本發(fā)明涉及一種可用于治療神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)再生的中藥組合物，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
帶有蛋白質(zhì)沉淀的神經(jīng)退行性疾病包含大量的臨床癥狀。其特征為蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段(肽)的病理性異常、全身或局部濃縮，從而導(dǎo)致沉淀或積聚，并可能通過預(yù)聚合或低聚作用成為有序排列的結(jié)構(gòu)(例如：原纖維)，甚至可能會形成蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)(例如：阿茲海默病腦內(nèi)斑塊的β淀粉樣蛋白)。
在這些病理性病狀后還隱藏著一些疾病，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)阿爾茨海默病的發(fā)病隨年齡的增長而增加。目前，世界上阿爾茨海默病的發(fā)病率男性為3.05％，女性為4.82％，美國85歲以上癡呆發(fā)病率達(dá)4.72％。在西方國家里，阿爾茨海默病正逐漸取代卒中，位居神經(jīng)科疾病之首。我國阿爾茨海默病的病人總數(shù)已占世界第一位，預(yù)期到2050年，我國65歲以上和80歲以上的老年人和高齡老人將占總?cè)丝诘?5％和22％，屆時(shí)，AD患者可達(dá)到2500萬?，F(xiàn)在我國60歲以上人口已超過10％。目前已經(jīng)上市治療老年癡呆癥的藥物主要以乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑(NMDA)為主，這些藥物能在一定程度上改善患者的癡呆癥狀，但不能從根本上阻止病情的惡化、逆轉(zhuǎn)病情，因此尋找抗老年癡呆癥藥物的研制已經(jīng)引起全世界的重視，并已建立許多相關(guān)的生物活性篩選和評價(jià)體系。
另外，神經(jīng)損傷不可避免地給患者帶來極大的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)，與神經(jīng)退行性疾病相似的是損傷區(qū)會存在明顯神經(jīng)細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，并且這種現(xiàn)象是不可逆的。因此周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)與重建是當(dāng)前周圍神經(jīng)損傷領(lǐng)域的一大難題。目前在臨床治療過程中解決神經(jīng)缺損的手段依然以自體神經(jīng)移植為標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)，但由于自體神經(jīng)來源有限且造成供區(qū)較多的并發(fā)癥。
紅景天屬于景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola L)植物，世界上有90多種，中國有70多種。要分布于喜馬拉雅山地區(qū)，亞洲西北部和北美洲，我國主產(chǎn)于東北、華北和西南。紅景天屬植物民間多以全草入藥，有活血止血、清肺止咳的功效，用于治療咳血、咯血、肺炎咳嗽、婦女白帶等癥，古代亦用作滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥。紅景天最早作為藥用見記載于公元1200年的藏醫(yī)《四部醫(yī)典》中，記為“神藥——蘇羅瑪葆”，即現(xiàn)在的寬果紅景天(R.eurycarpa S.H.FU)?，F(xiàn)代的醫(yī)藥書籍根據(jù)紅景天植物學(xué)特征分成多種，作為藥用的見記載有《中華人民共和國藥典》(1985版)和《四川省中成藥標(biāo)準(zhǔn)》(1993版)記載的大花紅景天(R.crenulataH.Ohba)和狹葉紅景天(R.kirilowii Maxim)。
