本發(fā)明屬于高分子材料
技術(shù)領(lǐng)域:
,特別涉及一種絲素蛋白/透明質(zhì)酸/海藻酸鈉三維多孔復(fù)合支架及其制備方法。
背景技術(shù):
:皮膚是人體最大的器官,主要分為表皮層、真皮層和皮下組織,對(duì)人體具有重要的屏障、機(jī)械、感知和調(diào)控的功能。但是皮膚是人體最脆弱和最容易受到傷害的器官之一,皮膚潰爛、創(chuàng)傷、手術(shù)損傷和燒傷是皮膚受損的重要原因,其中燒傷是皮膚受損的主要原因。就中國來說,每年燒傷的病人在1000萬以上,其中因?yàn)閲?yán)重?zé)齻枰つw移植的患者達(dá)到300萬以上。但是由于自體皮的來源有限,遇到大面積皮膚嚴(yán)重缺損時(shí)會(huì)存在可供皮不足,極大的限制了其在皮膚修復(fù)中的廣泛應(yīng)用。人工皮膚作為自體皮膚的替代物,在皮膚創(chuàng)面修復(fù)中扮演著越來越重要的角色。在自體皮膚供應(yīng)不足的情況下,皮膚大面積損傷者受益。近年來隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,研究者已經(jīng)通過組織工程支架,生長(zhǎng)因子,種子細(xì)胞以及基因治療等方法開發(fā)出多種組織工程支架的人工皮膚替代物。絲素蛋白(Silkfibroin,SF)是一種疏水性的蛋白質(zhì),力學(xué)性能優(yōu)異,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,具有良好的生物相容性,而且來源豐富,成本低廉,是一種優(yōu)良的天然的高分子材料?;诮z素蛋白這些優(yōu)點(diǎn),其一直廣泛運(yùn)用在組織工程領(lǐng)域上,如軟骨修復(fù)、網(wǎng)狀結(jié)締組織修復(fù)、骨修復(fù)和神經(jīng)修復(fù)等方面。有研究表明,用絲素蛋白能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,分化,對(duì)皮膚傷口愈合有促進(jìn)作用,所以絲素蛋白能夠作為皮膚敷料使用。透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid,HA)是一種獨(dú)特的線性大分子粘多糖,是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,透明質(zhì)酸不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附與增殖,而且在生物性修復(fù)術(shù)中,透明質(zhì)酸可隔離組織表面,作為一種機(jī)械保護(hù)劑,在手術(shù)后可防止粘連及纖維性組織形成。高濃度、高分子量的透明質(zhì)酸不但能抑制出血,減少能形成永久粘連骨架的血塊數(shù)量,而且能抑制成纖維細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和活性。透明質(zhì)酸芐酯的微孔膜已被研究證明是培養(yǎng)和輸送活性角質(zhì)化細(xì)胞進(jìn)行燒傷、慢性潰瘍治療的一種優(yōu)良的材料。海藻酸鈉(sodiumalginate,Alg)是從天然褐藻中提取的一種聚陰離子多糖,由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸連結(jié)而成,具有良好的生物相容性且能在二價(jià)離子如Ca2+等的作用下形成凝膠,廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。目前利用絲素蛋白作為三維支架用作皮膚敷料已經(jīng)成為熱點(diǎn),透明質(zhì)酸和海藻酸鈉各自優(yōu)點(diǎn)在支架上的應(yīng)用也層出不窮,如今絲素蛋白透明質(zhì)酸海藻酸鈉多者混合的很多性能有待研究,比如吸水性、在生物環(huán)境下的降解特性、血液相容性等等。多者混合比率不恰當(dāng)或者混合條件不合適會(huì)影響支架的成孔率以及孔徑大小,不利于細(xì)胞的粘附增值,進(jìn)而也會(huì)影響支架的應(yīng)用性能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:基于此,為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,本發(fā)明利用絲素蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉三者在皮膚修復(fù)中各自優(yōu)點(diǎn),提供了一種三維多孔復(fù)合支架及其制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:一種三維多孔復(fù)合支架,所述復(fù)合支架是以2~10wt%絲素蛋白溶液、透明質(zhì)酸和海藻酸鈉為原料制備而得的,其中,透明質(zhì)酸與絲素蛋白溶液的比為:0.1g:5~30ml,2~10wt%絲素蛋白溶液和透明質(zhì)酸混合溶液與海藻酸鈉的比為:15~25ml:0.1g。