本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程技術領域，具體地說，是利用大孔徑平行聚己內酯電紡棉構建自體組織工程血管。

背景技術：

現有的幾種血管移植替代物尚存在不具有生長性、或異體組織易導致免疫排斥反應等缺陷。因此，構建具備生長性，且有自體組織或細胞的新型組織工程血管具有重要意義。

一般地，構建組織工程血管首先需要解決三個問題：(1)組織支架，(2)種子細胞來源和(3)組織構建方法?！敖M織支架”是細胞賴以粘附和生長的環(huán)境。由于人工構建的組織在形成初期尚缺乏植入細胞分泌的細胞外基質，因此需要人為地為細胞提供附著的支架；從另一方面講，組織支架還決定了所構建組織的最終形態(tài)、種子細胞的選擇及定植方法，因此，制備出合適的組織支架是組織工程血管構建成功的關鍵。

在各種組織工程血管支架制備方法中，較普遍采用的是利用靜電紡技術制備出的纖維支架。將親細胞、可生物降解的高分子聚合材料，如聚己內酯(PCL)，聚乳酸(PLA)等配制成一定濃度的溶液，裝入連接有微泵的注射器。從注射器針頭擠出的聚合物溶液在電場力的作用下會拉成細絲，并以一定的方式聚集于接收裝置，最終得到靜電紡纖維支架。

之前，發(fā)明人已就靜電紡纖維膜在構建組織工程血管中的應用進行了探索，并建立了一種組織工程血管構建方法：即以平滑肌，一種廣泛存在于大中血管中膜層的細胞作為種子細胞；將平滑肌細胞在體外預先種植在納米纖維電紡膜上，待細胞在其表面粘附生長后，卷曲纏繞于圓柱管，再移植到動物皮下形成血管狀組織。由于該方法類似“三明治”的制作過程，因此也被稱為“三明治夾心法”。

之所以采用這種“種子細胞體外種植-卷曲包裹-皮下移植”的構建方式的原因是，我們先前研制出的納米級靜電紡纖維直徑細小、纖維之間排列致密緊實，因此直接皮下移植或血管原位移植后自體細胞難以長入電紡膜內部并實現電紡膜的組織化——這與Gore-Tex管道或牛頸靜脈管道移植后的結果無太大差別。然而，這還帶來了另外的問題：(1)種子細胞體外分離、培養(yǎng)擴增的過程復雜，極易發(fā)生細胞污染、老化；(2)結合“三明治法”將載有種子細胞電紡膜卷曲移植后，種子細胞首先需要克服皮下營養(yǎng)不足的環(huán)境，這帶來了構建成功率低的問題；(3)體外種植細胞還容易發(fā)生細胞流失。因此，利用上述“三明治法”較難構建出滿意的組織工程血管。圖1展示了一例“三明治法”組織工程血管構建失敗的案例，可見分層的、未組織化的材料。因此，需要從根本上改進靜電紡支架的性質。

本發(fā)明希望解決傳統方法紡出的靜電紡納米纖維膜細密緊實，細胞不易長入的問題。以PCL為基本原料的大孔徑、粗纖維PCL電紡棉及其在自體組織工程血管中的應用目前還未見報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對現有靜電紡纖維膜(即傳統“電紡膜”)技術中的不足，提供一種電紡棉。

本發(fā)明的再一的目的是，提供一種電紡棉的應用。

本發(fā)明的另一的目的是，提供一種組織工程支架的應用。

為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：一種用于制備組織工程血管的電紡棉，所述的電紡棉為聚己內酯電紡棉。