鞣花鞣質(zhì)(Ellagitannin)是在某些水果、漿果和堅(jiān)果(諸如石榴、懸鉤子、草莓、黑懸鉤子、胡桃和杏仁)中富含的單體多酚、低聚多酚和聚合多酚。水果和漿果被廣泛地在新鮮時(shí)消費(fèi)，并作為飲料(諸如果汁)，并且已經(jīng)報(bào)道它們會促進(jìn)健康。
尿石素是鞣花酸、安石榴苷(PA)、石榴皮鞣質(zhì)(punicalin)(PB)、新嗩吶素(tellimagrandin)(TL)和其它鞣花鞣質(zhì)的代謝物。目前臨床及科研研究表明其具有抗炎、抗氧化及抗癌活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于治療神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)再生的中藥組合物，其由紅景天總黃酮和尿石素組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述紅景天總黃酮和尿石素的重量比為10∶0.1-3；優(yōu)選為10∶0.7。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述紅景天總黃酮是指黃酮類成分高于90％的紅景天提取物，所述尿石素為尿石素A。
在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述中藥組合物由紅景天總黃酮、玉竹總皂苷、黃連總生物堿和尿石素組成，紅景天總黃酮、玉竹總皂苷、黃連總生物堿和尿石素的重量比為10∶2-5∶1-4∶0.1-3；優(yōu)選為10∶3∶2∶0.7。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述中藥組合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病或神經(jīng)再生藥物中的應(yīng)用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)退行性疾病優(yōu)選為阿爾茨海默癥，所述神經(jīng)再生是指神經(jīng)神經(jīng)損傷后的神經(jīng)細(xì)胞再生或促進(jìn)骨髓干細(xì)胞歸巢而導(dǎo)致的神經(jīng)再生。所述干細(xì)胞歸巢是指在腦、心臟和肝臟等多種組織或器官損傷后發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞歸巢現(xiàn)象，干細(xì)胞歸巢對組織或器官損傷修復(fù)發(fā)揮重要作用。神經(jīng)系統(tǒng)損傷后同樣存在干細(xì)胞歸巢現(xiàn)象。
在本發(fā)明中，所述紅景天總黃酮、玉竹總皂苷及黃連總生物堿可直接通過商業(yè)渠道獲得，當(dāng)然也可以通過本領(lǐng)域已知的相關(guān)制備方法進(jìn)行制備。具體的制備方法為：
紅景天總黃酮制備：將紅景天藥材粉碎過篩，以10倍量的水回流提取三次，每次1小時(shí)，過濾，濾液濃縮得浸膏，將浸膏上大孔樹脂LSA-10，先以正己烷以三倍柱體積洗脫，然后以75％乙醇進(jìn)行洗脫，收集75％乙醇洗脫液，濃縮干燥即得紅景天總黃酮。
玉竹總皂苷制備：將玉竹藥材粉碎過篩，以15倍量80％乙醇60℃提取三次，過濾，濾液濃縮得浸膏，用正丁醇1：1萃取5次，合并正丁醇萃取液，濃縮后上大孔樹脂AB-8，以80％乙醇洗脫，合并洗脫液，濃縮干燥即得玉竹總皂苷。
黃連總生物堿制備：將黃連藥材粉碎過篩，以12倍量0.1％硫酸溶液浸泡1小時(shí)后，然后加熱回流提取1小時(shí)，反復(fù)提取三次，過濾，向?yàn)V液加入藥材重量0.5％的大孔樹脂AB-8進(jìn)行吸附，濃縮濾液至原濾液體積的10％；向濃縮濾液中加入氯化鈉至15％(重量)并加入氯化鐵至5％(重量)，結(jié)晶48小時(shí)，濾過沉淀，水洗干燥后即得黃連總生物堿。
具體實(shí)施方式
還可進(jìn)一步通過實(shí)施例來理解本發(fā)明，其中所述實(shí)施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1中藥組合物對Aβ42淀粉樣蛋白聚集的影響
紅景天總黃酮制備：將紅景天藥材粉碎過篩，以10倍量的水回流提取三次，每次1小時(shí)，過濾，濾液濃縮得浸膏，將浸膏上大孔樹脂LSA-10，先以正己烷以三倍柱體積洗脫，然后以75％乙醇進(jìn)行洗脫，收集75％乙醇洗脫液，濃縮干燥即得紅景天總黃酮。
