本發(fā)明涉及丙泊酚在應(yīng)激性障礙及其相關(guān)疾病中的應(yīng)用，特別涉及小劑量丙泊酚在制備預(yù)防、緩解和/或治療創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙綜合征(Post-traumatic stress disorder，PTSD)藥物中的用途。

背景技術(shù)：

PTSD是指?jìng)€(gè)體親身經(jīng)歷或目擊重大創(chuàng)傷性事件之后，延遲出現(xiàn)并長(zhǎng)期存在的一種精神障礙，主要包括三大臨床癥狀：重復(fù)以往的創(chuàng)傷性事件、易激惹癥狀和逃避任何可以引起創(chuàng)傷性聯(lián)想的刺激。

PTSD最早在參戰(zhàn)老兵中發(fā)現(xiàn)，但是嚴(yán)重的自然災(zāi)難、恐怖襲擊、重大交通事故、暴力人身攻擊和重大流行性傳染病等事件均可導(dǎo)致PTSD的發(fā)生。2010年流行病學(xué)調(diào)查顯示：美國(guó)國(guó)民PTSD發(fā)生率為7-8％，美軍現(xiàn)役軍人發(fā)病率為14-16％；目前我國(guó)的PTSD的流行病學(xué)調(diào)查僅限于嚴(yán)重的自然災(zāi)害，如唐山地震后260例孤兒PTSD的發(fā)生率為12％，汶川地震3個(gè)月后災(zāi)民PTSD發(fā)生率為14.7％。近幾年來(lái)隨著社會(huì)壓力的增大、交通事故和自然災(zāi)難頻發(fā)，PTSD的發(fā)生率逐年增長(zhǎng)，嚴(yán)重影響社會(huì)的穩(wěn)定。目前PTSD發(fā)生率高，臨床治療效果差，給個(gè)體和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)，越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注。

最近研究表明：一氧化氮(nitric oxide，NO)及其信號(hào)通路是PTSD病理性恐懼記憶形成和海馬退行性變的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)捕食場(chǎng)景應(yīng)激模型所致的焦慮樣大鼠前額皮層和杏仁核腦區(qū)中神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neurons nitric oxide synthase，nNOS)表達(dá)增加，同時(shí)前額皮層腦區(qū)中NO的含量增加，分別阻斷前額皮層和額杏仁核腦區(qū)中NO信號(hào)通路可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物條件恐懼記憶缺失、線索性恐懼記憶障礙。另有研究發(fā)現(xiàn)，NO的過(guò)度釋放與PTSD神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)。NO可以調(diào)節(jié)成人神經(jīng)元的發(fā)生，尤其是海馬齒狀回顆粒層的nNos對(duì)神經(jīng)元的發(fā)生起著關(guān)鍵性的作用，敲除nNos基因的小鼠神經(jīng)元再生能力增強(qiáng)。綜上所述NO信號(hào)通路與PTSD、神經(jīng)元的可塑性密切相關(guān)。NO信號(hào)通路與PTSD、神經(jīng)元的可塑性密切相關(guān)。

對(duì)于PTSD的治療仍然以藥物治療為主，但是臨床上的一線用藥(5-HT重吸收抑制劑類(lèi))普遍存在：(1)有效率不好；(2)起效延遲；(3)長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)嚴(yán)重(性功能障礙和認(rèn)知功能障礙)，因此迫切需要研發(fā)安全有效的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的治療方法。

丙泊酚，臨床上常用的一種脂溶性高、短效的靜脈麻醉藥。由于其起效快、代謝迅速和長(zhǎng)期輸注無(wú)蓄積等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在被廣泛運(yùn)用于臨床。丙泊酚的臨床麻醉誘導(dǎo)劑量為2-3mg/kg(靜脈注射)，麻醉維持劑量為3-12mg/kg/h(靜脈泵入)。研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚除鎮(zhèn)靜作用外，還具有抗焦慮、抗驚厥、抗炎和腦保護(hù)等作用，丙泊酚可能具有潛在的抗PTSD的活性。

截止到目前為止，未見(jiàn)丙泊酚用于防治PTSD的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種小劑量丙泊酚在制備預(yù)防、緩解和/或治療應(yīng)激性障礙及其相關(guān)疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用。

