本發(fā)明屬于牙齒再礦化，尤其涉及一種基于殼聚糖-無(wú)定形磷酸鈣的牙齒再礦化技術(shù)。

背景技術(shù)：

本申請(qǐng)涉及用于再礦化因齲齒和/或牙齒侵蝕等口腔狀況而流失礦物質(zhì)的牙齒的方法及其組合物。

齲齒(蛀牙)是一種流行性慢性疾病，影響著發(fā)達(dá)國(guó)家中的60%至90%在校學(xué)生，和多數(shù)成人。齲齒(蛀牙)是引起兒童住院治療、緊急監(jiān)護(hù)、全身麻醉的重要誘因。在美國(guó)，齲齒是童年時(shí)期最常見(jiàn)的慢性疾病。兒童齲齒的發(fā)病率(59%)是哮喘的發(fā)病率(11%)的6倍，是花粉過(guò)敏的發(fā)病率(8%)的8倍(美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部.美國(guó)口腔健康：衛(wèi)生部長(zhǎng)報(bào)告(2000))。全國(guó)健康和營(yíng)養(yǎng)檢查調(diào)查的1999年至2004年的數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)28%的2周歲至5周歲兒童的乳牙患有齲齒，在過(guò)去的十年間齲齒發(fā)病率上升了15%((疾病預(yù)防控制中心周報(bào)54,1-44(2005),dye,b.a.；口腔健康趨勢(shì)：美國(guó)，1988-1994和1999-2004；重要健康統(tǒng)計(jì)11,1-92(2007))。齲齒治療相當(dāng)昂貴，占用了大致60%的年度口腔健康消費(fèi)，在發(fā)達(dá)國(guó)家占全部醫(yī)療費(fèi)用的6%或者個(gè)人醫(yī)療費(fèi)用的16%(經(jīng)濟(jì)合作組織.健康一覽,2009:經(jīng)合組織指標(biāo).(2009).)目前中國(guó)兒童患齲率約為80%，青年人患齲率約為60～70%，老年人患齲率約為52%，每個(gè)患者平均涉及2～3個(gè)牙齒，牙齦炎和牙周炎患病率也為70%。無(wú)論那一個(gè)年齡層，齲病都是口腔健康的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。

兒童時(shí)期的齲齒常常不被治療，因而加重患情并且導(dǎo)致許多嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括慢性疼痛，牙齒脫落，聽(tīng)力、吞咽、發(fā)聲、睡眠障礙，發(fā)育停滯，糟糕的在校表現(xiàn)、社交關(guān)系、自我認(rèn)知，甚至降低人生的成功率。由于疾病負(fù)擔(dān)、并發(fā)癥和負(fù)面社交結(jié)果，國(guó)家口腔和顱面研究所和美國(guó)兒科研究所將齲齒作為致力解決的焦點(diǎn)問(wèn)題以于減輕公眾健康差距。在過(guò)去的40年間，氟化物成為了預(yù)防齲齒的基石。在此期間，氟化物供應(yīng)源數(shù)量上升，目前已包括諸多來(lái)源，例如含氟牙膏、含氟凝膠以及其他治療性含氟產(chǎn)品。即便含氟產(chǎn)品在人們生活消費(fèi)中有如此高的普及率，氟化物在預(yù)防齲齒的作用已經(jīng)顯著達(dá)到平臺(tái)期，而溫和氟斑牙的發(fā)生率在過(guò)去的幾十年間顯著上升。含氟牙膏是最為廣泛使用的氟化物形態(tài)，但是傳統(tǒng)的含氟牙膏，只有其濃度不少于1000ppm時(shí)才具有顯著的預(yù)防齲齒效果。然而，如此高濃度氟化物的牙膏被小于6周歲特別是小于2周歲的兒童使用時(shí)，會(huì)增加患氟斑牙的危險(xiǎn)。出生后的頭兩年已經(jīng)被確認(rèn)為對(duì)早期萌發(fā)的切牙和第一恒磨牙等恒牙患氟斑牙與否至關(guān)重要(hong,l.,levy,s.m.,warren,j.j.,broffitt,b.&cavanaugh,j.永久性上頜骨中切牙和第一恒磨牙氟化物攝入量與氟斑牙發(fā)展相關(guān).cariesres40,494-500(2006).hong,l.etal.上頜骨中切牙氟化物攝入量時(shí)間與氟斑牙發(fā)展相關(guān).communitydentoralepidemiol34,299-309(2006).)因此，傳統(tǒng)的抗齲齒氟化物治療效果有其局限。

