本發(fā)明涉及一種含活細(xì)胞的3D組織工程產(chǎn)品的產(chǎn)品及制作方法。
背景技術(shù)：
：體外構(gòu)建3D組織工程產(chǎn)品在醫(yī)學(xué)生物學(xué)基礎(chǔ)研究，體外藥物篩選評(píng)價(jià)及組織再生方面具有廣闊的應(yīng)用前景。包括3D打印等多種技術(shù)是構(gòu)建3D組織工程產(chǎn)品的重要工藝。構(gòu)建含活細(xì)胞的3D組織工程產(chǎn)品要求支架材料的生物相容性好，能支持細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)需要一種簡(jiǎn)便易行的加工工藝，能夠?qū)崿F(xiàn)支架材料從液態(tài)向固態(tài)的相變，將細(xì)胞固定在支架材料中并形成具有一定3D結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品。常用的支架材料包括合成材料和天然來源的細(xì)胞外基質(zhì)材料，細(xì)胞外基質(zhì)材料以膠原蛋白為代表，但其在形成3D組織工程產(chǎn)品時(shí)常需要對(duì)膠原分子進(jìn)行改性加入特殊基團(tuán)，同時(shí)添加化學(xué)交聯(lián)劑幫助實(shí)現(xiàn)膠原溶液的相變。這一過程工藝復(fù)雜，改性和交聯(lián)過程殘存的化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞不利。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決以上問題，本發(fā)明開發(fā)了一種簡(jiǎn)便有效的含活細(xì)胞的3D組織工程產(chǎn)品及其制作方法。一種3D組織材料，以豬小腸粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)(smallintestinalsubmucosa，SIS)作為支架材料，含有細(xì)胞、核黃素或其衍生物。本發(fā)明以具有豬小腸粘膜基質(zhì)為原材料，以核黃素或其衍生物為交聯(lián)劑，通過可見光交聯(lián)誘發(fā)，增強(qiáng)分散度很高的基團(tuán)間鍵能，有效的將溶液相變?yōu)楣腆w凝膠，并保持良好組織相容性和生物活性。本發(fā)明可在創(chuàng)面原位成膠無任何創(chuàng)傷，原位形成具活性的細(xì)胞的凝膠進(jìn)行組織再生修復(fù)；同時(shí)能保留SIS中的多種細(xì)胞因子，并具有生物活性，有利于組織重塑和傷口修復(fù)。上述3D組織材料，核黃素：豬小腸粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量百分比優(yōu)選為1-4∶10-40。上述3D組織材料的制備方法，將細(xì)胞和核黃素加入豬小腸粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)，白熾燈照射3-5min。上述3D組織材料的制備方法，包括豬小腸粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備、加入核黃素和細(xì)胞、光照射、體外培養(yǎng)。上述3D組織材料的制備方法，包括以下步驟：1、SIS原料的準(zhǔn)備(1)取新鮮豬小腸，通過機(jī)械方法將小腸的漿膜層和肌層去除，生理鹽水反復(fù)沖洗干凈；(2)用甲醇和氯仿(1∶1，V/V)脫脂溶液浸泡攪拌12～24h(優(yōu)選為12h，重復(fù)2遍)，并用去離子水漂洗3～5次除去有機(jī)溶劑；(3)將SIS浸泡在0.05％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，室溫下振蕩消化12小時(shí)，生理鹽水溶液反復(fù)洗滌去除胰蛋白酶；(4)將SIS置于0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)生理鹽水中搖晃振蕩4小時(shí)，并用生理鹽水溶液徹底沖洗以除去洗滌劑；(5)將SIS浸于0.5％醋酸溶液中過夜，用打漿機(jī)粉碎(加入冷的醋酸溶液，防止溫度升高)，加胃蛋白酶(質(zhì)量比：酶/膜＝1/100)室溫下酶解2天后雙層紗布過濾。(6)濾液用2摩爾的氯化鈉溶液鹽析24h，7800轉(zhuǎn)/分離心1h，取沉淀。