所述的電紡棉為大孔徑平行聚己內酯電紡棉，電紡棉的孔徑為20μm～100μm。

所述的電紡棉為30～40％的聚己內酯的三氟乙醇溶液通過靜電紡絲獲得的電紡棉。

所述的電紡棉通過如下方法制得：配置質量體積比為35％的聚己內酯的三氟乙醇溶液，然后以鏤空的滾筒為收集裝置進行靜電紡絲，在短距離接收條件下獲得電紡棉。

為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：所述的電紡棉在制備組織工程血管的支架的應用。

一種組織工程血管支架，所述的組織工程血管支架為利用電紡棉構建的管狀支架。

所述的電紡棉為大孔徑平行聚己內酯電紡棉。

所述的組織工程血管支架的制備方法為：以圓柱體為內支撐，將大孔徑聚己內酯電紡棉沿同一方向包繞于圓柱體表面，制成組織工程血管支架。

所述的組織工程血管支架的制備方法為：配置質量體積比為35％的聚己內酯的三氟乙醇溶液，然后以鏤空四骨架滾筒為收集裝置進行靜電紡絲獲得電紡棉，以橡膠圓柱管為內支撐將電紡棉沿同一方向包繞于橡膠圓柱管表面，制成組織工程血管支架。

為實現上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：所述的組織工程血管支架在制備組織工程血管中的應用。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、大孔徑聚己內酯電紡棉具有良好的力學性能和細胞相容性，且有利于細胞快速長入。

2、最終得到的組織工程血管組織細胞和細胞外基質來源于自體，不產生免疫排斥反應。

3、平行排列的聚己內酯電紡棉纖維引導細胞和細胞外基質定向環(huán)形排列，能模擬天然血管的組織學構造。

附圖說明

附圖1：以傳統電紡膜為支架材料，通過“三明治”法構建組織工程血管。利用明膠/PCL(50:50,m/m)納米纖維電紡膜作為血管支架，以骨髓間充質干細胞為種子細胞，在體外將骨髓間充質干細胞種植于電紡膜，并卷曲纏繞于圓柱管上(“三明治法”)，再移植到裸鼠皮下構建組織工程血管。移植9個月后取材依然可見層疊的明膠/PCL電紡膜(B)，表明電紡膜未降解、組織形成差。組織切片HE染色(A，C和D)可見6層電紡膜相互分離，中間幾乎沒有細胞長入。最外層的電紡膜在對稱的兩個部位有少量細胞長入(圖A黑色星號標記區(qū)域)，分別為皮下緊貼皮膚和緊貼體壁的區(qū)域。由于這些部位血供充足，促進了細胞長入和部分移植細胞的存活。C圖放大顯示細胞長入電紡膜的區(qū)域(對應A圖實線方框部位)；D圖放大顯示電紡膜細胞長入交界區(qū)域(對應A圖虛線方框區(qū)域)。E圖為細胞長入電紡膜區(qū)域的Masson染色，僅見下層少量藍染的膠原纖維。外層藍染部位為取材時未除盡的組織表面疏松結締組織。紅色箭頭指示第二層電紡膜下尚殘留的種子細胞核。標尺：A＝1.0mm；C-E＝100μm。

附圖2：靜電紡PCL纖維膜(棉)的制備及其形態(tài)。10％PCL電紡絲用表面貼附有鋁箔的滾筒裝置接收最終得到細密的電紡絲(A)。電紡絲間緊密排列成PCL電紡膜(B)。透光可見PCL電紡膜細密緊實的結構，肉眼難以觀察到纖維質地(C)。35％PCL電紡絲用鏤空裝置接收后可得到排列取向一致的粗纖維(D)。這種纖維多層疊加后可得到結構疏松的PCL電紡棉(E)，透光可見定向排列的粗纖維(F)。

附圖3：PCL電紡膜(棉)掃描電子顯微鏡觀察。傳統PCL納米纖維電紡膜(對照)及大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)掃描電子顯微鏡圖。在相同放大倍率條件下，PCL電紡膜纖維細小，纖維之間留出的孔洞很小(A，B)；而PCL電紡棉纖維粗，纖維之間形成的孔洞大(B，D)。標尺：A,C＝100μm；B,D＝10μm。

附圖4：靜電紡纖維的排列及直徑分布特征。應用ImageJ圖像分析軟件測量電鏡圖片中150根纖維相對平面坐標x軸的成角及纖維直徑(A，B)。PCL納米纖維電紡膜(對照)的平均直徑約0.67±0.34μm，而大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)的直徑約3.90±1.85μm，其纖維直徑的頻數分布圖分別為C和D。

