本發(fā)明涉及匹諾塞林化合物在藥物制備中的新應(yīng)用，主要涉及匹諾塞林在制備治療出血性腦卒中和溶栓藥物引起的腦出血副作用中的應(yīng)用，特別涉及匹諾塞林在制備腦栓塞發(fā)病后的出血性轉(zhuǎn)化和因溶栓藥物引起的腦血管意外藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦栓塞是指腦血管因各種因素如血液中的各種栓子(如心臟內(nèi)的附壁血栓、動脈粥樣硬化的斑塊等)隨血流進(jìn)入腦動脈或由于血管具備栓塞而阻塞血管，引起該動脈供血區(qū)腦組織缺血性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)局灶性的神經(jīng)缺損。

臨床治療腦栓塞的關(guān)鍵措施之一是解除血管栓塞，恢復(fù)缺血區(qū)血液供應(yīng)。因此，溶栓治療成為臨床治療急性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前正式批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的藥物非常有限，美國FDA于1996年批準(zhǔn)使用重組組織型纖維蛋白酶原激活劑(tissue plasminogen activator,t-PA)進(jìn)行溶栓治療急性腦梗死，到目前為止，t-PA溶栓治療仍是國際公認(rèn)的唯一的藥物治療方式。

溶栓治療是急性腦缺血治療的重大突破，有效降低了發(fā)病致死率，挽救了急性腦缺血病人的生命。但是，使用tPA治療，臨床很容易表現(xiàn)出強烈的副作用，即出血性轉(zhuǎn)化(hemorrhagic transformation，HT)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死后由于栓子遷移引起的自發(fā)性HT的發(fā)生率為24％～71％，應(yīng)用tPA或鏈激酶溶栓后，這一機率會提高2-3倍。HT的發(fā)生會直接危及患者的生命，截至目前臨床上尚無有效降低HT發(fā)生幾率或緩解出血程度的藥物。因此，通過尋找減小再灌注對血管的損傷以達(dá)到抑制腦出血的藥物，是緩解腦血管意外，改善卒中患者預(yù)后，治療缺血性卒中和出血性卒中的藥物開發(fā)方向。

匹諾塞林是源于蜂膠的黃酮類天然產(chǎn)物，是基于多靶點網(wǎng)絡(luò)作用和神經(jīng)血管單元整合功能靶點作用理論，通過高通量篩選技術(shù)在數(shù)萬個化合物中篩選出來的活性化合物。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心采用高通量篩選技術(shù)，在數(shù)萬個化合物中將匹諾塞林篩選出來，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

匹諾塞林目前以治療缺血性腦卒中作為適應(yīng)癥進(jìn)行二期臨床研究。臨床前研究結(jié)果表明，匹諾塞林通過促進(jìn)環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化、AGER受體和血管內(nèi)皮細(xì)胞等主要靶點，在永久性腦缺血、暫時性腦缺血、缺血再灌注、慢性腦缺血、急性全腦腦缺血、全腦彌散性腦缺血等多種動物腦缺血模型中均顯示出很好的抗腦缺血作用。同時可以提升缺血腦區(qū)的血流灌注量并改善行為學(xué)癥狀和學(xué)習(xí)記憶能力，對急性腦缺血損傷后神經(jīng)血管單元及其各種組分發(fā)揮綜合腦保護(hù)作用。但至今未見匹諾塞林在制備抗腦出血藥物中的應(yīng)用報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供匹諾塞林在制備抗腦出血藥物，特別是用于制備腦栓塞發(fā)病后的出血性轉(zhuǎn)化和因溶栓藥物等因素引起的腦微血管出血中的應(yīng)用，從而為腦栓塞的溶栓治療提供一種降低HT發(fā)生風(fēng)險，提高患者生存幾率并改善預(yù)后的解決辦法。

為此，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了匹諾塞林在制備抗腦出血藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述匹諾塞林與藥學(xué)上可接受的載體按照常規(guī)制劑方法制成各種劑型的抗腦出血藥物；

進(jìn)一步，所述匹諾塞林與藥學(xué)上可接受的載體按照常規(guī)制劑方法制成注射劑型的抗腦出血藥物，與溶栓藥物聯(lián)合使用。

本發(fā)明因此還涉及以本發(fā)明化合物作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備?？赏ㄟ^將本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動物使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95％重量。

本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。

給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。

本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。

為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。

還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。

為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。

為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環(huán)糊精等；pH調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。

此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。為達(dá)到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-250mg/Kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。

