本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中母胎血型不合治療吸附器，主要用于母胎血型不合孕婦血漿中抗胎兒紅細(xì)胞抗體及溶血病患兒血漿中被破壞紅細(xì)胞產(chǎn)生的致病物質(zhì)的吸附清除。

背景技術(shù)：

胎兒繼承父親和母親各一半的基因成分，胎兒紅細(xì)胞可以攜帶來自父體的抗原，表現(xiàn)為胎兒的血型不同于母體。當(dāng)胎兒的紅細(xì)胞進(jìn)入母體的血液循環(huán)后，誘導(dǎo)母體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，抗體經(jīng)過胎盤進(jìn)入胎兒血液循環(huán)系統(tǒng)，結(jié)合胎兒紅細(xì)胞，使胎兒紅細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致胎兒和新生兒的母胎血型不合溶血性疾病。

人類紅細(xì)胞血型有26種，包括ABO血型、Rh血型以及MN、Lew、Kell和Fya等血型系統(tǒng)，但能引起母胎血型不合溶血病的血型以Rh血型和ABO血型為最常見。Rh血型抗原是由1號(hào)染色體上3對緊密連鎖的等位基因決定的，共有6種抗原，即C和c，D和d，E和e。由于D抗原最早被發(fā)現(xiàn)，抗原性最強(qiáng)，故臨床上凡是D抗原陽性者稱為Rh陽性，無D抗原者稱為Rh陰性。Rh血型抗原的抗原性決定了溶血病的嚴(yán)重程度，以D抗原的抗原性最強(qiáng)，其次為E抗原，再次為C、c和e抗原，d抗原的抗原性最弱，目前尚無抗d抗體發(fā)現(xiàn)。

雖然ABO血型不合的發(fā)生率很高，但胎兒溶血發(fā)生率很低，即使發(fā)生溶血，癥狀亦較輕，極少發(fā)生核黃疸和水腫，妊娠期無需特殊處理。而Rh血型不合雖然少見，但其引起母胎血型不合溶血病的病情程度要重于ABO血型不合，所以對Rh血型不合的診斷及預(yù)防極其重要。Rh血型不合由于母體產(chǎn)生大量抗胎兒紅細(xì)胞的IgG抗體，進(jìn)入胎兒體內(nèi)后破壞大量的胎兒紅細(xì)胞，使胎兒嚴(yán)重貧血、心衰、肝臟缺氧損傷、低蛋白血癥，表現(xiàn)為胎兒全身性水腫、胸水、腹水等。在新生兒時(shí)期，Rh血型不合性溶血較ABO血型不合出現(xiàn)黃疸時(shí)間早，最早出現(xiàn)在出生后12小時(shí)內(nèi)，多數(shù)出現(xiàn)在24小時(shí)內(nèi)。由于溶血產(chǎn)生的大量膽紅素不能及時(shí)從肝臟排除，使新生兒黃疸加重，大量的膽紅素滲入腦細(xì)胞而引起核黃疸，常死于嚴(yán)重貧血、心力衰竭、核黃疸，死亡率很高。

目前臨床上對母胎血型不合溶血病的孕期治療主要有血漿置換、胎兒輸血和終止妊娠。其中胎兒輸血包括胎兒腹腔內(nèi)輸血和胎兒血管內(nèi)輸血，均具有一定風(fēng)險(xiǎn)，且無一被證實(shí)有效；孕婦血漿置換就是在體外循環(huán)通路中以濾過法分離孕婦的血細(xì)胞和血漿，去除血漿并以等量的置換液(新鮮冰凍血漿或5％白蛋白)補(bǔ)充回輸，每次置換量2000～3000ml、速度20～30ml/min、治療時(shí)間2～4h、每1～3d治療1次；或每次取孕婦全血約400ml，低溫離心后去其血漿約300ml，補(bǔ)充等量同型新鮮血漿，還輸自身紅細(xì)胞(RBC)。血漿置換能與被去除的血漿量成比例地降低致病抗體的滴度(效價(jià))，從而能延長胎兒在母體內(nèi)的存活和生長發(fā)育時(shí)間、能延遲終止妊娠的時(shí)間，是母胎ABO、Rh或其它血型不合的孕婦在臨床早期保胎治療上的良好選擇，具有較好的療效，也無其他不良反應(yīng)。但血漿置換只能去除血液中的部分抗體，不能中止抗體的繼續(xù)產(chǎn)生，也不能逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的母胎血型不合溶血病，需要不間斷地進(jìn)行血漿置換才有效，僅適用于曾在妊娠20～22周前發(fā)生過胎兒水腫的孕婦，或配偶為致病抗原的純合子者，特別是在去除部份致病抗體的同時(shí)，也一同去除了大量的血漿(多種有益成份)，雖然以置換液作了補(bǔ)充，但無法完全補(bǔ)足被去除血漿及其各種有益成份，而且替補(bǔ)的置換液量大、費(fèi)用昂貴，補(bǔ)充異體血漿易致傳染病和輸液反應(yīng)等各種副作用，這就限制了血漿置換的普遍開展。