附圖5：PCL電紡膜(棉)的力學性能。材料在不同方向上收到拉力時具有不同的形態(tài)特征，也具有不同的可拉伸長度(緊實PCL電紡膜：A和B，大孔徑PCL電紡棉：C和D)。用拉力機測量材料的在收到拉力條件時的受力情況，其單位面積上的受力用MPa為單位，相對測量前的原始長度變化用百分數表示，得到兩種材料在順纖維方向(E)和垂直纖維方向(F)的拉力-拉伸比例曲線。楊氏模量是評價材料順應性的指標，即受力-拉長曲線上線性上升段的斜率。大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)在兩個方向上的楊氏模量均明顯小于傳統PCL電紡膜(對照)(G和H,*p<0.05.)。

附圖6：PCL電紡膜(棉)的親水角檢測。將5μL水滴于電紡膜(棉)，并分別檢測水滴在材料不同纖維延展方向上的親水角。滴加水滴后50s水滴于材料所成親水角顯示于圖A～D，每圖中右上角為檢測方向模式圖：A,C顯示檢測相機與材料纖維方向平行；B,D顯示材料與纖維方向垂直。每種材料不同方向上0s,20s和50s所成的親水角總結于圖E(*p<0.05)。

附圖7：人平滑肌細胞在PCL電紡膜(棉)上的生長。人平滑肌細胞在PCL電紡膜(對照，A)和PCL電紡棉(本發(fā)明，B)體外培養(yǎng)6天后的細胞形態(tài)。C圖展示單個細胞在單根PCL電紡棉纖維上的生長狀態(tài)(箭頭所指)。圖中細胞骨架均染成紅色，DAPI套染的細胞核發(fā)出藍色熒光。PCL纖維自發(fā)綠色熒光。標尺：A,B＝200μm，C＝100μm。

附圖8：無細胞電紡膜(棉)組織工程血管支架皮下移植前后大體觀。血管支架分別由傳統PCL電紡膜(對照)或大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)包繞于橡膠管制成(A和H)。血管支架作動物皮下移植用于構建具有自體組織的組織工程血管。其中緊密電紡膜血管支架皮下移植后4w(B,C和D)和6w(E，F和G)取材；對應地，疏松電紡棉血管支架皮下移植后4w(I，J和K)和6w(L，M和N)后取材。最右側一欄顯示對應移植物抽離橡膠管支撐物后的橫切面(D，G，K和N)。

附圖9：無細胞PCL電紡膜(棉)組織工程血管支架大鼠皮下移植4w后組織切片。無細胞緊實PCL電紡膜和無細胞大孔徑PCL電紡棉組織工程血管支架移植到大鼠皮下，4w后取材。電紡膜(對照組)冰凍切片HE染色可見電紡膜外層的結締組織包裹。電紡膜間無細胞和細胞外基質沉積(A和B)。Masson染色未見藍色的膠原纖維(C)。電紡棉(本發(fā)明)石蠟切片見細胞長入電紡膜全層，細胞外基質開始沉積(D和E)，Masson染色可見少量藍色的膠原纖維(F)。標尺：A,D＝400μm；B,C,E,F＝100μm。

附圖10：電紡膜(棉)大鼠皮下移植6w形成血管組織切片。無細胞緊實PCL電紡膜和無細胞大孔徑PCL電紡棉組織工程血管支架移植到大鼠皮下，6w后取材。電紡膜(對照組)冰凍切片HE染色見電紡膜外包裹結締組織，電紡膜內無自體細胞長入，也無細胞外基質沉積(A和B)。Masson染色僅見電紡膜外結締組織極少量的膠原沉積(C)。電紡棉(本發(fā)明)石蠟切片HE染色可見全層大量細胞和細胞外基質(D和E)，Masson染色見藍色膠原纖維沉積增多，細胞外基質呈類似天然血管壁的環(huán)向排列(F)。標尺：A,D＝400μm；B,C,E,F＝100μm。