本發(fā)明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整它的劑量。

本發(fā)明的有益效果在于：采用大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型，對匹諾塞林抗腦出血，特別是防止腦栓塞發(fā)病后的出血性轉(zhuǎn)化和因溶栓藥物等因素引起的腦微血管出血作用進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，通過與tPA聯(lián)合使用，匹諾塞林能夠顯著降低在大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型的tPA溶栓過程中出現(xiàn)的血管損傷，減少伊文氏藍(lán)及血紅蛋白在缺血腦組織中的滲出量。降低大鼠接受溶栓治療后48h內(nèi)的死亡率，具有顯著的血管保護(hù)作用，可以在溶栓治療中與溶栓藥物共同使用以降低HT發(fā)生風(fēng)險或緩解出血程度。因而適用于制備與tPA及同類溶栓藥物聯(lián)合使用的復(fù)方制劑。

此外，目前溶栓藥物臨床應(yīng)用的主要制約因素是有效時間窗較窄，一般3-4.5個小時，究其時間窗較窄的原因，并不是藥物的溶栓活性降低，而是與其栓塞時間延長缺血區(qū)出血傾向有關(guān)，使用匹諾塞林可以治療出血傾向，有可能延長溶栓藥物的有效治療時間窗。

附圖說明

圖1.匹諾塞林(10mg/kg)對大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型延遲6h進(jìn)行tPA溶栓治療后腦組織伊文氏藍(lán)含量的影響。n＝5。

圖2.匹諾塞林(10mg/kg)對大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型延遲6h進(jìn)行tPA溶栓治療后腦組織血紅蛋白含量的影響。n＝5。

圖3.匹諾塞林(10mg/kg)對大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型延遲6h進(jìn)行tPA溶栓治療后48h內(nèi)死亡率的影響。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中：

定義：Pinocembrin為匹諾塞林

實施例1.匹諾塞林注射劑按照以下方法制備。(1)將匹諾塞林原料粉碎，過100目篩，備用；(2)稱取處方量的羥丙基-β-環(huán)糊精，加700ml注射用水?dāng)嚢枞芙猓?3)加入0.5％(g/ml)注射用活性炭，保持微沸30分鐘，過濾脫炭；(4)稱取處方量的匹諾塞林，于室溫下加入上述羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中；(5)在攪拌狀態(tài)下緩慢滴加10％氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)并保持溶液pH值在8.4～8.5之間，攪拌大約4小時，直至匹諾塞林全部溶解；(6)加注射用水至1000ml，攪勻；(7)加入0.05％(g/ml)注射用活性炭，室溫下攪拌30分鐘，過濾；(8)分別用0.45μm和0.22μm微孔濾膜除菌過濾，用HPLC測定濾液匹諾塞林含量后，分裝入按標(biāo)準(zhǔn)程序洗滌、干燥后的7ml西林瓶中。(9)按照真空冷凍干燥程序進(jìn)行干燥，凍干周期約30小時。(10)加塞，壓蓋，軋鋁塑蓋；抽樣檢驗，合格后，貼簽，即得成品。使用時以生理鹽水溶解使用。

實施例2.匹諾塞林降低大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型的tPA溶栓過程中的伊文氏藍(lán)染料在腦組織中的滲出。

實驗材料：Sprague Dawley(SD)大鼠購自維通利華(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。tPA購自勃林格殷格翰(Boehringer-Ingelheim，Germany)。匹諾塞林注射劑(10mg)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所吳松課題組提供。注射時加入注射用生理鹽水(石家莊制藥四廠)1mL,按劑量10mg/kg使用。注射劑避光凍存于-20℃冰箱。

使用體重范圍250-300g的SD大鼠，通過腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)將其麻醉。剃去前囟附近毛發(fā)，剪開頭頂部皮膚并暴露出前囟。選取前囟后2mm，右側(cè)5mm作為腦血流測定點，定位并固定激光多普勒血流儀探頭座。仰臥位固定在鼠板上，穩(wěn)定PU讀數(shù)后記錄5min內(nèi)血流基準(zhǔn)值。

切開大鼠頸部皮膚，分離頸總動脈與頸外動脈，使用動脈夾夾閉頸外動脈。將頸總動脈放入YLS-14B小動物血栓生成儀的血管電刺激夾的溝槽內(nèi)，選擇電流強度1.00mA，刺激時間225s進(jìn)行電擊。電擊結(jié)束后，用動脈夾夾閉遠(yuǎn)心端頸總動脈。用軟頭鑷由遠(yuǎn)心端至近心端夾碎血栓。放開動脈夾，見到血栓碎片沖走后1-5s，再次夾閉頸總動脈近心端15min后，取下所有動脈夾并消毒縫合，此時血流值下降至基準(zhǔn)值的30％以下時，視為形成目的栓塞模型?？p合后將大鼠置于37℃恒溫系統(tǒng)中。