所以，迫切需要一種僅去除致病抗體、不去除血漿(多種有益成份)、無需使用血漿置換液的廉價(jià)、安全、無副作用的母胎血型不合溶血病的治療新方法。

凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)于1905年首先應(yīng)用于研究利澤甘氏現(xiàn)象，1932年應(yīng)用于鑒定細(xì)菌菌株，1946年Oudin在試管中進(jìn)行免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，用于分析抗原混合物，1948年Elek和Ouchterlony分別建立了瓊脂雙向擴(kuò)散法，用于鑒定兩種以上抗原或抗體。凝膠中抗原-抗體沉淀反應(yīng)的介質(zhì)凝膠瓊脂或瓊脂糖是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時(shí)能溶于水，冷后凝成凝膠，內(nèi)部形成一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而且孔徑很大，可允許大分子物質(zhì)(分子量可達(dá)百萬以上)自由通過?？讖降拇笮∵€決定于瓊脂濃度，瓊脂濃度大，孔徑相對較小，瓊脂濃度小，孔徑相對較大。1％瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，由于瓊脂或瓊脂糖具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，凝膠后含水量大，透明度好，來源方便，易處理，因此是一種很好的擴(kuò)散介質(zhì)。抗原和抗體的分子量一般都在20萬以下，在凝膠中基本呈自由擴(kuò)散。當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴(kuò)散后在凝膠中相遇時(shí)，形成抗原抗體復(fù)合物，若兩者在相遇處比例適當(dāng)，則形成最大的復(fù)合物。由于復(fù)合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀，這種沉淀就形成了一個(gè)“特異性屏障”，凡與其相同的抗原或抗體分子不能通過，而性質(zhì)不同的分子可以通過這個(gè)屏障而繼續(xù)擴(kuò)散，直到形成它們自己的復(fù)合物為止。這樣，不同抗原所形成的沉淀各有各的位置。此種反應(yīng)稱為瓊脂凝膠擴(kuò)散，是目前用已知抗體檢測未知量相應(yīng)抗原的常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目，通常將一定量的羊抗人Ig抗血清成分混合于瓊脂凝膠中，制成含有特異性羊抗人Ig抗血清的瓊脂板，當(dāng)待檢血清在瓊脂板中擴(kuò)散時(shí)，在抗原和抗體比例合適處發(fā)生結(jié)合，形成肉眼可見的白色沉淀而不再擴(kuò)散，另外當(dāng)母胎血型不合產(chǎn)生抗胎兒紅細(xì)胞抗體時(shí)，抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后在補(bǔ)體的參與下致紅細(xì)胞破壞，產(chǎn)生較大分子的破壞產(chǎn)物，能被某些特定大小的微孔所阻留。但至今未見據(jù)上述機(jī)制設(shè)計(jì)治療血型不合溶血病的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的母胎血型不合溶血病的治療問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供母胎血型不合溶血病治療吸附器；另一目的是要提供吸附器的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：以EB病毒永生化經(jīng)Rh陽性紅細(xì)胞致敏后能產(chǎn)生相應(yīng)抗體(Rh抗體)的Rh陰性B淋巴細(xì)胞，并將之與人或鼠骨髓瘤細(xì)胞溶合成為B淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞，制備Rh抗體，轉(zhuǎn)而作為免疫原免疫動(dòng)物制備抗Rh抗體，檢測效價(jià)，分別以起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在56℃的0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％瓊脂糖C1-4B生理鹽水配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100效價(jià)梯度的應(yīng)用抗體，按效價(jià)從低到高依次取15～20ml加入以丙烯酸酯之類高分子材料制成的在出入口設(shè)置了能阻擋特定致病微粒網(wǎng)篩的圓柱形容器內(nèi)，使先加入的應(yīng)用抗體冷卻至半固體凝膠后才接著加下一次，制成使容器中的凝膠從進(jìn)樣端到出樣端形成從高到低的抗體效價(jià)而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布的吸附器，有利于血漿灌流及分子篩和免疫結(jié)合的作用，當(dāng)體外循環(huán)中被分離的血漿流經(jīng)吸附器時(shí)，Rh抗體被固定在凝膠中的抗Rh抗體分層結(jié)合成固定的復(fù)合物，被破壞的紅細(xì)胞碎片及與之結(jié)合而成的大分子免疫復(fù)合物被近吸附器出口端濃度漸高而分子篩漸小的瓊脂凝膠阻留，去除致病物質(zhì)的血漿從吸附器流出后回輸體內(nèi)，從而達(dá)到避免孕婦Rh抗體進(jìn)入胎兒血液和減輕病情的治療目的。