所述的小劑量為口服劑量0.3-1.0mg/kg之間。

所述的應(yīng)激性障礙及其相關(guān)疾病選自急性應(yīng)激障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、適應(yīng)障礙。

所述的產(chǎn)品包括藥品、食品、保健品。

本發(fā)明在動(dòng)物模型上首次測(cè)試小劑量丙泊酚腹腔注射給藥預(yù)防和治療PTSD的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)：小劑量丙泊酚在PTSD模型動(dòng)物中具有顯著的抗焦慮的行為學(xué)效應(yīng)；顯著增加時(shí)間依賴(lài)敏化模型(Time-dependent sensitization，TDS)大鼠海馬腦區(qū)磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件(phospharylated cAMP response element bingding protein，P-CREB)和BDNF的表達(dá)、降低TDS大鼠海馬腦區(qū)iNOS、nNOS的表達(dá)；降低短暫電擊模型(foot-shock)小鼠海馬、皮層腦區(qū)NO的含量。本申請(qǐng)所用丙泊酚劑量為0.3和1.0mg/kg、腹腔注射，折算為靜脈注射，該劑量?jī)H相當(dāng)于臨床麻醉劑量的0.5-1.0％，不會(huì)影響小鼠、大鼠的自發(fā)活動(dòng)(即沒(méi)有產(chǎn)生任何的鎮(zhèn)靜或麻醉作用)。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：應(yīng)用TDS大鼠和foot-shock小鼠制備PTSD的動(dòng)物模型，模型制備后第2天起開(kāi)始給藥(0.1、0.3、1.0mg/kg，腹腔注射，1次/天)，并于丙泊酚給藥第9天進(jìn)行相應(yīng)動(dòng)物的行為學(xué)監(jiān)測(cè)和丙泊酚對(duì)PTSD防治作用的相關(guān)藥理學(xué)研究。

有益技術(shù)效果：小劑量丙泊酚具有顯著的抗PTSD的行為學(xué)效應(yīng)，其機(jī)理與丙泊酚調(diào)控NO信號(hào)通路、神經(jīng)元的可塑性有關(guān)；可用于預(yù)防緩解和/或治療應(yīng)激障礙，彌補(bǔ)傳統(tǒng)藥物的不足。

附圖說(shuō)明

圖1-1.丙泊酚在TDS模型大鼠的實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖1-2.丙泊酚對(duì)TDS模型大鼠自發(fā)活動(dòng)(站立次數(shù))的影響。

圖1-3.丙泊酚對(duì)TDS模型大鼠自發(fā)活動(dòng)(跨格數(shù))的影響。

圖1-4.丙泊酚對(duì)TDS模型大鼠僵住行為的影響。

圖1-5.丙泊酚對(duì)TDS模型大鼠高架十字迷宮行為(進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù))的影響。

圖1-6.丙泊酚對(duì)TDS模型大鼠高架十字迷宮行為(開(kāi)臂滯留時(shí)間)的影響。

圖1-7.丙泊酚對(duì)TDS模型大鼠Morris水迷宮的影響。

圖1-8.丙泊酚對(duì)TDS大鼠海馬區(qū)iNOS表達(dá)的影響。

圖1-9.丙泊酚對(duì)TDS大鼠海馬區(qū)nNOS表達(dá)的影響。

圖1-10.丙泊酚對(duì)TDS大鼠海馬區(qū)p-CREB表達(dá)的影響。

圖1-11.丙泊酚對(duì)TDS大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)的影響。

圖2-1.丙泊酚在短暫電擊模型小鼠的實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖2-2.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠自發(fā)活動(dòng)(站立次數(shù))的影響。

圖2-3.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠自發(fā)活動(dòng)(跨格數(shù))的影響。

圖2-4.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠第15天僵住時(shí)間的影響。

圖2-5.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠高架十字迷宮行為(進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù))的影響。

圖2-6.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠高架十字迷宮行為(開(kāi)臂滯留時(shí)間)的影響。

圖2-7.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠爬梯實(shí)驗(yàn)(爬梯數(shù))的影響。

圖2-8.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠爬梯實(shí)驗(yàn)(站立次數(shù))的影響。

