2 結(jié)合物在老年癡呆模型動(dòng)物中血漿及組織分布濃度

*P<0.05，**P<0.01與陽性組相比。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，與雌激素陽性組比較，淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素的偶聯(lián)結(jié)合物組體內(nèi)腦組織中的濃度明顯升高(p＜0.05)，而心、肝、脾、肺、腎等組織，以及血漿中的雌激素濃度明顯降低，尤其是血漿中的藥物濃度將為101.43±35.65pg/ml(p＜0.01)，有顯著性差異。

實(shí)施例5

采用免疫組化法評(píng)價(jià)結(jié)合物與神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)合率：

方法：6-8w齡ICR雌性小鼠，將小鼠處死后，取出腦組織，立即放入4％甲醛中固定24-48小時(shí)，脫水、包埋、切片后，將腦組織片貼于載玻片上；將組織片分組，按照空白、濃度梯度0、5、10、20mmol/ml；除空白組，每個(gè)組織片上加入定量的所述實(shí)施例1結(jié)合物，37℃，孵育2小時(shí)時(shí)間后；PBS三次洗板后，再加入偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的抗人IgG抗體，37℃，孵育1小時(shí)；再PBS三次洗板后，加入ABC顯色液，孵育10-20分鐘，最后用蒸餾水終止反應(yīng)；顯微鏡下觀察腦海馬區(qū)，所述實(shí)施例1結(jié)合物與腦組織結(jié)合的細(xì)胞呈棕黑色，為陽性細(xì)胞，采用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算腦海馬區(qū)呈陽性細(xì)胞的數(shù)量。

結(jié)果：實(shí)施例1結(jié)合物與腦海馬區(qū)腦細(xì)胞結(jié)合數(shù)量在結(jié)合物劑量為5、10、20mmol/ml時(shí)，陽性細(xì)胞分別為128.0±35.3、148.7±28.9、238.4±41.0，與空白組相比有顯著性差異(p＜0.05)。由此可見，實(shí)施例1結(jié)合物與腦海馬區(qū)腦細(xì)胞結(jié)合率隨劑量遞增。

SEQUENCE LISTING

<110> 蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司

<120> 一種淀粉樣蛋白抗體多肽與雌激素偶聯(lián)的結(jié)合物

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Ser Ile Gly Gly Ser Leu Asn Trp Tyr

1 5 10 15

His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Ile

20 25