玉竹總皂苷制備：將玉竹藥材粉碎過篩，以15倍量80％乙醇60℃提取三次，過濾，濾液濃縮得浸膏，用正丁醇1∶1萃取5次，合并正丁醇萃取液，濃縮后上大孔樹脂AB-8，以80％乙醇洗脫，合并洗脫液，濃縮干燥即得玉竹總皂苷。
黃連總生物堿制備：將黃連藥材粉碎過篩，以12倍量0.1％硫酸溶液浸泡1小時(shí)后，然后加熱回流提取1小時(shí)，反復(fù)提取三次，過濾，向?yàn)V液加入藥材重量0.5％的大孔樹脂AB-8進(jìn)行吸附，濃縮濾液至原濾液體積的10％；向濃縮濾液中加入氯化鈉至15％(重量)并加入氯化鐵至5％(重量)，結(jié)晶48小時(shí)，濾過沉淀，水洗干燥后即得黃連總生物堿。
0.1mgAβ42蛋白凍干粉溶于10μLDMSO和543.78μL磷酸緩沖液體系中配置成終濃度為40μM的Aβ42蛋白儲備溶液。12.5μL待檢測樣品溶液、25μLAβ42蛋白儲備溶液及12.5μLThT儲備液(濃度為80μM)加于96孔板板孔中，混合并置96孔板振蕩儀以90rpm振蕩15min后于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱靜置孵育16h。16h后，利用英國TTP Labtech公司的高速細(xì)胞分析儀(Acumene X3型)405通道測定其熒光強(qiáng)度。
活性物質(zhì)的抗Aβ42蛋白聚集活性的計(jì)算：Vi＝[(FO-Fi)/FO]×100。其中，Vi為相對抑制率，F(xiàn)i為加入待測樣品后的Aβ42聚集物的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為未加入待測樣品時(shí)的Aβ42聚集物的熒光強(qiáng)度。
具體結(jié)果如下：
實(shí)施例2中藥組合物提高老年癡呆果蠅學(xué)習(xí)記憶活性測試
(1)老年癡呆果蠅的培育
w1118(isoCJ1)作為實(shí)驗(yàn)的對照組背景果蠅。成功轉(zhuǎn)入致病性Aβ42蛋白的果蠅為(UAS-Aβ42)。該品系果蠅通過與全腦表達(dá)Gal4啟動(dòng)子果蠅進(jìn)行雜交，獲得攜帶elav-GAL4c155(P35)與Aβ42的果蠅品系。
(2)老年癡呆果蠅的給藥
試驗(yàn)設(shè)置健康果蠅無藥對照、疾病果蠅無藥對照和疾病果蠅給藥的三種組別。
所有測試果蠅的親本均在恒溫24℃，恒濕42％RH(Relative humidity)的蠅房飼養(yǎng)和繁殖。果蠅羽化后的第一天將對照組果蠅及疾病組果蠅和待喂藥組果蠅通過二氧化碳麻醉之后，挑選正確性狀的果蠅在含有食物的玻璃管中。在給藥階段，所有測試果蠅在28℃恒溫和42％恒濕的保溫箱內(nèi)飼養(yǎng)，以保證果蠅吃藥的效率。每日果蠅喂藥4小時(shí)，從挑出果蠅的第二天一直喂藥到第8天。
所喂藥物在挑蠅第二天配制并與配制當(dāng)天給果蠅喂藥。另外，對照組果蠅喂含有1％DMSO的糖水。對于每個(gè)行為指數(shù)(Performance Index)，需要有2管果蠅組，每管中含有約100只果蠅。
1)在訓(xùn)練階段，將大約100只左右的果蠅裝入安置有銅網(wǎng)交叉電極的訓(xùn)練管，先后通入辛醇(0CT)和甲基環(huán)己醇(MCH)兩種氣味各60s，中間間隔45s的新鮮空氣。在通入第一種氣味(CS+)的同時(shí)給予果蠅60V的脈沖電擊刺激(US，脈沖時(shí)長1.5s，間隔3.5s)。通入第二種氣味(CS-)時(shí)不給予電擊。如此完成一個(gè)訓(xùn)練周期。
2)在瞬時(shí)記憶(學(xué)習(xí))能力測試中，完成一個(gè)訓(xùn)練周期的果蠅被立即轉(zhuǎn)移到T-Maze的選擇點(diǎn)，同時(shí)從相對的兩個(gè)方向通入CS+和CS-。經(jīng)過2min的選擇后兩側(cè)的果蠅被分別收集，麻醉或處死后進(jìn)行計(jì)數(shù)。行為指數(shù)(Performance index，PI)的計(jì)算公式如下：
PI＝[(CS-)-(CS+)]/[(CS-)+(CS+)]×100。