在其中一些實(shí)施例中,所述絲素蛋白溶液的濃度為3.5wt%,所述透明質(zhì)酸與絲素蛋白溶液的比為:0.1g:20ml。在其中一些實(shí)施例中,絲素蛋白溶液和透明質(zhì)酸混合溶液與海藻酸鈉的比為:21ml:0.1g。本發(fā)明還提供了上述三維多孔復(fù)合支架的制備方法,包括以下步驟:(1)、將2~10wt%的絲素蛋白溶液加入到透明質(zhì)酸溶液中,室溫?cái)嚢?5~35min,再加入0.05~0.5gEDC/NHS攪拌30~45min;其中,每0.1g透明質(zhì)酸中加入5~30ml絲素蛋白溶液;(2)、將0.05~0.2g海藻酸鈉溶于10~24ml去離子水中,再與步驟(1)得到的溶液混合均勻,注入孔板形成凝膠,冷藏形成冰晶狀固體,凍干,即得;其中,每0.1g海藻酸鈉加入15~25ml步驟(1)的溶液。在其中一些實(shí)施例中,步驟(1)中所述絲素蛋白的制備方法為:取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)煮一遍取出,洗干凈置于烘箱中烘干。在其中一些實(shí)施例中,所述蠶繭為去蛹的蠶繭。在其中一些實(shí)施例中,步驟(1)中所述絲素蛋白溶液的制備方法為:稱量2~4g絲素蛋白置于圓底燒瓶中,加入9.8mol/L的溴化鋰溶液,40~60℃水浴加熱溶解3~5小時(shí),取出絲素蛋白混合液置于透析袋中透析3~5天,每天更換1~3次去離子水,將完成透析的溶液離心8~15分鐘,最后取出離心管,上層清液即為絲素蛋白溶液。在其中一些實(shí)施例中,所述透析袋的截留分子量為8-14kD。在其中一些實(shí)施例中,所述離心條件為25℃,5000r/min,10~15min。在其中一些實(shí)施例中,步驟(2)中所述冷藏結(jié)晶溫度為-80℃。在其中一些實(shí)施例中,步驟(2)中所述凍干條件為-60℃,48h。本發(fā)明還提供了上述三維多孔復(fù)合支架在皮膚修復(fù)方面的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下有益效果:1、本發(fā)明的三維多孔復(fù)合支架孔徑均勻,成孔率高,血液相容性好,不僅有利于成纖維細(xì)胞的粘附與增值,還具有較好的親水性等等,克服了現(xiàn)有支架材料因?yàn)槎嗾邚?fù)合制備方法不當(dāng)使得支架孔徑率大大降低,不易降解,并且嚴(yán)重影響組織局部環(huán)境進(jìn)而對(duì)皮膚造成傷害等等諸多問題。本發(fā)明多種物質(zhì)復(fù)合,保持了原物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn),解決了原有材料性能的不足,能夠降低受傷皮膚感染以及促進(jìn)皮膚的修復(fù),加快傷口愈合;2、本發(fā)明的三維多孔復(fù)合支架的制備方法簡(jiǎn)單,成本低,生產(chǎn)效率高,適合工業(yè)化大生產(chǎn)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的外觀圖;圖2為實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架在掃描電子顯微鏡下的結(jié)構(gòu)圖,由圖可知孔徑均勻,平均孔徑為30-120μm,測(cè)出的孔隙率約為76%;圖3為實(shí)施例1,對(duì)比實(shí)施例1,2,3的多孔支架的FT-IR圖,圖中可知實(shí)施例1復(fù)合支架為物理混合,包含單體物質(zhì)的性能;圖4為實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的降解圖,pH保持穩(wěn)定變化,不改變環(huán)境pH;圖5為實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的降解圖,a折線顯示緩沖液下基本不降解,b折線顯示酶下緩慢降解;圖6為實(shí)施例1,對(duì)比實(shí)施例1,2,3的多孔支架的質(zhì)量分析圖;圖7為實(shí)施例1,對(duì)比實(shí)施例1,2,3的多孔支架的溶血率圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步敘述本發(fā)明,本發(fā)明未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。