圖2-9.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠皮層腦區(qū)表達(dá)NO的影響。

圖2-10.丙泊酚對(duì)短暫電擊模型小鼠海馬表達(dá)NO的影響。

圖3.丙泊酚對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)NO的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了小劑量丙泊酚在制備預(yù)防或治療創(chuàng)傷后應(yīng)激性障礙產(chǎn)品中的用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，通過(guò)適當(dāng)改進(jìn)而實(shí)現(xiàn)該發(fā)明。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換或改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講是顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明的方法及其應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例一：丙泊酚在TDS模型大鼠中的作用

一、主要方法

1.實(shí)驗(yàn)裝置：

電刺激幽閉箱(Med公司，型號(hào)：MED-VFC-NIR-M)

自發(fā)活動(dòng)箱

高架十字迷宮

水迷宮測(cè)試箱

小鼠爬梯

Victor3多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elmer公司；型號(hào)：2104)

電子分析天平(德國(guó)Sartrious公司)

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Napco公司；型號(hào)：5410)

細(xì)胞超凈工作臺(tái)(北京昌平半導(dǎo)體設(shè)備一廠；型號(hào)：JJT-1300)

離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；型號(hào)：TDZ4-WS)

倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠；型號(hào)：S2-D2)

恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；型號(hào)：THZ-C)

電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司；型號(hào)：HW.SY21-K)

手提式蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；型號(hào)：YX-2800)

Mill-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司；型號(hào)：Mill-Q)

熒光/化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司；型號(hào)：Fluorchem FC2)

電子分析天平(德國(guó)Sartrious公司；型號(hào)：BSA124S-CW)

超聲細(xì)胞和組織破碎儀(美國(guó)Sonic公司；型號(hào)：VCX-130)

冷凍型臺(tái)式大容量高速離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF公司；型號(hào)：5810)

蛋白電泳裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)

水平搖床(北京市六一儀器廠；型號(hào)：WD-9405)

垂直板電泳/電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠；型號(hào)：DYY-7C)

多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司)

2.藥品和試劑

2.1藥品

丙泊酚：購(gòu)自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：16EL201，規(guī)格：20ml、0.2g。鹽酸舍曲林片：輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H1098014，規(guī)格：50mg。

2.2試劑

一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天生物科技有限公司；編號(hào)：S0021)

Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物科技有限公司；編號(hào)：P0013)

丙泊酚(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司；批號(hào)：16EL201；規(guī)格：20ml 0.2g)

S-亞硝基乙酰青霉胺(SNAP；美國(guó)Sigma公司；貨號(hào)：N3398)

2.7-二氯氫化熒光素(DCFH-DA；美國(guó)Sigma公司；貨號(hào)：D6883)

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)

乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(LDH試劑盒；碧云天生物技術(shù)研究所；貨號(hào)：C0017

胎牛血清(美國(guó)Gibco公司；貨號(hào)：10099-141)

胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)

C6細(xì)胞(膠質(zhì)瘤細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所

Anti-iNos(美國(guó)abcam公司；貨號(hào)：ab3523)

Anti-nNos(美國(guó)abcam公司；貨號(hào)：ab16650)

Anti-CREB(美國(guó)Millipore公司；貨號(hào)：06863)

Phospho-CREB(美國(guó)Cell Signaling公司；貨號(hào)：9198s)

Anti-BDNF(美國(guó)abcam公司；貨號(hào)：ab6201)

Anti-beta Actin(北京中杉金橋；貨號(hào)：TA-09)

辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中衫金橋；貨號(hào)：ZB-2301)

辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京中衫金橋；貨號(hào)：ZB-2305)

Immobilon Western(美國(guó)Millipore公司；貨號(hào)：P36599)

蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo scientific；貨號(hào)：23227)

分子量預(yù)染蛋白Marker(美國(guó)Thermo scientific；貨號(hào)：26616)

RIPA裂解緩沖液(普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號(hào)：C1053)

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

TDS模型：Wistar大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重180-200g，60只，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均分籠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，06：00-18：00光照，自由進(jìn)食、水，溫度18-24℃，濕度50±10％，動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)7天。

4.實(shí)驗(yàn)分組和給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組，每組12只，分為空白對(duì)照組(con)，模型對(duì)照組(ver)，模型+舍曲林(Ser，15mg/kg，灌胃，i.g.)，模型+丙泊酚(0.1、0.3、1.0mg/kg，腹腔注射，i.p.)，模型制備后第2天起開(kāi)始給藥，給藥體積為0.2ml/100g，1次/天。丙泊酚：購(gòu)自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：16EL201，規(guī)格：20ml 0.2g。鹽酸舍曲林片：輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H1098014，規(guī)格：50mg。