Rh抗體是母胎Rh血型不合溶血病的致病因子，而抗Rh抗體是Rh抗體的免疫性抗體，能與Rh抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而形成復(fù)合物，本發(fā)明以免疫學(xué)技術(shù)制備抗Rh抗體，以特定的比例固定于瓊脂糖介質(zhì)制成吸附劑，能與濾過血漿中的Rh抗體發(fā)生結(jié)合而形成固定的免疫復(fù)合物而被清除，瓊脂凝膠所形成的濾孔隨著瓊脂糖濃度的增高而減少，近吸附器進(jìn)口處的瓊脂糖濃度低，濾孔就大，有利于血漿灌流及高滴度抗Rh抗體與Rh抗體的結(jié)合，而近出口處的濃度漸高，濾孔就漸小，易于阻留溶血病患者紅細(xì)胞破壞所形成的碎片及與之結(jié)合而成的大分子免疫復(fù)合物，在吸附器出口處設(shè)置的能阻擋特定大小微粒的網(wǎng)篩也具有阻留紅細(xì)胞破壞產(chǎn)物的作用，對致病物質(zhì)形成了特異性免疫吸附和非特異性機(jī)械阻擋的雙重屏障，特制瓊脂糖介質(zhì)冷卻后凝成半固體，內(nèi)部形成均勻多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于游離抗原和抗體以及血漿成份的均勻擴(kuò)散，避免了血漿液流的死腔，增加了抗Rh抗體吸附Rh抗體的均勻性和表面積，增強(qiáng)了吸附治療的的效果，吸附了Rh抗體后的血漿濾出吸附器后回輸體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了人工將Rh抗體從體內(nèi)轉(zhuǎn)移到體外的治療，是一種僅去除致病抗體，不去除血漿及其多種有益成份的無需使用血漿置換液的廉價(jià)、安全、無副作用的母胎Rh血型不合溶血病的治療新方法。

具體實(shí)施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的母胎血型不合治療吸附器的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的母胎血型不合治療吸附器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖

圖1中，動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素泵(2)和血液泵(3)與血漿分離器(4)相連，血漿分離器(4)經(jīng)血漿泵(6)和循環(huán)管路(7)與2個(gè)并聯(lián)的吸附器(8)、吸附器(9)相連，然后依次與循環(huán)管路(10)、靜脈管路(5)相連，靜脈管路(5)的另一端與靜脈血管相連。

圖2中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過微孔(3)的血細(xì)胞，5是能通過微孔(3)的小分子血漿成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是可開關(guān)的閥門。

圖3中，1是吸附器，2是進(jìn)入吸附器的Rh抗體，3是被固定在瓊脂凝膠中的抗Rh抗體，4是Rh抗體被抗Rh抗體結(jié)合吸附形成的抗原抗體免疫復(fù)合物，5是未被抗Rh抗體結(jié)合吸附而往下移動(dòng)的Rh抗體，6是瓊脂凝膠顆粒之間形成的微孔。

下面結(jié)合圖1、圖2和圖3，對本發(fā)明提出的母胎血型不合治療吸附器的實(shí)施方案作詳細(xì)的描述。

1、制備Rh陰性淋巴細(xì)胞

(1)原代細(xì)胞獲取：購買浙江省血站新鮮濃縮Rh陰性白細(xì)胞300ml；另購買新鮮Rh陽性紅細(xì)胞懸液300ml。(2)Rh陰性淋巴細(xì)胞分離制備(分離液避光4度保存，用前在37度水浴中加溫，整個(gè)分離過程溫度應(yīng)控制在8-28度，溫度過高或過低均影響分離質(zhì)量)：無菌抽取20mL新鮮濃縮Rh陰性白細(xì)胞，PBS液稀釋3～5倍，充分混勻后取6mL用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一條以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清，50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，主要為Rh陰性淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞和B細(xì)胞)。

2、制備Rh陰性致敏淋巴細(xì)胞

將Rh陰性淋巴細(xì)胞和Rh陽性紅細(xì)胞懸液以1000r/min離心5min，去上清，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1～2次，將兩種沉淀細(xì)胞等量混合，加5倍量的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI-1640)，37℃，5％CO2培養(yǎng)24h，然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細(xì)胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細(xì)胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細(xì)胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細(xì)胞的存活，此時(shí)，混懸液中主要含有Rh陰性致敏淋巴細(xì)胞。

3、制備Rh陰性致敏B細(xì)胞株(EB病毒轉(zhuǎn)化Rh陰性致敏淋巴細(xì)胞)