附圖11：組織工程血管平滑肌細胞標記物免疫熒光染色。用大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)構建的組織工程血管(大鼠皮下4w)冰凍切片免疫熒光染色。每行圖片成一組，每組中細胞骨架被標記為紅色熒光(A，E和I)，組織中大部分細胞SM22標記物呈陽性(B)，組織中負責營養(yǎng)供給的新生血管管壁表達SMA或Calponin(F和J)。細胞核用DAPI套染為藍色(C，G和K)，每組圖片疊加結果分別為D，H和L。所有圖片標尺＝50μm。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

一、材料和方法

1動物

150g雄性清潔級SD大鼠為本實驗所涉及的動物，均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。動物實驗方案和實驗操作均通過上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心實驗動物管理小組審查批準。

2儀器

3試劑和材料

4方法

4.1相關溶液的配制

(1)10％和35％聚己內酯(PCL)靜電紡溶液

以TFE為溶劑，用電子天平稱取PCL顆粒，按10％和35％(m/v)的溶質比例稱量后轉入溶解瓶。按1.386g/ml的密度用電子天平量取相應體積的TFE轉入對應溶解瓶中。室溫下反復翻轉溶解瓶促進PCL均勻溶解。持續(xù)翻轉溶解4d后用于靜電紡。配制好的溶液應于1w內用完。

(2)平滑肌細胞培養(yǎng)液

平滑肌細胞培養(yǎng)液以原裝High-glucose DMEM培養(yǎng)液一瓶為單位配制。以500ml/瓶High-glucose DMEM培養(yǎng)液為例，加入55ml胎牛血清(FBS)和5.5ml青霉素鏈霉素雙抗(PS)?；靹蚝笈涑珊?0％FBS和1％PS的High-glucoseDMEM平滑肌細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液開封配成后，置于4℃冰箱保存，應于2w內用完。

4.2靜電紡PCL纖維的制備

(1)粗纖維PCL電紡棉的制備(本發(fā)明)

用注射器吸取35％PCL靜電紡溶液，換14G平口點膠針頭。將注射器裝載于微量注射泵，并安置使之懸于鏤空四骨架滾筒接收裝置的上方。調節(jié)高度，使針尖與接收裝置之間的距離為6cm。將高壓電源地級端連接于滾筒接收裝置，電源高壓端夾于針頭金屬部分。調節(jié)高壓電源，使高壓輸出為16kV。調節(jié)微量注射泵注射速率為5ml/h。調節(jié)滾筒控制器，使?jié)L筒旋轉速率為2000rpm。靜電紡初期，由于出絲尚不穩(wěn)定，這部分電紡絲可搜集于滾筒一端。待出絲穩(wěn)定后，于滾筒中部接收電紡絲。接收過程中應不斷緩慢左右移動滾動，使電紡絲在滾筒上以均勻的密度分布。

(2)傳統細纖維PCL電紡膜的制備(對照組材料)

參考我們之前制備納米纖維電紡膜的方法制備細密PCL電紡模：用注射器抽取10％PCL靜電紡溶液，換用18G平口點膠針頭。類似PCL粗纖維的制備，以同樣的方式安裝于微量注射泵。以表面包裹有鋁箔的實心滾筒為接收裝置。調節(jié)針頭與滾筒間的接收距離為12cm，微量注射泵的注射速度為3ml/h，高壓電源電壓為12kV，滾筒轉速為2000rpm。收集到的電紡膜作為下列實驗的對照組。

4.3PCL電紡膜(棉)的形態(tài)觀察

(1)大體觀察

分別觀察兩種不同的靜電紡纖維在收集裝置上的形態(tài)，注意纖維粗細，纖維之間排列的平行度等指標。多層粗纖維PCL電紡棉層疊可以得到“大孔徑PCL電紡棉”(簡稱“電紡棉”，即本發(fā)明)；剝離下鋁箔表面聚集的纖維得到“傳統PCL電紡膜”(簡稱“電紡膜”，為本發(fā)明的對照組)。觀察電紡膜(棉)形態(tài)。