將沉淀用10倍體積的0.5％醋酸完全溶解，繼續(xù)用2摩爾氯化鈉溶液鹽析24h，7800轉(zhuǎn)/分離心1h，取沉淀；(7)將沉淀溶于0.1％醋酸，裝在8000道爾頓透析袋中，置于0.1％醋酸溶液的大燒杯里透析24h，每4-6h換液1次；(8)透析后sis溶液置于培養(yǎng)皿中-20℃冷凍后，用冷凍干燥機(jī)在-40℃條件下冷凍干燥48小時(shí)，打粉機(jī)粉碎后得到SIS粉末；2、3D組織工程材料的制備(1)將0.5％-2％SIS粉末溶解于0.01M鹽酸或醋酸，徹底溶解后與1/10體積的0.1MNaOH混合，調(diào)pH值至中性；(2)配制100mg/ml的核黃素原液；(3)將核黃素與中性SIS溶液混合均勻，核黃素終濃度為0.05％-0.2％；(4)將細(xì)胞與第(3)步中的溶液混合，細(xì)胞終濃度為100000個(gè)/ml；(5)將混合的溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白熾燈泡距離96孔板或模具10-30cm處照射3-5min，溶液即發(fā)生相變，形成凝膠；3、體外培養(yǎng)將3D組織凝膠放入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5％CO2、37℃進(jìn)行培養(yǎng)。有益效果(1)本發(fā)明以豬小腸粘膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分，所制得的3D組織材料所含化學(xué)成分與人細(xì)胞外基質(zhì)成分高度接近，含有豐富的生長(zhǎng)因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持細(xì)胞的生長(zhǎng)。(2)本發(fā)明制作工藝簡(jiǎn)單，除原材料外，僅需白熾燈作為生產(chǎn)設(shè)備，不需要復(fù)雜的設(shè)備，整個(gè)操作過程不含有對(duì)細(xì)胞有害的成分，不造成環(huán)境污染。(3)本發(fā)明可用作細(xì)胞治療的載體，原位形成帶細(xì)胞的凝膠進(jìn)行組織再生修復(fù)。本發(fā)明還可用與3D打印相結(jié)合，制備不同形狀和含不同類型細(xì)胞及不同結(jié)構(gòu)的復(fù)雜3D組織工程產(chǎn)品。除制作3D組織工程產(chǎn)品外，還可用于雜交瘤細(xì)胞的體外半固體篩選。附圖說明圖13D組織凝膠；圖23D組織工程材料中細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況；A-體外培養(yǎng)1天后細(xì)胞存活情況，B-體外培養(yǎng)3天后細(xì)胞存活情況。圖33D組織凝膠用于動(dòng)物創(chuàng)傷原位修復(fù)；左側(cè)為對(duì)照組，右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。實(shí)施例1含細(xì)胞的3D組織工程產(chǎn)品的快速構(gòu)建，包括以下步驟：1、SIS原料的準(zhǔn)備(1)取新鮮豬小腸，通過機(jī)械方法將小腸的漿膜層和肌層去除，生理鹽水反復(fù)沖洗干凈。(2)用甲醇和氯仿(1∶1，V/V)脫脂溶液浸泡攪拌12～24h(優(yōu)選為12h，重復(fù)2遍)，并用去離子水漂洗3～5次除去有機(jī)溶劑。(3)將SIS浸泡在0.05％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，室溫下振蕩消化12小時(shí)，生理鹽水溶液反復(fù)洗滌去除胰蛋白酶。(4)將SIS置于0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)生理鹽水中搖晃振蕩4小時(shí)，并用生理鹽水溶液徹底沖洗以除去洗滌劑。(5)將SIS浸于0.5％醋酸溶液中過夜，用打漿機(jī)粉碎(加入冷的醋酸溶液，防止溫度升高)，加胃蛋白酶(質(zhì)量比：酶/膜＝1/100)室溫下酶解2天后雙層紗布過濾。(6)濾液用2摩爾的氯化鈉溶液鹽析24h，7800轉(zhuǎn)/分離心1h，取沉淀。將沉淀用10倍體積的0.5％醋酸完全溶解，繼續(xù)用2摩爾氯化鈉溶液鹽析24h，7800轉(zhuǎn)/分離心1h，取沉淀。(7)將沉淀溶于0.1％醋酸，裝在8000道爾頓透析袋中，置于0.1％醋酸溶液的大燒杯里透析24h，每4-6h換液1次。(8)透析后sis溶液置于培養(yǎng)皿中-20℃冷凍后，用冷凍干燥機(jī)在-40℃條件下冷凍干燥48小時(shí)，打粉機(jī)粉碎后得到SIS粉末。