分別使用OCT和MCH作為CS+進(jìn)行訓(xùn)練和測試，得到的兩個(gè)PI的平均值作為一次實(shí)驗(yàn)的PI使用。PI＝0表示測試中果蠅對于兩種氣味的選擇為50∶50，即沒有形成記憶；PI＝100表示測試中果蠅全部逃避伴隨電擊的氣味，即完美記憶。進(jìn)行活性測試時(shí)，同時(shí)進(jìn)行不喂藥的同遺傳背景健康蠅(2U*H29.3)、不喂藥的老年癡呆疾病蠅(P35*H29.3)、喂測試藥的老年癡呆疾病蠅的嗅覺短期記憶缺陷測試，分別計(jì)算它們的總學(xué)習(xí)記憶行為指數(shù)(PI)。將喂測試藥的老年癡呆疾病蠅學(xué)習(xí)記憶行為指數(shù)與不喂藥的同遺傳背景健康蠅(2U*H29.3)行為指數(shù)、不喂藥的老年癡呆疾病蠅(P35*H29.3)行為指數(shù)相比較，評價(jià)測試藥物抗老年癡呆的作用。喂食測試物的老年癡呆疾病蠅學(xué)習(xí)記憶行為指數(shù)相對越高則說明測試物抗老年癡呆作用越強(qiáng)。采用T檢驗(yàn)比較，喂食測試物的老年癡呆疾病蠅學(xué)習(xí)記憶行為指數(shù)和不喂藥(僅給不含藥樣品的溶劑)的老年癡呆疾病蠅學(xué)習(xí)記憶行為指數(shù)，P＜0.05為有明顯差別，P＜0.01為有顯著差別，P＜0.001為有極顯著差別。
數(shù)據(jù)分析和圖形展示通過使用GraphPad Prism 5.03進(jìn)行處理
實(shí)施例3中藥組合物對小鼠Aβ模型的影響
雄性昆明小鼠，麻醉后在前囟處皮膚開一小口，暴露出顱骨，將老化的Aβ25-35 4nmol注入側(cè)腦室，對照組注入生理鹽水。次日起給藥組灌服藥物，10天后進(jìn)行Morris水迷宮測定，一天兩次，連續(xù)7天。數(shù)據(jù)采集和處理均由圖象自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。
具體結(jié)果如下：
實(shí)施例4中藥組合物促進(jìn)神經(jīng)導(dǎo)管材料的體外BMSC募集
使用Transwell共培養(yǎng)體系將支架和BMSC隔開，具體分組為：
空白組Transwell上室添加100μ1BMSC細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/m1)，下室添加500μ1無血清培養(yǎng)基；
對照組Transwell上室添加100μ1BMSC細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，下室添加500μ1浸泡神經(jīng)導(dǎo)管(Neurolac)的無血清培養(yǎng)基；
給藥組Transwell上室添加100μ1BMSC細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/m1)，下室添加500μl浸泡神經(jīng)導(dǎo)管(Neurolac)的無血清培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基中添加100μg/L的藥物。
37℃孵育24小時(shí)，PBS洗3次，4％多聚甲醛固定10min，用棉簽擦去上室未遷移過膜的細(xì)胞，DAPI染色30min，PBS洗3次，熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，具體結(jié)果如下：
實(shí)施例5中藥組合物體外誘導(dǎo)BMSC定向分化神經(jīng)細(xì)胞的研究
分別將不同藥物組添加到不同的培養(yǎng)皿中(終濃度100μg/L)，加入1ml包含1×106個(gè)/ml BMSC的培養(yǎng)基(10％FBS/DMEM)，對照組中不添加任何藥物，37℃孵育8小時(shí)后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，分別采用nestin和GFAP抗體作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗，計(jì)算各組細(xì)胞表達(dá)陽性率，每組平行試驗(yàn)3次，具體結(jié)果如下：
本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。