按常規(guī)EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞技術(shù)，取Rh陰性致敏淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為2x 10⁶后加入適量的EB病毒(EBV)原液，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜，制備待雜交的EB病毒轉(zhuǎn)化的致敏淋巴細(xì)胞。(1)試劑：RPM1640培養(yǎng)基：內(nèi)含20％胎牛血清(Gibco){56℃滅活30分鐘}、1.6～1.8％HEPES、1.2％谷氨酰胺、1％青霉素和鏈霉素；環(huán)胞酶素A(CyA)：5ml(250mg)/瓶，用1640培養(yǎng)基稀釋成0.2mg/ml，使用時(shí)終濃度為2ug/ml(0.5％)；EB病毒(EBV)液：購自中國科學(xué)院遺傳所，儲(chǔ)存于零下80度，使用時(shí)從冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um的濾膜過濾，不要超過0.5～1小時(shí)。(2)方法：取Rh陰性致敏淋巴細(xì)胞，加6ml 1640全培養(yǎng)液進(jìn)行第二次洗滌，離心1500轉(zhuǎn)15分鐘；棄上清液，加入2ml 1640全培養(yǎng)基(全培養(yǎng)基加入前，置37度水浴10分鐘)，然后加入環(huán)胞霉素A(4％)和1.2mlEBV液/份，充分混勻后移入到25平方厘米的培養(yǎng)瓶，置37度，5％CO2培養(yǎng)箱中；如果細(xì)胞增長慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn)行等量換液；當(dāng)總量達(dá)到14ml時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基；每2-3天加入3ml新鮮配制的培養(yǎng)基(1.6％1M HEPES緩沖液；15％胎牛血清(FBS)；1％青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補(bǔ)足到100％)。7天左右鏡下觀察，可見淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；約6～8周，當(dāng)總量達(dá)到45ml時(shí)，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清，配成細(xì)胞懸液備用，主要為Rh陰性致敏B細(xì)胞株[如果要凍存，則加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中)]。

4、篩選Rh陰性效應(yīng)B細(xì)胞株(篩選產(chǎn)Rh抗體的EB病毒轉(zhuǎn)化Rh陰性致敏淋巴細(xì)胞)

效應(yīng)B細(xì)胞株是指能產(chǎn)生Rh抗體的B細(xì)胞株，以抗人球蛋白試驗(yàn)或常規(guī)ELISA法篩選產(chǎn)Rh抗體淋巴細(xì)胞：(1)直接抗人球蛋白試驗(yàn)：檢測B淋巴細(xì)胞株(B細(xì)胞株)表面是否表達(dá)Rh抗體。購買抗人球蛋白血清和抗-D血清，以生理鹽水洗滌1次并配成5％淋巴細(xì)胞株懸液，取1滴細(xì)胞懸液與2滴抗人球蛋白血清混勻，置室溫5min后低速離心，輕輕混和，肉眼或鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞株凝集者為細(xì)胞表面表達(dá)有Rh抗體(同時(shí)配制未致敏的5％淋巴細(xì)胞懸液加抗人球蛋白血清做陰性對照；以Rh(D)陽性紅細(xì)胞加抗-D血清做陽性對照)。(2)間接抗人球蛋白試驗(yàn)：檢測淋巴細(xì)胞株培養(yǎng)上清液是否含有Rh抗體。以生理鹽水洗滌2次并配成5％Rh(D)陽性O(shè)型紅細(xì)胞懸液，各取紅細(xì)胞懸液、淋巴細(xì)胞株培養(yǎng)上清液及抗人球蛋白血清1滴混勻，置室溫5min后低速離心，輕輕混和，肉眼或鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞凝集者為淋巴細(xì)胞株培養(yǎng)上清液含有Rh抗體(同時(shí)以紅細(xì)胞懸液與抗人球蛋白血清混合管為陰性對照、以紅細(xì)胞懸液與抗-D血清混合管為陽性對照)。以此直接或間接抗人球蛋白試驗(yàn)篩選出能分泌較高效價(jià)(較高倍數(shù)稀釋后仍試驗(yàn)陽性)Rh抗體的B細(xì)胞株(孔)，繼續(xù)傳2～3代。

5、制備Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞(制備Rh陰性效應(yīng)B細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞)