(2)掃描電子顯微鏡觀察和分析

將兩種PCL電紡膜(棉)置于真空冷凍干燥箱中干燥過夜。初步干燥后的電紡膜(棉)再經過臨界點干燥、噴鍍金屬處理，置于掃描電子纖維鏡中觀察。得到的圖片用ImageJ 1.50i圖像分析軟件處理，隨機測量圖像中150根纖維相對平面坐標x軸的角度和直徑，再統計角度分布、纖維直徑分布和纖維平均直徑等指標(n＝3)。兩種材料的纖維直徑按平均直徑±標準差表示，統計差異性使用獨立樣本t檢驗(p<0.05被認為有統計學差異)。

4.4PCL電紡膜(棉)的力學檢測

用滾筒接收的PCL電紡膜(棉)纖維排列具有一定的取向特征，因此在分析其力學特征時，分順纖維方向力學特征和垂直纖維方向力學特征兩方面。按順纖維方向和垂直纖維方向為長方形的長，將電紡膜(棉)裁剪為10×40mm大小的長方形片，分別測量其厚(每組材料n＝5)。測量時拉力機上下夾具夾住長方形片每端各10mm，因此納入測量計量的纖維片長、寬、高分別為：a＝20mm,b＝10mm,c＝游標卡尺測量的厚度(mm)。拉力機啟動后，將測量不同拉長長度下(l/mm)材料片所產生的拉力(f/kN)。

拉伸過程中，材料產生的拉力(壓強)按下列公式計算：

$Stress\left(mPa\right)=\frac{f\left(kN\right)/1000}{b\left(mm\right)\&CenterDot;c\left(mm\right)}$

拉伸過程中，材料相對原始長度的拉伸比例為：

$Strain\left(\%\right)=\frac{\mathrm{\&Delta;}l\left(mm\right)}{a\left(mm\right)}\&times;100\%$

拉伸過程中，“拉力-拉伸比例曲線”被用于衡量材料整體的變化，曲線線性上升段的斜率為材料的楊氏模量(Young’s modulus)，用于衡量材料對抗形變的能力(順應性)。兩種材料的楊氏模量按“平均直徑±標準差”表示，材料間的統計學差異性使用獨立樣本t檢驗(p<0.05被認為有統計學差異)。

4.5PCL電紡膜(棉)的親水角檢測

親水角是檢測材料對某種液體親和性的方法。本研究中材料對水的親水角即材料與水的接觸角(contactangle)，后者是指氣、液、固三相交匯處所作的氣-液界面的切線與固-液交界之間的夾角。將上述經真空冷凍干燥后的電紡膜(棉)按“纖維與攝像頭平行”或“纖維與攝像頭垂直”兩種放置方向分別置于親水角檢測儀上，再滴加純水水滴，記錄液滴接觸材料表面后0s，20s和50s的親水角(n＝5)。每次測量后的各個時間點親水角按“平均直徑±標準差”表示，每種材料不同放置方向上的親水角，材料間相同放置方向的親水角的統計學差異性使用獨立樣本t檢驗(p<0.05被認為有統計學差異)。

4.6PCL電紡膜(棉)的細胞學實驗

(1)材料準備

分別裁剪合適大小的靜電紡膜(棉)置于6孔板內(每組n＝3)，每個板孔用環(huán)形不銹鋼壓住材料四周，以免操作過程中材料在孔內游走。以75％消毒酒精浸泡孔中的材料2h后，用滅菌蒸餾水洗滌3次。置于真空冷凍干燥箱內凍干。臨用前于紫外燈下輻照表面滅菌30～60min。

(2)細胞準備

取P2～4代人動脈導管平滑肌細胞。吸去培養(yǎng)皿中的平滑肌培養(yǎng)液，用PBS漂洗1～2次后，加入1ml胰酶/10cm培養(yǎng)皿。放置于37℃培養(yǎng)箱中消化2～3min。完成后加入3倍胰酶量的平滑肌細胞培養(yǎng)液終止消化，移入離心管。以1000rpm的速率離心5min。吸走上清液，再一定量的平滑肌細胞培養(yǎng)液重懸，細胞計數板計數。