研究表明，含有鈣鹽和/或磷酸鹽的無(wú)氟局部用再礦化劑具有作為氟化物的替代物的潛力,或在低氟的情況下作為輔助物以增強(qiáng)氟化物的效果。這些再礦化劑對(duì)于兒童額外用好處，因?yàn)榻档土嘶挤哐赖奈ｋU(xiǎn)，也有利于預(yù)防齲齒。目前，酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣（cpp-acp）在臨床廣泛使用。盡管具有大量實(shí)驗(yàn)室及原位證據(jù)表明其有益，美國(guó)口腔協(xié)會(huì)(ada)和科學(xué)事務(wù)委員會(huì)(csa)對(duì)近期的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回顧并報(bào)道，這些現(xiàn)有證據(jù)不足以推薦任何礦物配方用于齲齒治療，包括基于酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣的產(chǎn)品(rethman,m.p.etal.無(wú)氟預(yù)防齲齒劑：基于證據(jù)的臨床推薦執(zhí)行總結(jié).jamdentassoc142,1065-1071(2011)).磷酸鈣(ca-p)已商業(yè)化地應(yīng)用于牙膏、口香糖、漆和漱口水。(zero,d.t.牙膏、漱口水和再礦化/齲齒抑制策略.bmcoralhealth6suppl1,s9(2006)).如何保持鈣離子和磷離子的生物可利用性，在有需要時(shí)提供牙齒以可利用的磷酸鈣是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，這阻礙了基于磷酸鈣的大規(guī)模產(chǎn)品在預(yù)防和控制齲齒的應(yīng)用。因此，當(dāng)牙齒被口腔細(xì)菌的酸性產(chǎn)物攻擊時(shí)，基于酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣的產(chǎn)品難以快速地在足夠限度為再礦化提供新鮮的無(wú)定形磷酸鈣。當(dāng)前的情況強(qiáng)烈地需求更好的鈣和磷輸送載體系統(tǒng)以滿足牙齒載礦化對(duì)鈣和磷的需求。

因此，為了預(yù)防和治療牙齒侵蝕和/或齲齒，特別是預(yù)防和治療兒童的牙齒侵蝕和/或齲齒，仍有必要提供相關(guān)的組合物及其方法。再礦化牙齒需要額外的和更有效的組合物及其方法。飽受牙齒侵蝕和/或齲齒困擾的患者亟需氟化物治療的替代選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為遭受牙齒礦物流失的患者提供有效預(yù)防和治療牙齒侵蝕和/或齲齒的新組合物及其方法。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，為牙齒再礦化提供一種組合物，所述組合物包含包封于聚合物的再礦化劑。

根據(jù)一個(gè)典型實(shí)施例，所述再礦化劑是一種聚合物微球和/或納米球，所述聚合物是一種天然的包括殼聚糖的生物聚合物。

根據(jù)另一個(gè)典型實(shí)施例，所述組合物是一種牙膏、凝膠、漆、乳液、密封膠和/或口香糖。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述組合物包括占組合物總質(zhì)量1%至10%的鈣和磷。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述再礦化劑鈣和/或磷包封在粒徑介于1μm至250μm或者1μm至100μm的微球。