(1)培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、HAT、HT選擇培養(yǎng)基購自Sigma公司，優(yōu)級胎牛血清(FBS)購白天津市灝洋生物制品科技責(zé)任有限公司；DMSO(-甲基亞砜)為國產(chǎn)分析純試劑。(2)骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：融合前一周從液氮罐內(nèi)取出一管凍存的骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，立即放入熱水解凍(應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈，細(xì)胞的最高生長刻度為9×10⁵/ml，倍增時(shí)間通常為10～15h；與人體相關(guān)的實(shí)際應(yīng)用中考慮選擇同源細(xì)胞株，如上海復(fù)祥生物科技有限公司向ATCC細(xì)胞庫引進(jìn)的NCI-H929人骨髓瘤細(xì)胞株)。融化后加入適量完全培養(yǎng)液，1000r/m離心3min；重復(fù)1次。將沉淀物移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加DMEM培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3～4天進(jìn)行一次傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前24小時(shí)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，保證融合前細(xì)胞形態(tài)良好、生長旺盛。加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基到離心管中，輕輕敲打混勻后1000r/min離心5-10min，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。(3)待雜交Rh陰性效應(yīng)B細(xì)胞株準(zhǔn)備：以基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整總細(xì)胞數(shù)到1×10⁸～2×10⁸用于細(xì)胞融合，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。(4)細(xì)胞融合：將Rh陰性效應(yīng)B細(xì)胞株與骨髓瘤細(xì)胞以5～10∶1的比例加入離心管中，混和均勻，1000r/min離心5min，棄去上清，輕輕敲打管底至細(xì)胞無顆粒狀沉淀，重復(fù)2次。在37℃水浴中輕輕旋轉(zhuǎn)預(yù)熱離心管，取出后無菌條件下將預(yù)熱的1000μL的50％PEG3000在60s內(nèi)沿管壁滴加到融合管中同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，之后將預(yù)熱的25mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在3～5min內(nèi)也沿管壁滴加到離心管中，在加入的過程中輕輕地旋轉(zhuǎn)離心管，然后靜置于37℃水浴10min，1000r/min離心5min，棄去上清，加入50mL HAT培養(yǎng)基。適當(dāng)混勻后接種到96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(5)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞：觀察96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞生長情況，7～10天后僅有雜交瘤細(xì)胞能夠生長分裂，此時(shí)棄去HAT培養(yǎng)基，更換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞克隆生長面積達(dá)到1/10個(gè)細(xì)胞孔時(shí)，去培養(yǎng)上清，選擇生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長的位置、大小，使用無菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞克隆長滿至孔底面積1/10以上時(shí)，取細(xì)胞或培養(yǎng)上清檢測雜交瘤細(xì)胞功能。(6)篩選Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞：Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞是指能產(chǎn)生Rh抗體的雜交瘤細(xì)胞，方法同篩選產(chǎn)Rh抗體的效應(yīng)B細(xì)胞株，以直接或間接抗人球蛋白試驗(yàn)篩選出能分泌較高效價(jià)Rh抗體的Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞(克隆)，重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶大量培養(yǎng)[如欲凍存和復(fù)蘇，則在保存前12小時(shí)調(diào)整細(xì)胞生長狀態(tài)，取一瓶生長旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆?。?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動(dòng)使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌條件下打開凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴(kuò)大培養(yǎng)]。(7)擴(kuò)增Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞：將Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按常規(guī)方法反復(fù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。

6、制備Rh抗體

(1)從Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中以常規(guī)方法分離、純化Rh抗體。(2)Rh抗體單抗小鼠腹水的制備：低速離心收集培養(yǎng)后的Rh陰性效應(yīng)雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞數(shù)為1×10⁷/mL，小鼠腹腔注射0.2mL/只，注射后觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹部明顯臌起，用針頭穿刺腹腔，離心管收集腹水，采集完畢，對小鼠腹腔注射適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，間隔2～3天，同樣方法再取腹水，收集到的腹水，10000r/min離心5min，吸取上清液，分裝，-20℃保存。上清液中含有大量的Rh抗體，按常規(guī)方法分離、純化Rh抗體、以抗人球蛋白試驗(yàn)或ELISA法測定抗體的效價(jià)。