5.實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1-1。

6.動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)及生化指標(biāo)測(cè)定

(1)行為學(xué)表現(xiàn)包括：自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)，僵住時(shí)間的測(cè)試(freezing time test)，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(the elevated plus-maze test，EPM)。

(2)生化指標(biāo)測(cè)定包括：TDS模型大鼠海馬腦區(qū)NOS表達(dá)測(cè)定，TDS模型大鼠海馬腦區(qū)iNOS表達(dá)測(cè)定。

二、主要結(jié)果

1.給藥第9天進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)測(cè)試，與對(duì)照組比較，模型組，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚治療組的站立次數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-2)和跨格數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-3)均無(wú)顯著性的差異：顯示各處理因素?zé)o中樞興奮或抑制作用，不影響后續(xù)的行為學(xué)分析。

2.給藥第11天進(jìn)行僵住時(shí)間的測(cè)試，與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.3和1.0mg/kg)治療組顯著縮短TDS大鼠的僵住時(shí)間(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-4，***表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001，###表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001)，表明丙泊酚對(duì)TDS大鼠的焦慮行為有治療作用。

3.給藥第14天進(jìn)行高架十字迷宮的測(cè)試，與模型組比較，舍曲(15mg/kg)和丙泊酚(0.3和1.0mg/kg)治療組顯著增加TDS大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-5，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，###表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001)和在開(kāi)臂滯留時(shí)間的百分比(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-6，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，###表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001)，表明丙泊酚對(duì)TDS大鼠的焦慮行為有治療作用。

4.給藥第15天Morris水迷宮測(cè)試，與對(duì)照組比較，模型組，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚治療組大鼠的逃避潛伏期無(wú)顯著性的差異，表明TDS、舍曲林和丙泊酚對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶均無(wú)顯著顯著影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢圖1-7。

5.蛋白免疫印跡結(jié)果顯示丙泊酚顯著降低TDS大鼠海馬腦區(qū)iNOS、nNOS的表達(dá)。與對(duì)照組比較，TDS大鼠海馬腦區(qū)iNOS(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-8，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)和nNOS(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-9，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)的表達(dá)顯著增加；與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.1、0.3和1.0mg/kg)顯著降低海馬腦區(qū)iNOS(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-8，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)和nNOS的表達(dá)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-9，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)，表明丙泊酚具有抑制TDS大鼠海馬腦區(qū)iNOS、nNOS的表達(dá)的作用，從而調(diào)控NO信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。

6.TDS大鼠海馬腦區(qū)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定P-CREB和BDNF的表達(dá)，與對(duì)照組比較，TDS大鼠海馬腦區(qū)P-CREB(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-10，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)和BDNF(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-11，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)的表達(dá)顯著降低；與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.1、1.0mg/kg)顯著增加海馬腦區(qū)P-CREB(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-10，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，##表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01)和BDNF(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-11，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，##表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01)的表達(dá)，表明丙泊酚通過(guò)對(duì)在神經(jīng)元突觸的可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)發(fā)揮作用，從而減輕應(yīng)激所致的海馬神經(jīng)元的再生障礙。實(shí)施例二：丙泊酚對(duì)foot-shock模型中的作用

一、主要方法

1.實(shí)驗(yàn)裝置

電刺激幽閉箱(Med公司，型號(hào)：MED-VFC-NIR-M)

自發(fā)活動(dòng)箱

高架十字迷宮

水迷宮測(cè)試箱

小鼠爬梯

2.藥品和試劑

2.1藥品

丙泊酚：購(gòu)自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：16EL201，規(guī)格：20ml 0.2g鹽酸舍曲林片：輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H1098014，規(guī)格：50mg

2.2分子生物學(xué)藥品和試劑

一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天生物科技有限公司；編號(hào)：S0021)

Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物科技有限公司；編號(hào)：P0013)

丙泊酚(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司；批號(hào)：16EL201；規(guī)格：20ml 0.2g)

S-亞硝基乙酰青霉胺(SNAP；美國(guó)Sigma公司；貨號(hào)：N3398)

2.7-二氯氫化熒光素(DCFH-DA；美國(guó)Sigma公司；貨號(hào)：D6883)

DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)

乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(LDH試劑盒；碧云天生物技術(shù)研究所；貨號(hào)：C0017

胎牛血清(美國(guó)Gibco公司；貨號(hào)：10099-141)

胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)

C6細(xì)胞(膠質(zhì)瘤細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所

Anti-iNos(美國(guó)abcam公司；貨號(hào)：ab3523)

Anti-nNos(美國(guó)abcam公司；貨號(hào)：ab16650)

Anti-CREB(美國(guó)Millipore公司；貨號(hào)：06863)

Phospho-CREB(美國(guó)Cell Signaling公司；貨號(hào)：9198s)

Anti-BDNF(美國(guó)abcam公司；貨號(hào)：ab6201)

Anti-beta Actin(北京中杉金橋；貨號(hào)：TA-09)

辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中衫金橋；貨號(hào)：ZB-2301)

辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京中衫金橋；貨號(hào)：ZB-2305)

Immobiion Western(美國(guó)Millipore公司：貨號(hào)：P36599)

蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo scientific；貨號(hào)：23227)

分子量預(yù)染蛋白Marker(美國(guó)Thermo scientific；貨號(hào)：26616)

RIPA裂解緩沖液(普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號(hào)：C1053)

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，SPF級(jí)，體重18-20g，60只，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均分籠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，06：00-18：00光照，自由進(jìn)食、水，溫度18-24℃，濕度50±10％，動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)7天。

4.實(shí)驗(yàn)分組和給藥

根據(jù)體重隨機(jī)分為6組，每組10只，分為空白對(duì)照組(con)，模型對(duì)照組(ver)，模型+舍曲林(ser，15mg/kg，灌胃，i.g.)，模型+丙泊酚(0.1、0.3、1.0mg/kg，腹腔注射，i.p.)，第一天電擊5min之后開(kāi)始給藥，給藥體積為0.02ml/g，1次/天。丙泊酚：購(gòu)自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：16EL201，規(guī)格：20ml 0.2g。鹽酸舍曲林片：輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H1098014，規(guī)格：50mg。

5.實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖2-1。

6.foot-shock模型小鼠行為學(xué)表現(xiàn)及生化指標(biāo)測(cè)定。

(1)行為學(xué)表現(xiàn)包括：自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)，僵住時(shí)間的測(cè)試(freezing time test)，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(the elevated plus-maze test，EPM)，小鼠的爬梯實(shí)驗(yàn)(the staircase test)。

(2)生化指標(biāo)測(cè)定包括：foot-shock模型小鼠海馬和皮層腦區(qū)NO表達(dá)測(cè)定。

二、主要結(jié)果

1.給藥第10天進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)測(cè)試，與對(duì)照組比較，模型組，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚治療組的站立次數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-2)和跨格數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-3)無(wú)顯著性的差異，表明丙泊酚對(duì)foot-shock小鼠自發(fā)活動(dòng)的無(wú)影響。

2.給藥第15天進(jìn)行僵住時(shí)間的測(cè)試，與對(duì)照組比較，foot-shock小鼠的僵住時(shí)間顯著增加(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-4，**表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01＝表明foot-shock模型中，小鼠產(chǎn)生顯著的恐懼，僵住時(shí)間的增加；與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.3和1.0mg/kg)顯著縮短foot-shock小鼠的僵住時(shí)間(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-4，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，##表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01，###表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001)，表明丙泊酚可以顯著逆轉(zhuǎn)上述小鼠的行為，表現(xiàn)為顯著減輕動(dòng)物的空間行為。

3.給藥第13天進(jìn)行高架十字迷宮的實(shí)驗(yàn)，與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.3和1.0mg/kg)顯著增加foot-shock小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-5，**表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01，##表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01，###表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001)和在開(kāi)臂滯留時(shí)間的百分比(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-6，**表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01，##表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01)，表明丙泊酚現(xiàn)在境地了應(yīng)激動(dòng)物處于新異環(huán)境下時(shí)焦慮程度。

4.給藥第14天進(jìn)行爬梯實(shí)驗(yàn)，各組之間的爬梯數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-7)均無(wú)顯著性的差異；與對(duì)照組比較，與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.3和1.0mg/kg)顯著降低foot-shock小鼠的站立次數(shù)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-8，**表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01，##表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01，###表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001)；表明丙泊酚可以顯著減輕了動(dòng)物的恐懼行為。