根據(jù)一個(gè)典型實(shí)施例，所述組合物包含微球，微球包含殼聚糖和鈣鹽，或者殼聚糖和磷酸鹽，或者上述兩種元素的混合物，或者所述組合物包括一第一系列微球，其包含鈣鹽；和/或一第二系列微球，其包含磷酸鹽。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，包封有鈣鹽的所述微球和包封有磷酸鹽的所述微球以鈣磷比例為1:1至1:2混合。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，在人體口腔環(huán)境內(nèi)包封有鈣鹽的所述微球和包封有磷酸鹽的所述微球釋放出鈣離子及磷酸根離子而原位形成無(wú)定形磷酸鈣。所述無(wú)定形磷酸鈣能為牙齒的鈣離子和磷離子提供來(lái)源。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述組合物進(jìn)一步包含氟化鹽和/或木糖醇。根據(jù)一些實(shí)施例，所述組合物進(jìn)一步包含鈣鹽，其包括醋酸鈣，cacl2，乳糖酸鈣，抗壞血酸鈣，葡萄糖酸鈣，乳酸鈣，乙酰丙酮鈣，乳糖酸鈣，檸檬酸鈣，糖精鈣和/或山梨酸鈣。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，提供一種預(yù)防或者治療牙齒侵蝕的方法，所述方法為牙齒提供包封于聚合物的有效治療量的再礦化劑。其中所述再礦化劑為鈣鹽和/或磷鹽，聚合物為殼聚糖。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述再礦化劑被包封于微球和/或納米球。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述殼聚糖微球包含殼聚糖和鈣鹽，或者殼聚糖和磷鹽，或者上述二者的混合物。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，為口腔空間提供一種抗菌組合物，所述組合物包含殼聚糖組分，其摩爾質(zhì)量介于1kg/mol至10kg/mol。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，所述殼聚糖的摩爾質(zhì)量介于1kg/mol至10kg/mol。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，提供一種增強(qiáng)口腔抗菌活力的口用組合物的方法，所述方法包括添加殼聚糖組分，其摩爾質(zhì)量介于1kg/mol至10kg/mol。

根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，提供一種用于制備再礦化牙齒的口腔用組合物的方法，所述方法包括在第一系列殼聚糖微球內(nèi)包封鈣鹽，在第二系列殼聚糖微球內(nèi)包封磷酸鹽，以及混合所述第一系列殼聚糖微球和第二系列殼聚糖微球。

各個(gè)實(shí)施例的額加特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下說(shuō)明中被進(jìn)一步闡述，且在一定程度上從該描述可顯而易見(jiàn)，或者可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而認(rèn)識(shí)。各個(gè)實(shí)施例的目的和其他優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)以下說(shuō)明和權(quán)利要求的組件和組合予以闡明。

附圖說(shuō)明

通過(guò)以下描述、附加權(quán)利要求和附圖，將進(jìn)一步闡明所述實(shí)施例的各個(gè)方面、特征、益處和優(yōu)點(diǎn)。

圖1闡述了即刻形成的殼聚糖-無(wú)定形磷酸鈣的x射線的衍射圖樣及其物理外觀。

圖2闡述了利用無(wú)定形磷酸鈣治療前后的牙本質(zhì)表面的掃描電子顯微鏡圖像。

圖3闡述了不同摩爾質(zhì)量的殼聚糖對(duì)于細(xì)菌的抗菌效果。

圖4闡述了10kg/mol的殼聚糖(10k殼聚糖)對(duì)于不同口腔細(xì)菌的抗菌效果。

圖5闡述了在室溫下ca²⁺從殼聚糖/cacl2微球釋放。

圖6闡述了磷從由10k殼聚糖制備的殼聚糖/na2hpo4微球釋放的典型釋放曲線。

圖7闡述了所述兩種微球在釋放期間的釋放介質(zhì)的酸堿度。

圖8闡述了10,000g/mol(10k)殼聚糖，殼聚糖/na2hpo4微球和殼聚糖/cacl2微球的紅外光譜(ft-ir)。

圖9的圖像a闡述了負(fù)載有cacl2的殼聚糖微粒的掃描電子顯微鏡圖像(5000x放大倍率)，圖像b闡述了負(fù)載有cacl2的殼聚糖微粒的掃描電子顯微鏡圖像(100x放大倍率)。

圖10的圖像a闡述了負(fù)載有na2hpo4的殼聚糖微粒的掃描電子顯微鏡圖像(5000x放大倍率)，圖像b闡述了負(fù)載有na2hpo4的殼聚糖微粒的掃描電子顯微鏡圖像(100x放大倍率)。