(3)細胞的種植

將(1)中處理后裝有兩種材料的6孔板用于平滑肌細胞培養(yǎng)。細胞接種前預先在每孔中加入一定量的平滑肌細胞培養(yǎng)液，使材料充分吸收培養(yǎng)液后，培養(yǎng)液可完全沒過材料。將重懸后的平滑肌細胞按5×10⁵/孔的密度緩慢均勻地滴加到每個孔中，靜置培養(yǎng)于含5％CO₂的37℃恒溫培養(yǎng)箱。每2d換液1次。

(4)細胞的熒光染色觀察

上述細胞接種培養(yǎng)6天后，吸走培養(yǎng)液，用PBS洗滌2～3次，再轉移至新的6孔板，避免原6孔板底部生長的細胞對實驗結果造成干擾。用4％多聚甲醛固定30min。PBS漂洗2～3次。細胞骨架熒光染液與PBS按3.5:500(v/v)的比例配制并加入板孔中，于常溫染色30min，PBS漂洗3次。加入1:2000稀釋的DAPI染液套染細胞核10s，三蒸水漂洗3次。熒光顯微鏡鏡檢觀察。

5PCL電紡膜(棉)用于自體組織工程血管的構建

5.1電紡膜(棉)組織工程血管支架的搭建

(1)大孔徑無細胞PCL電紡棉組織工程血管支架的搭建(本發(fā)明所述的組織工程血管支架)

粗纖維PCL電紡棉最初收集于鏤空四骨架滾筒。以橡膠圓柱管為內支撐，將滾筒上的粗纖維沿同一方向包繞于橡膠管表面10圈，制成大孔徑無細胞PCL電紡棉組織工程血管支架。為了避免電紡棉纖維在纏繞后散開，橡膠管兩端用7-0絲線固定。

(2)細密無細胞PCL電紡膜組織工程血管支架的搭建(對照)

類似粗纖維組織工程血管支架的搭建方法。從鋁箔表面剝離細密靜電紡纖維膜，再纏繞于橡膠圓柱管表面10圈，制成細密無細胞PCL電紡膜組織工程血管支架。完成后兩端以7-0絲線固定。

5.2組織工程血管支架的動物皮下移植和評價

移植前應該按照上述細胞學實驗中敘述的方法完成“75％乙醇消毒-蒸餾水沖洗-真空凍干-紫外滅菌的”的消毒滅菌步驟。同時，還應該在移植前用含抗生素的生理鹽水浸泡。

以150g左右雄性SD大鼠為移植對象。稱量待實驗大鼠體重，以0.3ml/100g體重的劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。待大鼠失去知覺后，用電動剃刀剔除背部毛發(fā)。用絡合碘消毒手術部位及周圍3～5cm范圍內的皮膚。以無菌紗布鋪單。切開合適大小的皮膚，用止血鉗分離部分皮膚和皮下組織后，將包裹有電紡棉或電紡膜組織工程血管支架移植到皮下(每組n>3)。注意血管支架移植所在部位應該遠離皮膚切口。完成移植后用4-0帶線三角針縫合皮膚。用絡合碘消毒傷口3次。于手術完成后當即，1d和2d肌肉注射抗生素預防感染。

5.3自體組織工程血管的評價

(1)大體觀察

組織工程血管支架大鼠皮下移植后4w和6w取材。過量麻醉處死大鼠后沿原手術切口剪開皮膚。用止血鉗小心分離皮膚和皮下組織直至組織工程血管顯現。觀察組織工程血管組織與周圍組織的關系。完整剝離組織工程血管，抽出內包裹的橡膠支撐，注意組織橫切面情況。用鑷子感受組織彈性。