下面給出本發(fā)明的具體實(shí)施例,但實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步詳細(xì)敘述本說明,并不限制本發(fā)明的權(quán)利要求。以下實(shí)施例中所使用的原料都來源于市售。實(shí)施例1三維多孔復(fù)合支架及其制備方法本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架的制備方法包括如下步驟:(1)、取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)上述步驟,置于烘箱中烘干,獲得絲素蛋白待用;(2)、取2.5g絲素蛋白加入25ml9.8mol/L的溴化鋰溶液,60℃下水浴加熱5h后,用透析袋透析(透析袋的截留分子量為8kD透析3天,每天換3次水),然后于25℃,5000r/min下離心10分鐘,得到3.5wt%的絲素蛋白溶液;(3)、稱取0.1g透明質(zhì)酸溶于1ml去離子水中,震蕩搖勻半小時(shí)左右,待形成均勻溶液后加入20ml步驟(2)的絲素蛋白溶液,常溫下攪拌1小時(shí)左右,然后加入0.1gEDC/NHS再攪拌2~3小時(shí),攪拌速度為300~400r/min;(4)、稱取0.1g海藻酸鈉室溫下加入至12ml去離子水中,攪拌溶解,再將溶液加入步驟(3)的溶液中混合均勻,然后將溶液注入孔板中,保鮮膜封口,并扎適量小孔,將孔板于37℃環(huán)境下勻低速震蕩直至形成凝膠液。再將凝膠液置于-80℃下冷藏形成冰晶狀固體,最后取出置于凍干機(jī)中-60℃凍干2天取出,即得本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架。圖1為本實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的外觀圖;圖2為三維多孔復(fù)合支架在掃描電子顯微鏡下的結(jié)構(gòu)圖,由圖可知本實(shí)施例得到的三維多孔復(fù)合支架孔徑均勻,平均孔徑為30-120μm,測(cè)出的孔隙率約為76%;圖4、5為本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架的降解圖,從圖中可知,pH保持穩(wěn)定變化,不改變環(huán)境pH,在緩沖液下三維多孔復(fù)合支架基本不降解,在酶下三維多孔復(fù)合支架緩慢降解。表1為實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的吸水率。結(jié)果顯示支架的吸水率達(dá)到質(zhì)量比約為42倍的比率,效果明顯。表1實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的吸水率V0Dryweight±SD(mg)V±SD(ml)R±SD1035.74±6.348.5±0.2341.97±0.86實(shí)施例2三維多孔復(fù)合支架及其制備方法本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架的制備方法包括如下步驟:(1)、取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)上述步驟,置于烘箱中烘干,獲得絲素蛋白待用;(2)、取1g絲素蛋白加入25ml9.8mol/L的溴化鋰溶液,60℃下水浴加熱3h后,用透析袋透析(透析袋的截留分子量為10kD)透析3天,每天換3次水,然后于25℃,5000r/min下離心10分鐘,得到2wt%的絲素蛋白溶液;(3)、稱取0.1g透明質(zhì)酸溶于1ml去離子水中,震蕩搖勻半小時(shí)左右,待形成均勻溶液后加入20ml步驟(2)的絲素蛋白溶液,常溫下攪拌1小時(shí)左右,然后加入0.1gEDC/NHS再攪拌2~3小時(shí),攪拌速度為300~400r/min;(4)、稱取0.1g海藻酸鈉室溫下加入至12ml去離子水中,攪拌溶解,再將溶液加入步驟(3)的溶液中混合均勻,然后將溶液注入孔板中,保鮮膜封口,并扎適量小孔,將孔板于37℃環(huán)境下勻低速震蕩直至形成凝膠液。