7、制備抗Rh抗體

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用的是浙江大學(xué)動(dòng)物學(xué)院雜交白山羊，體重30斤左右的健康青壯年母羊二只，免疫前用染料涂沫在動(dòng)物的背部，作出明確的標(biāo)記，采用隨群圈養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，每天保證羊只得到適量的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間在傍晚，每次運(yùn)動(dòng)大概半小時(shí)左右，這樣利于身體健壯，避免羊只過肥，增加機(jī)體的免疫力，飲水充足，并給予適量的精料、青草、玉米、麩皮、小麥、維生素等等，使其營養(yǎng)均衡。經(jīng)常查看實(shí)驗(yàn)羊只健康狀況。(2)免疫源：本發(fā)明制備的Rh抗體(Rh抗體即抗-D血清，有市售產(chǎn)品)接種前混合0.1mL抗原、1.9mL無菌PBS、2mL弗氏完全(或不完全)佐劑制成免疫原乳劑備用。(3)山羊的免疫：選取兩只山羊，標(biāo)記為山羊A、山羊B，接種抗原。免疫部位為前后腹股溝，每處腹股溝分2個(gè)點(diǎn)注射，總共有8個(gè)注射點(diǎn)，注射方式為皮下注射，每只山羊每次注射4mL免疫原，含250μg抗原；每個(gè)注射點(diǎn)注射免疫原0.5mL，約含32μg抗原。免疫前兩只山羊分別抽血10mL，標(biāo)記為0dP1，-20℃保存；免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP1，以ELISA檢測血清效價(jià)，剩余血清-20℃保存，3～4周開始第二次免疫，免疫原為0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP2，ELISA檢測血清效價(jià)，剩余血清-20℃保存。第三次免疫時(shí)間為6～8周后，免疫原為0.1mL抗原+1.9mL無菌PBS+2mL弗氏不完全佐劑(IFA)，免疫7天后抽血10mL，分離血清，標(biāo)記為7dP3，ELISA檢測血清效價(jià)，剩余血清-20℃保存，如果此時(shí)血清效價(jià)沒達(dá)到1∶10⁶以上，則需要再免疫一次；如果血清效價(jià)已達(dá)10⁶以上則不用再免疫，以后每隔一周抽血50mL，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?4)抗Rh抗體血清制備：一般每次免疫后7～10天即可于羊頸靜脈采血檢測，由助手協(xié)助保定動(dòng)物，使其保持站立姿勢，頸部剪毛、無菌棉球擦拭消毒后，尋找到頸靜脈手持注射器采血，將注射器位置固定取血5～10mL。分離出血清后進(jìn)行效價(jià)檢測。在第三次免疫后7～10天，經(jīng)效價(jià)檢測合格后一次可取血30-50mL，在無菌條件下分離血清，待收集于平皿或三角瓶內(nèi)的血液凝固之后，用無菌滴管在無菌環(huán)境(例如超凈工作臺(tái))中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃過夜，使血清充分析出(不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血)，經(jīng)離心沉淀分出血清，放進(jìn)低溫冰箱保存，使用前須經(jīng)過簽定合格后再分裝保存?zhèn)溆谩?5)抗血清效價(jià)的測定：抗血清效價(jià)采用ELISA測定方法，包被時(shí)是將樣品用包被液稀釋到1∶1000的濃度后，在酶標(biāo)板上每孔加100μL，然后放在鋁盒中放入4℃冰箱里過夜，第二天早上拿出來拍干包被液，用PBST洗滌三次，每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干酶標(biāo)板，加入10％血清的封閉液，每孔加100UL，放入37℃，水浴1～2h，然后再拿出來拍干封閉液，用PBST洗滌酶標(biāo)板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，加入100μL/孔一抗(1∶2000稀釋，用4％牛血清的PBST稀釋，放入37℃，水浴1～2h)，然后再拿出來拍干一抗液，PBST洗滌酶標(biāo)板三次，每次間隔5分鐘，最后一次用紗布拍干酶標(biāo)板，加入二抗液(兔抗羊1∶1000)，每孔加100μL，放入37℃，水浴1～2h，再拿出來拍干二抗液用PBST洗滌酶標(biāo)板3每次間隔五分鐘，最后一次用紗布拍干，每孔加50μL底物顯色液，閉光顯色10～20分鐘后加入2M的H2SO4溶液50μL終止反應(yīng)，后用酶標(biāo)儀測OD值(半小時(shí)內(nèi))。或以最大稀釋倍數(shù)的抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果陽性者作為抗體的效價(jià)。

本發(fā)明制備的Rh抗體即Ig抗-D，抗Rh抗體即抗Ig抗-D，按本發(fā)明的技術(shù)方案同樣能制備Ig抗-A、Ig抗-B、Ig抗-E、Ig抗-C及抗Ig抗-A、抗Ig抗-B、抗Ig抗-E、抗Ig抗-C，并進(jìn)一步制備免疫吸附吸附器。本發(fā)明在制備Rh抗體后，在進(jìn)行抗Rh抗體的制備時(shí)，除了通過免疫山羊制備外，還可以通過免疫小鼠，然后取小鼠的免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞溶合，然后按常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備抗Rh抗體。

8、吸附器的制備

(1)制備原理：將能吸附致病物質(zhì)的活性物質(zhì)(配基)以交聯(lián)或偶聯(lián)的方式固定在高分子載體上制成吸附劑，以生物或理化親和的特異結(jié)合來吸留、清除相應(yīng)的致病物質(zhì)。目前可用作免疫吸附劑配基的有蛋白A、特定的抗原或抗體(抗人IgG抗體)、C1q、聚賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等；可用作載體的有瓊脂糖凝膠、葡聚糖、二氧化硅凝膠、聚乙烯醇珠、樹脂等。吸附劑應(yīng)具有特異選擇性、穩(wěn)定而可再生性、生物相容性(無毒、無變態(tài)反應(yīng)、無物理化學(xué)反應(yīng)、不激活補(bǔ)體和凝血系統(tǒng))。

本發(fā)明基于母胎血型不合溶血病的病因是孕婦血漿中存在Rh抗體，而Rh抗體能被抗Rh抗體免疫中和以及瓊脂糖冷卻后凝成半固體，內(nèi)部形成一種較大孔徑的均勻多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，游離的抗原或抗體能在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散的機(jī)制制作。