5.foot-shock小鼠皮層腦區(qū)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定NO含量，與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.3和1.0mg/kg)顯著降低foot-shock小鼠皮層腦區(qū)中NO的含量(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-9，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)，表明丙泊酚具有抑制foot-shock小鼠皮層腦區(qū)NO的表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用，從而通過(guò)降低NO的過(guò)度表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。

6.foot-shock小鼠海馬腦區(qū)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定NO含量，與模型組比較，舍曲林(15mg/kg)和丙泊酚(0.1、0.3和1.0mg/kg)顯著降低foot-shock小鼠海馬腦區(qū)中NO的含量(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-7，*表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，#表示與模型組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05)，表明丙泊酚具有抑制foot-shock小鼠皮層腦區(qū)NO的表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用，從而通過(guò)降低NO的過(guò)度表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。

實(shí)施例三、丙泊酚對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NO含量的影響

(一)主要方法

1、藥物的配置

(1)丙泊酚：丙泊酚：10mg/ml，即0.01mg/ul，取4ul丙泊酚稀釋到200ul為0.0002mg/ul(A)(以下是一個(gè)孔的劑量)。

(2)S-亞硝基乙酰青霉胺(SNAP)：SNAP25mg加入1.25ml的二甲基亞砜助溶再加入1.25ml水(A0.01mg/ul)。

(3)2.7-二氯氫化熒光素(DCFH-DA)：配成濃度0.1mmol/l的濃度，每個(gè)孔中的總體積為101ul，根據(jù)公式mmol/L＝mg/M可以得出每個(gè)孔中的DCFH-DA的劑量為0.0049216mg，如果這些劑量是取1ul得來(lái)，則DCFH-DA的濃度應(yīng)為4.9216mg/ml，因此稱(chēng)取5mg的DCFH-DA溶于甲醇中。

2.丙泊酚對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞NO生成的測(cè)定

細(xì)胞種板后，第二天換培養(yǎng)基(分別含有2.0、6.0、8.0、20ug/ml的丙泊酚)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-15min中換培養(yǎng)基(分別含有1.0mmol/LSNAP；1.0mmol/LSNAP+2.0ug/ml丙泊酚；1.0mmol/LSNAP+6.0ug/ml丙泊酚；1.0mmol/LSNAP+8.0ug/ml丙泊酚+1.0mmol/LSNAP；20ug/ml丙泊酚)100ul培養(yǎng)。18個(gè)小時(shí)之后，吸去96孔板中培養(yǎng)基，各孔再中加入含100ummol/L 2.7-二氯氫化熒光素(DCFH-DA)的培養(yǎng)基101ul，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。然后吸去個(gè)孔中的培養(yǎng)基，用不含有藥品的培養(yǎng)基清洗個(gè)孔2-3次之后，個(gè)孔中加入200ul的培養(yǎng)基后進(jìn)行細(xì)胞的分光光度計(jì)照射。

(二)主要結(jié)果

與對(duì)照組比較，SNAP(1.0mM)顯著增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞生成NO的量，丙泊酚(6.0和8.0ug/ml)顯著降低SNAP模型膠質(zhì)瘤細(xì)胞生成NO的量，表明丙泊酚可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞NO的釋放(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，***表示與空白對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.001，#表示與SNAP組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.05，##表示與SNAP組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)P值＜0.01)。

綜上所述，小劑量丙泊酚劑量為0.3-1.0mg/kg、腹腔注射，折算為靜脈注射，該劑量?jī)H相當(dāng)于臨床麻醉劑量的0.5-1.0％，不會(huì)影響小鼠、大鼠的自發(fā)活動(dòng)(即沒(méi)有產(chǎn)生任何的鎮(zhèn)靜或麻醉作用)。此種劑量丙泊酚具有減輕PTSD模型動(dòng)物恐懼、焦慮、學(xué)習(xí)記憶損傷的作用，并可以減少?gòu)?qiáng)烈應(yīng)激導(dǎo)致的iNOS、eNOS的表達(dá)，增加可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，顯著降低模型膠質(zhì)瘤細(xì)胞NO的釋放等特點(diǎn)。小劑量丙泊酚可用于預(yù)防、緩解和/或治療應(yīng)激障礙相關(guān)疾病如急性應(yīng)激障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等疾病。