再將凝膠液置于-80℃下冷藏形成冰晶狀固體,最后取出置于凍干機(jī)中-60℃凍干2天取出,即得本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架。該實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架的性能與實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的性能相似。實(shí)施例3三維多孔復(fù)合支架及其制備方法本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架的制備方法包括如下步驟:(1)、取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)上述步驟,置于烘箱中烘干,獲得絲素蛋白待用;(2)、取7.5g絲素蛋白加入25ml9.8mol/L的溴化鋰溶液,60℃下水浴加熱3h后,用透析袋透析(透析袋的截留分子量為12kD)透析3天,每天換3次水,然后于25℃,5000r/min下離心10分鐘,得到10wt%的絲素蛋白溶液;(3)、稱取0.1g透明質(zhì)酸溶于1ml去離子水中,震蕩搖勻半小時(shí)左右,待形成均勻溶液后加入20ml步驟(2)的絲素蛋白溶液,常溫下攪拌1小時(shí)左右,然后加入0.1gEDC/NHS再攪拌2~3小時(shí),攪拌速度為300~400r/min;(4)、稱取0.1g海藻酸鈉室溫下加入至12ml去離子水中,攪拌溶解,再將溶液加入步驟(3)的溶液中混合均勻,然后將溶液注入孔板中,保鮮膜封口,并扎適量小孔,將孔板于37℃環(huán)境下勻低速震蕩直至形成凝膠液。再將凝膠液置于-80℃下冷藏形成冰晶狀固體,最后取出置于凍干機(jī)中-60℃凍干2天取出,即得本實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架。該實(shí)施例的三維多孔復(fù)合支架的性能與實(shí)施例1的三維多孔復(fù)合支架的性能相似。對(duì)比例1多孔絲素蛋白支架及其制備方法本對(duì)比例的多孔絲素蛋白支架的制備方法包括如下步驟:(1)、取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)上述步驟,置于烘箱中烘干,獲得絲素蛋白待用;(2)、取2.5g絲素蛋白加入25ml9.8mol/L的溴化鋰溶液,60℃下水浴加熱5h后,用透析袋透析(透析袋的截留分子量為8kD)透析3天,每天換3次水,然后于25℃,5000r/min下離心10分鐘,得到3.5wt%的絲素蛋白溶液;(3)、取3.5wt%的絲素蛋白溶液-60℃下凍干2天得到絲素蛋白支架。對(duì)比例2多孔絲素蛋白/透明質(zhì)酸支架及其制備方法本對(duì)比例的多孔絲素蛋白/透明質(zhì)酸支架的制備方法包括如下步驟:(1)、取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)上述步驟,置于烘箱中烘干,獲得絲素蛋白待用;(2)、取2.5g絲素蛋白加入25ml9.8mol/L的溴化鋰溶液,60℃下水浴加熱5h后,用透析袋透析(透析袋的截留分子量為8kD)透析3天,每天換3次水,然后于25℃,5000r/min下離心10分鐘,得到3.5wt%的絲素蛋白溶液;(3)、稱取0.1g透明質(zhì)酸溶于1ml去離子水中,震蕩搖勻半小時(shí)左右,待形成均勻溶液后加入20ml步驟(2)的絲素蛋白溶液,常溫下攪拌1小時(shí)左右,然后加入0.1gEDC/NHS再攪拌2~3小時(shí),攪拌速度為300~400r/min;(4)、取上述絲素蛋白/透明質(zhì)酸混合液于-60℃下凍干2天得到絲素蛋白/透明質(zhì)酸混合支架。對(duì)比例3多孔絲素蛋白/海藻酸鈉支架及其制備方法本對(duì)比例的多孔絲素蛋白/海藻酸鈉支架的制備方法包括如下步驟:(1)、取8g蠶繭置于大燒杯中,加入400ml去離子水,同時(shí)加入2g無水碳酸鈉,煮沸半小時(shí)取出,用去離子水清洗幾遍至中性,再重復(fù)上述步驟,置于烘箱中烘干,獲得絲素蛋白待用;(2)、取2.5g絲素蛋白加入25ml9.8mol/L的溴化鋰溶液,60℃下水浴加熱5h后,用透析袋透析(透析袋的截留分子量為8kD)透析3天,每天換3次水,然后于25℃,5000r/min下離心10分鐘,得到3.5wt%的絲素蛋白溶液;(3)、稱取0.1g海藻酸鈉室溫下加入至12ml去離子水中,攪拌溶解,再將溶液加入步驟(3)的溶液中混合均勻;(4)、取上述絲素蛋白/海藻酸鈉混合液于-60℃下凍干2天得到絲素蛋白/海藻酸鈉混合支架。