(2)制備材料：要求生物相容性好，無補(bǔ)體激活、無炎癥反應(yīng)、無白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3aC5a的改變。要求通過共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料表面的均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響。在吸附器內(nèi)表面加親水凝膠，如固化2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸在醋酸纖維素膜上，通過控制濕紡過程而生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，可以提高生物相容性。將某些抗凝物質(zhì)固化在載體或吸附器內(nèi)表面，可抑制血液凝固、降低肝素用量甚至實(shí)現(xiàn)無肝素化，如將肝素聚合在聚丙烯腈-聚乙烯亞胺膜上，可減少過敏體質(zhì)的過敏反應(yīng)；將肝素共價(jià)結(jié)合到聚醚砜表面，可保持聚醚砜的力學(xué)性能和提高吸附器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價(jià)固化亞油酸膜，或?qū)⒐矁r(jià)結(jié)合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。要注意所選用的吸附器制備材料要么能選擇性地吸附欲清除的物質(zhì)，要么對各種成份都無吸附作用。

(3)吸附器外殼的規(guī)格

制成50mm×60mm的底徑小、頂徑大的圓柱形容器，或制成方形、漏斗形，容積約200～300ml，上下部均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為500目，底徑篩網(wǎng)目數(shù)為50目，液體出口處設(shè)置目數(shù)為200目的細(xì)胞濾網(wǎng)，構(gòu)成了防止細(xì)胞碎片進(jìn)入循環(huán)的第二道防線，液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

(4)制備方法：將所制備的抗體分別以起載體作用的經(jīng)100℃溶化后保溫在56℃的0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％瓊脂糖C1-4B生理鹽水配成1∶700、1∶500、1∶300、1∶200、1∶100效價(jià)梯度的應(yīng)用抗體，按效價(jià)從低到高依次取15～20ml加入以丙烯酸酯之類高分子材料制成的在出入口設(shè)置了能阻擋特定大小致病微粒網(wǎng)篩的圓柱形容器內(nèi)，要求先加入的應(yīng)用抗體冷卻至半固體凝膠后才接著加下一次，制成使容器中的凝膠從進(jìn)樣端到出樣端形成從高到低的抗體效價(jià)而從低到高的瓊脂糖濃度的分層分布的吸附器，當(dāng)體外循環(huán)中被分離的血漿流經(jīng)吸附器時(shí)，Rh抗體被固定在凝膠中的抗Rh抗體分層結(jié)合成不再移動(dòng)的免疫復(fù)合物，紅細(xì)胞破壞產(chǎn)生的大分子致病物質(zhì)及免疫復(fù)合物被近吸附器出口端濃度漸高而分子篩漸小的瓊脂凝膠阻留，在出入口設(shè)置了能阻擋特定大小致病微粒網(wǎng)篩的吸附器也具有阻留紅細(xì)胞破壞產(chǎn)物的作用，去除Rh抗體及致病物質(zhì)的血漿從吸附器流出后回輸體內(nèi)，從而避免孕婦Rh抗體進(jìn)入胎兒血液和減輕病情的治療目的。

本發(fā)明不但以瓊脂糖C1-4B為載體，還包括能吸附抗Rh抗體的高生物相容性材料為載體，將抗Rh抗體固定于樹脂類載體顆粒上，通過固定載體顆粒而固定抗Rh抗體，用以吸附Rh抗體；還包括將能直接吸附Rh抗體和/或抗Rh抗體的高生物相容性材料制成吸附器和/或粘附于循環(huán)管路的內(nèi)表面，用以吸附Rh抗體和/或抗Rh抗體。

9、吸附器的應(yīng)用

吸附器應(yīng)用時(shí)，需與相關(guān)構(gòu)件共同組成體外循環(huán)支路。

(1)體外循環(huán)支路的構(gòu)件及用途

①吸附器：內(nèi)含抗Rh抗體、瓊脂凝膠介質(zhì)，用于清除Rh抗體、RBC碎片、Rh抗體與RBC碎片形成的免疫復(fù)合物等。

②血漿分離器：用于分離血細(xì)胞和血漿。

(I)制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(II)制備材料：可選用聚醋無紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(III)規(guī)格：就分離器的外形來說，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

③動(dòng)靜脈壓監(jiān)測：動(dòng)脈壓監(jiān)測主要用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測吸附器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是吸附器微孔堵塞時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)升高；靜脈壓監(jiān)測用來監(jiān)測管路血液回流的壓力，當(dāng)吸附器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時(shí)，靜脈壓就會(huì)下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時(shí)，靜脈壓就會(huì)升高。

④空氣監(jiān)測(Air Detector)：用來監(jiān)測血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測到有空氣氣泡時(shí)，檢測系統(tǒng)會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)、靜脈血路夾來阻斷血流，防止危險(xiǎn)的發(fā)生。

(5)血泵(Blood Pump)：用來推動(dòng)血液循環(huán)以維持治療的順利進(jìn)行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測功能，以監(jiān)測病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會(huì)造成血流檢測不準(zhǔn)；也不可太緊，否則會(huì)造成管路破裂。

(6)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當(dāng)于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。