(2)石蠟切片和染色

常規(guī)石蠟切片并染色，完成組織石蠟切片和HE染色、Masson三色染色。顯微鏡觀察切片部位血管組織形成情況。應尤其注意組織深部是否有細胞長入。

(3)冰凍切片平滑肌細胞標記物免疫熒光染色

常規(guī)冰凍切片和染色方法，以SM22，Calponin和SMA為平滑肌細胞標記物，并套染細胞骨架和細胞核，完成組織冰凍切片和染色。最后用熒光顯微鏡觀察拍照。

二、結果

1PCL電紡膜(棉)的制備

1ml濃度為35％的PCL溶液通過靜電紡絲并收集于鏤空滾筒上可以得到排列呈平行取向的粗纖維PCL電紡棉。光學顯微鏡下觀察可見纖維彎曲如彈簧，大部分纖維排列取向一致。將鏤空骨架間的纖維沿同一方向繞于C形鐵絲兩臂之間，多層疊加后可得到結構疏松的大孔徑PCL電紡棉(本發(fā)明)。用3.5ml濃度為10％的PCL溶液通過靜電紡絲收集于實心滾筒上可得到細密的纖維。從鋁箔表面揭下收集到的纖維膜，即“傳統PCL電紡膜”(對照)，可明顯感受到細密的纖維堆積成的緊實結構(圖2)。

2PCL電紡膜(棉)的掃描電子顯微鏡觀察

掃描電子顯微鏡是觀察兩種電紡膜微觀結構最有效的工具之一。在相同倍率條件下，10％PCL靜電紡溶液按照一定條件紡出的PCL電紡膜具有傳統電紡膜的特征：纖維細小(直徑約0.67±0.34微米)，且纖維間形成的孔洞??；相反，本研究用35％PCL靜電紡溶液在鏤空滾筒上接收到的PCL纖維絲粗大(直徑約3.90±1.85μm)，纖維架構出的孔徑也明顯大于前者(約數十微米)。由于采用滾筒收集，因此兩種纖維排列還呈明顯的取向特征(圖3、圖4)

3PCL電紡膜(棉)的力學性能

由于PCL電紡膜(棉)的纖維具有一定的取向排列，因此，材料的拉伸性能可分為順纖維方向和垂直纖維方向兩種情況。(1)在順纖維方向上，材料在單位面積上所受的拉力與拉伸比例在一定范圍內呈線性關系，之后出現一拐點，單位面積拉力隨材料拉長而降低。纖維緊實的PCL電紡膜曲線拐點對應材料斷裂的時刻，因此拐點之后的曲線陡降至“0”MPa；而纖維疏松的PCL電紡棉在拐點之后其受力緩慢降低，實際表現為棉片纖維單根陸續(xù)斷裂，而非整體斷裂。(2)在垂直纖維方向上，在一定范圍內兩種材料同樣存在拉力-拉長比例的線性關系及拐點。然而，拐點的出現位置較順纖維方向上更低，離坐標原點距離更遠，表明纖維垂直方向具有更高的順應性和更小的斷裂受力。值得注意的是，垂直方向的曲線形態(tài)呈鋸齒狀。楊氏模量是評價材料抵抗形變能力的物理量(順應性)，即材料拉力-拉伸比例曲線線性上升段的斜率?？梢姴徽撛陧樌w維方向還是垂直纖維方向上，多孔的PCL電紡棉的楊氏模量均顯著小于緊實的PCL電紡膜(圖5)。

4PCL電紡膜(棉)的親水角檢測

親水角可以用于衡量被測材料與水的親和性，親和角越小，被測材料與水的親和性越高。PCL電紡膜和PCL電紡棉雖然屬于疏水材料，但由于制備技術和材料微觀結構的不同，兩種材料間以及材料本身不同方向的親水角依然不相同。緊實PCL電紡膜在“纖維與攝像頭垂直放置方向”以及“纖維與攝像頭平行方向”的親水角均明顯大于“多孔的PCL電紡棉”。對于多孔PCL電紡膜，在“纖維與攝像頭垂直方向”，其親水角明顯小于“纖維與攝像頭平行方向”。在緊實PCL電紡膜，雖然“纖維與材料垂直方向”上的親水角有低于“纖維與材料平行方向”上親水角的趨勢，但兩者對比沒有統計學差異。此外，還可以觀察到多孔PCL電紡膜“纖維與攝像頭垂直”方向上的親水角隨時間不斷減少的趨勢(圖6)。