隨后根據(jù)實驗設(shè)計，將大鼠置于37℃恒溫系統(tǒng)中6h后，于頸外靜脈推注藥，每次推注時間2min。聯(lián)合用藥組在推注tPA前5min推注匹諾塞林。

實驗分組：空白組(除電擊操作，其余與模型組相同)，n＝5；模型組(造模后6h推注生理鹽水)，n＝5；tPA組(造模6h后按1mg/kg推注tPA)，n＝5；匹諾塞林組(造模6h后按10mg/kg推注匹諾塞林)，n＝5；聯(lián)合用藥組(造模6h后按10mg/kg推注匹諾塞林，1mg/kg推注tPA，n＝5。

結(jié)果：推注tPA前對大鼠注射4％伊文氏藍(lán)100μl，1h后使用含有肝素(0.16mg/ml)的生理鹽水對大鼠心臟灌流，取腦組織勻漿后測定其在620nm處的吸光度。結(jié)果見圖1，tPA組中不論是缺血側(cè)還是非缺血側(cè)，其大鼠腦組織勻漿在620nm處的吸光度均顯著高于模型組。而在匹諾塞林組和聯(lián)合用藥組中，不論是否進(jìn)行tPA推注，其雙側(cè)腦組織勻漿在620nm處的吸光度均顯著低于tPA組，提示匹諾塞林能夠顯著降低伊文氏藍(lán)在腦組織中的滲漏。

表1.匹諾塞林(10mg/kg)對大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型延遲6h進(jìn)行tPA溶栓治療后腦組織伊文氏藍(lán)滲出量的影響(n＝5)。

實施例3.匹諾塞林降低大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型的tPA溶栓過程中的血紅蛋白在腦組織中的滲出。

動物造模及給藥方法同實施例2。取灌流后的腦組織勻漿加入血紅蛋白穩(wěn)定劑，在575nm處檢測吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織內(nèi)的血紅蛋白含量。結(jié)果見圖2，注射tPA后大鼠腦組織勻漿中的血液含量均出現(xiàn)升高趨勢。注射匹諾塞林后，不論是否進(jìn)行溶栓治療，其雙側(cè)腦組織勻漿內(nèi)血紅蛋白含量均顯著降低。提示匹諾塞林能夠顯著降低由tPA引起的出血現(xiàn)象。

表2.匹諾塞林(10mg/kg)對大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型延遲6h進(jìn)行tPA溶栓治療后腦組織血紅蛋白滲出量的影響(n＝5)。。

實施例4.匹諾塞林與tPA聯(lián)用降低大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型溶栓后48h內(nèi)的死亡率。

每組10只大鼠，造模及給藥方法同實施例2。栓塞6h后使用tPA(1mg/kg)進(jìn)行溶栓治療，如圖3所示，模型組10只大鼠在48h內(nèi)死亡7只。而當(dāng)溶栓前靜脈注射匹諾塞林(10mg/kg)后，48h內(nèi)的死亡大鼠數(shù)量降為3只，顯著低于包括模型組在內(nèi)的其它組別。

表3.匹諾塞林(10mg/kg)對大鼠血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型延遲6h進(jìn)行tPA溶栓治療后48h內(nèi)的死亡率影響(n＝10)。

綜上所述，本發(fā)明采用血管內(nèi)成栓急性腦卒中模型對匹諾塞林抗腦出血作用進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示：匹諾塞林能明顯抑制栓塞腦區(qū)的出血與tPA引起的血管通透性增加，可以減少血液在腦組織中的滲出，降低由延遲溶栓治療帶來死亡率升高。因此，匹諾塞林具有顯著的抗腦出血作用。以匹諾塞林為活性物質(zhì)，單獨使用或/與其他具有藥理學(xué)活性的化合物和/或提取物組成復(fù)方使用，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)制劑方法制成各種劑型的抗自發(fā)性腦出血藥物，或者與其它溶栓藥物如鏈激酶，尿激酶等制成復(fù)方制劑用于減小溶栓過程中的出血現(xiàn)象，可以為血栓性腦栓塞的溶栓治療提供一種更加高效與安全的解決辦法。

最后說明的是，以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。