此外還包括溫度控制系統(tǒng)、配液系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測系統(tǒng)、超濾監(jiān)測和漏血監(jiān)測等部分?？傊?，在本發(fā)明基本構(gòu)成體系的基礎(chǔ)上，有望進(jìn)一步發(fā)展為自動(dòng)化、人性化、個(gè)性化、模塊化、自動(dòng)監(jiān)測及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報(bào)原因及解除信號(hào)等微電腦處理系統(tǒng)。

(2)吸附器在體外循環(huán)支路中的使用方法

①安裝：以無菌操作連接各部件，包括血漿分離器、吸附器及各循環(huán)管路等各部。

②排氣：以無菌生理鹽水充液分離器、吸附器及各循環(huán)管路，排除分離器、吸附器及其循環(huán)管道內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無氣體、氣泡后使用。

③通液：將動(dòng)脈血路管1接通艾滋病患者的動(dòng)脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

④抗凝：從肝素泵向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

⑤啟動(dòng)：將動(dòng)脈血路管(1)接通治療者的動(dòng)脈血管，將靜脈管路(5)接通治療者的靜脈血管，然后打開血液泵，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動(dòng)脈血液經(jīng)動(dòng)脈血路管(1)進(jìn)入血漿分離器(4)，分離出來的血漿在血漿泵(6)的作用下經(jīng)循環(huán)管路(7)到達(dá)吸附器(8)，待充滿血漿、約10分鐘，開始放出血漿，經(jīng)循環(huán)管路(10)流出，同步向吸附器(9)灌注血漿，在吸附器(8)內(nèi)的血漿將近流完時(shí)，再次開始灌注血漿，此時(shí)吸附器(9)開始放出血漿，兩個(gè)并聯(lián)的吸附器(8)、吸附器(9)交替進(jìn)行。如圖2，當(dāng)待分離的血液進(jìn)入血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)時(shí)，經(jīng)閥門(8)的作用，能通過微孔(3)的小分子血漿及其成份(5)進(jìn)入分離器的外腔(6)，然后經(jīng)血漿出口(7)流出，而不能通過微孔(3)的血細(xì)胞(4)經(jīng)閥門(8)流出。如圖3，當(dāng)Rh抗體(2)進(jìn)入吸附器(1)時(shí)，被固定在凝膠中的抗Rh抗體(3)結(jié)合成免疫復(fù)合物(4)而不再往下移動(dòng)，被破壞的紅細(xì)胞碎片及與之結(jié)合而成的大分子抗原抗體復(fù)合物也不能通過凝膠微孔而被阻留，未被結(jié)合的Rh抗體(5)可以經(jīng)瓊脂凝膠孔流出，吸附后的血漿與血漿分離器分離出來的血細(xì)胞匯合后回輸。如此直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束。如果配套電腦程序控制，整個(gè)治療過程均由電腦控制，并可隨時(shí)檢測工作狀態(tài)，使用會(huì)更加方便、自動(dòng)化和安全。

10、吸附器的應(yīng)用效果驗(yàn)證：為了解吸附器的功效，本發(fā)明設(shè)計(jì)了簡易的測試方法：取所制備的抗Rh抗體，加入到經(jīng)100℃溶化后保溫在50℃?zhèn)溆玫?.0％瓊脂糖C1-4B中，混合后滴度為1∶300～500；取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管9支，分別吸取1.0％瓊脂糖C1-4B溶液至200mm刻度，冷卻后瓊脂糖成為半固體；購買浙江省中心血站新鮮冰凍血漿200mL，另購買Rh抗體(人抗D型血清干粉標(biāo)準(zhǔn)品，廣州聯(lián)泰生物技術(shù)有限公司)，以新鮮冰凍血漿配成1∶128、1∶256、1∶512抗體滴度，按常規(guī)RH(抗D)滴度檢測方法(參考說明書)，檢測確認(rèn)抗體滴度，稱為濾前(Rh)抗體，然后各取10ml濾前抗體分別注入3支血沉管的上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的含有抗Rh抗體的1.0％瓊脂糖C1-4B并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為濾后(Rh)抗體，按常規(guī)RH(抗D)滴度檢測方法確認(rèn)滴度，再分別將濾后抗體經(jīng)含有抗Rh抗體的1.0％瓊脂糖血沉管濾出，如此重復(fù)3次濾過及抗體滴度檢測，結(jié)果(表1)說明，Rh抗體濾過簡易吸附器后，部分Rh抗體已被相應(yīng)的抗Rh抗體吸附，經(jīng)第1次、第2次、第3次濾過后，Rh抗體的平均滴度分別從濾前的1∶298降為濾后的1∶149、1∶48、1∶17，說明隨著濾過次數(shù)的增加，Rh抗體會(huì)不斷地被清除，從而達(dá)到降低Rh抗體滴度而治療母胎血型不合溶血病的目的。

表1 Rh抗體濾過含有抗Rh抗體的1.0％瓊脂糖簡易吸附器前后滴度檢測結(jié)果(1/x)