5PCL電紡膜(棉)的細胞學實驗

人血管平滑肌細胞培養(yǎng)于PCL電紡膜或PCL電紡棉6d后，細胞骨架熒光染色可觀察到在PCL電紡膜上的細胞均勻地鋪展于纖維膜表面，但由于電紡膜的平面結構，細胞不具有三維空間位置差異。電紡膜上的細胞可沿纖維取向排列，但不甚明顯。平滑肌細胞同樣可在PCL電紡棉中生長。由于電紡棉疏松，且呈三維分布，因此細胞位置依纖維的空間位置排列高低錯落。平滑肌細胞粘附在電紡棉纖維上后，胞體可沿纖維表面伸展延長(圖7)。

6PCL電紡膜(棉)用于構建組織工程血管

大孔徑PCL電紡棉包繞至橡膠管后，可見無細胞電紡棉血管支架表面蓬松，而細密PCL電紡膜血管支架材料表面光滑緊密。大鼠皮下移植4w后取材，可見“電紡棉血管支架組”組織已完全包裹電紡棉支架。表面為一層疏松結締組織，透過表層可見下層肉紅色質地緊密的類血管組織。橡膠管支撐物可較輕松地與組織分離。分離后的組織工程血管橫切面肉眼難以見到原有的靜電紡纖維棉，管腔面光滑平整。移植4w的“電紡膜血管支架組”取材可見，表面有疏松結締組織覆蓋，可透見下層蒼白色“組織”。然而，在取出橡膠支撐物過程中，包繞的電紡膜發(fā)生分離，不能得到完整的組織工程血管?！半娂徝扪苤Ъ堋痹谄は乱浦?w后取材結果從大體看與4周取材結果基本類似，表面有疏松結締組織包裹，下層為致密的肉紅色組織工程血管。電紡膜血管支架組皮下移植6w后，大體觀與4w取材結果類似，依然無法取出完整的血管組織(圖8)。

7PCL電紡膜(棉)組織工程血管的組織學觀察

無細胞電紡棉血管支架皮下移植4w后形成的組織工程血管HE染色顯示，細胞已長入電紡棉內部。部分區(qū)域細胞具有環(huán)形排列的特征。然而，組織細胞中空洞較多。Masson染色顯示有松散的藍色的膠原纖維沉積，沉積部位組織明顯比無沉積部位致密。電紡膜支架移植后形成的血管由于支架與圓柱管難以剝離，因此取剝離出最具代表性的外層組織作冰凍切片。可見該組織工程血管僅最外層有疏松結締組織包裹，內層電紡膜完全無細胞及細胞外基質，Masson染色表明組織中無膠原纖維沉積(圖9)。

電紡棉支架皮下6w后形成的組織工程血管HE切片可見細胞已完全長入電紡棉內側，血管壁全層組織緊密，尤其是橡膠支架側細胞和細胞外基質密度較4w時明顯增加。細胞外基質排列呈環(huán)形，基本形似天然血管中層的排列構象。Masson三色染色可見藍色染色的膠原纖維沉積明顯增厚且致密。緊實電紡膜支架組冰凍切片染色結果與4w無太大差異(圖10)。

8組織平滑肌標記物檢測

為了檢測皮下形成的組織工程血管是否具有平滑肌細胞標記物陽性的細胞，實驗通過組織冰凍切片免疫熒光染色平滑肌細胞標記物SM22，Calponin和SMA。結果表明，材料大鼠皮下移植4w后，構建的組織工程血管中存在大量細胞，其中多數細胞表達平滑肌細胞的特異性標記物SM22。Calponin+和SMA+細胞呈環(huán)形排列，是血管壁中負責營養(yǎng)供給的微血管壁染色(圖11)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。