在獲取實(shí)施例1和對(duì)比例1~3材料的情況下為比較之間的特征做如下分析實(shí)驗(yàn):(1)、取適量KBr干燥磨細(xì)后壓片放入傅里葉紅外光譜儀中測(cè)定。光譜掃描范圍為500-4000cm-1,分辨率為4cm-1,KBr光譜作為背景對(duì)比圖,將實(shí)施例1及對(duì)比例1~3和分別和KBr大約以1:100的量混合研磨干燥壓片后放入傅里葉紅外光譜儀中測(cè)定,獲得紅外光譜,如圖3所示,由圖3可知實(shí)施例1及對(duì)比例1~3樣品的吸收峰基本相似,主要吸收峰在1667cm-1(酰胺Ⅰ),1532cm-1(酰胺Ⅱ),1244cm-1(酰胺Ⅲ)678cm-1(酰胺Ⅴ),這些特征峰主要和絲素蛋白的無規(guī)卷曲或者α-螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān),說明了透明質(zhì)酸海藻酸鈉的加入并沒有改變絲素蛋白的結(jié)構(gòu)性能。(2)、分別稱取干燥的約10mg的上述實(shí)施例1及對(duì)比例1~3樣品支架,裝入一個(gè)干凈的小鋁箔鍋里,在儀器中充滿N2的環(huán)境下,從室溫一直加熱到700℃,升溫速率為10℃/min。熱重分析儀開始收集數(shù)據(jù),進(jìn)而得到熱重分析圖譜,如圖6所示,由圖6可以看出0℃到250℃時(shí),每種支架的重量都有所減少,而SF/HA/Alg支架的減少速度適中,這一階段主要是支架表面吸附水的損失。而在約250℃到325℃這個(gè)區(qū)間曲線突然變得很陡,可以看出樣品的質(zhì)量開始大幅度分解,而溫度在大于400℃后樣品的質(zhì)量減少變得越來越緩慢,逐漸減少到0,而SF/HA/Alg復(fù)合物的減緩速度一直處于適中狀態(tài),結(jié)合上述FT-IR圖可知,復(fù)合屬于物理結(jié)合,沒有改變重要基團(tuán)的結(jié)構(gòu),復(fù)合物質(zhì)具有單獨(dú)物質(zhì)的特性。并且質(zhì)量損失不快不慢,說明實(shí)施例1樣品混合較均勻,且該支架熱性能更趨穩(wěn)定變化。(3)、將收集洗凈的紅細(xì)胞懸浮于適量PBS中,配成紅細(xì)胞的體積占總體積16%的紅細(xì)胞懸浮液。分別取適量實(shí)施例1及對(duì)比例1~3支架樣品,用PBS(PH=7.4)緩沖液浸泡24小時(shí),取出浸透液分別編號(hào),PBS和去離子水分別作為陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組,取上述各樣品1ml于離心管中,并加入50μL紅細(xì)胞懸液,實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn),37℃下孵化0h,0.5h,1h,1,5h,2h,然后取出1000×g離心2~3min,移取上清液于96孔板中,通過酶標(biāo)儀測(cè)量540nm處吸光度,實(shí)驗(yàn)平行做3次。紅細(xì)胞的溶血率如下計(jì)算:溶血率(%)=[(A-A0)/(A1-A0)]*100A------實(shí)驗(yàn)組吸光值;A0------陰性對(duì)照組吸光值;A1------陽性對(duì)照組吸光值。計(jì)算繪圖獲得溶血率,如圖7所示。從圖7溶血率圖可知實(shí)施例1的溶血率始終保持在5%以下,且在不同時(shí)間段都保持穩(wěn)定值,較其他對(duì)比例更優(yōu)。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合,為使描述簡(jiǎn)潔,未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述,然而,只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾,都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式,其描述較為具體和詳細(xì),但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是,對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干變形和改進(jìn),這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此,本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3