2、含細(xì)胞3D組織工程產(chǎn)品制作(1)將0.5％-2％的豬小腸粘膜基質(zhì)(SIS)溶解于0.01M鹽酸或醋酸，徹底溶解后與1/10體積的0.1MNaOH混合，調(diào)pH值至中性。(2)配制100mg/ml的核黃素(維生素B2)原液備用。(3)將核黃素與中性SIS混合均勻，核黃素終濃度為0.05％-0.2％。(4)將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與第(3)步中的溶液混合，細(xì)胞終濃度為100000個(gè)/ml。(5)將混合的溶液滴入96孔板或其他模具(如動(dòng)物創(chuàng)傷處)中，用200W的白熾燈泡距離96孔板或模具10-30cm處照射3-5min，溶液即發(fā)生相變，形成凝膠，其形態(tài)如圖1所示。3、含細(xì)胞3D組織工程體外培養(yǎng)將3D組織凝膠放入DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)，5％CO2，37℃進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1天和3天后進(jìn)行活死細(xì)胞染色，評(píng)價(jià)3D組織工程產(chǎn)品中的細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況，1天和3天培養(yǎng)后的細(xì)胞存活的染色(活-死細(xì)胞染色試劑盒，Invitrogen)情況如圖2所示，結(jié)果表明本方法構(gòu)建的含細(xì)胞3D組織工程產(chǎn)品生物相容性好，其中包含的細(xì)胞生長(zhǎng)良好。圖2-A中，培養(yǎng)1天后活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色。在圖中可以看到，細(xì)胞成功的長(zhǎng)在水凝膠內(nèi)，并且沒有任何死細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。這證明光引發(fā)的SIS水凝膠對(duì)細(xì)胞無任何毒副作用，有良好的細(xì)胞相容性。圖2-B中，培養(yǎng)3天后，與培養(yǎng)一天的照片相比，細(xì)胞數(shù)量增多，這說明細(xì)胞已經(jīng)開始繁衍，而且擴(kuò)散均勻，并無任何死細(xì)胞。這表現(xiàn)SIS光引發(fā)的水凝膠不僅生物相容性良好，并且能促進(jìn)和支撐細(xì)胞生殖繁衍，能夠錨定細(xì)胞，是良好的生物材料支架。4.含細(xì)胞3D組織材料中的細(xì)胞因子檢測(cè)采用ELISA分別檢測(cè)原材料豬小腸粘膜基質(zhì)SIS以及3D組織材料中細(xì)胞因子VEGF，b-FGF，TGF-b，andTNF-a含量如表1所示。表1VEGFb-FGFTGF-bTNF-a豬小腸粘膜基質(zhì)SIS50.68ng/mg6.18pg/ml7.23pg/ml5.03mg/ml光敏凝膠43.12ng/mg5.17pg/mg6.03pg/mg1.38mg/mg5.植入動(dòng)物體后原位修復(fù)實(shí)驗(yàn)將含細(xì)胞的3D組織工程產(chǎn)品植入小鼠，包括以下步驟：(1)小鼠麻醉，背部脫毛，用punch在小鼠背部制作一個(gè)直徑6mm的皮膚缺損；(2)將本實(shí)施例步驟2(4)制得的混合溶液0.1ml滴在小鼠皮膚缺損處，用200w白熾燈距創(chuàng)面20cm處照射6min，即可成膠，結(jié)果如圖3所示，左側(cè)為未做任何處理的創(chuàng)傷對(duì)照組，右側(cè)為創(chuàng)面直接成膠的實(shí)驗(yàn)組。實(shí)施例2用于雜交瘤細(xì)胞的半固體篩選(1)配置1％濃度的SIS中性溶液，加入終濃度為0.1％核黃素混合均勻。(2)配制2XRPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(其中含胎牛血清20％，丙酮酸鈉0.22g/L，L-谷氨酰胺0.15％，青霉素200IU/mL，鏈霉素200ug/mL，2XHAT)。(3)將(1)和(2)等體積混合均勻。(4)將常規(guī)融合后的雜交瘤細(xì)胞用(3)中的溶液重懸，混勻。(5)將上述細(xì)胞懸液3mL放入六孔板中，用200W的白熾燈泡距離96孔板或模具10-30cm處照射3-5min，溶液即發(fā)生相變，形成凝膠。(6)37℃、5％CO2培養(yǎng)7-10天后，肉眼可見培養(yǎng)基內(nèi)形成白色斑點(diǎn)，每個(gè)斑點(diǎn)即為雜交瘤細(xì)胞克隆。當(dāng)前第1頁1 2 3