圖11闡述了添加酸堿度為9.6的精氨酸溶液對(duì)，cacl2/殼聚糖微球懸浮液和na2hpo4/殼聚糖微球懸浮液的酸堿度改變。

圖12闡述了三組處理后的牙釉質(zhì)表面(包括contr,chi-acp和mi+的三個(gè)組)的元素分析結(jié)果。與所述陰性對(duì)照組(contr組，采用蒸餾去離子水處理)相比，chi-acp組的牙釉質(zhì)表面鈣含量(37.23±4.25wt%與33.89±3.28wt%)和鈣/磷質(zhì)量比(2.02±0.19與1.88±0.11)均顯著上升(見(jiàn)圖像a和圖像b）。與此同時(shí)，所述用mipasteplus處理的陽(yáng)性對(duì)照組(mi+組)的牙釉質(zhì)表面鈣含量(36.51±4.14wt%與33.89±3.28wt%)和鈣/磷質(zhì)量比(1.99±0.14與1.88±0.11)均略有上升。三個(gè)組中，牙釉質(zhì)表面磷含量從所述陰性對(duì)照組的17.97±0.82wt%略有上升到，所述陽(yáng)性對(duì)照組的18.30±0.80wt%，再到所述實(shí)驗(yàn)組的18.4±1.59wt%，在任何兩個(gè)組之間均不存在顯著差異(參見(jiàn)圖像c)。掃描電子顯微鏡圖像被用于觀測(cè)治療后牙釉質(zhì)的表面形態(tài)(參見(jiàn)附圖d,e和f)。三個(gè)組均未在牙釉質(zhì)表面觀測(cè)到明顯的沉積。

圖13闡述了由plm測(cè)定的處理后牙釉質(zhì)表面下的脫礦深度和再礦化厚度。圖像a闡述了脫礦深度，圖像b闡述了再礦化厚度。c,dande分別是三組(包括contr,chi-acp和mi+)典型的plm圖像。

圖14闡述了利用調(diào)整精氨酸鹽酸鹽和精氨酸游離堿的比例而改變兩種被測(cè)試的牙膏配方的酸堿度。

具體實(shí)施方式

齲齒（蛀牙）是世界范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的慢性疾病之一。由于細(xì)菌感染導(dǎo)致牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)脫礦或者被破壞。齲齒影響著發(fā)達(dá)國(guó)家中60%至90%的在校兒童和絕大多數(shù)成人(經(jīng)濟(jì)合作組織.健康一覽,2009:經(jīng)合組織指標(biāo).(2009))。一份報(bào)告的數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)28%的2周歲至5周歲兒童，其乳牙患有齲齒，在過(guò)去的十年間齲齒發(fā)生率上升了15%(美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部.美國(guó)口腔健康：衛(wèi)生部長(zhǎng)報(bào)告(2000).(疾病預(yù)防控制中心周報(bào)54,1-44(2005))。

牙齒侵蝕是牙齒礦物質(zhì)不可逆轉(zhuǎn)的流失，是沒(méi)有細(xì)菌介入的純化學(xué)過(guò)程。牙齒侵蝕可發(fā)生在乳牙和恒牙牙列，可能影響任何牙齒表面,尤以面向，咬合，和舌面為甚(bartlettdw,shahp.a非齲頸椎損傷和腐蝕及摩擦作用的嚴(yán)格審查.jdentres2006;85(4):306-12.williamsd,croucherr,marcenesw,o’farrellm.生活于英國(guó)倫敦倫敦塔橋和哈克尼地區(qū)的14周歲在校兒童的上頜骨切牙牙齒侵蝕發(fā)生率.intdentj1999;49(4):211-6)。

外源性酸或者內(nèi)源性酸致使侵蝕性損傷可能導(dǎo)致牙列不可逆轉(zhuǎn)的損傷。初始時(shí)鈣元素和磷元素流失致使牙齒表面軟化，最終導(dǎo)致牙齒結(jié)構(gòu)的明顯損失。牙齒侵蝕的臨床表現(xiàn)包括，在平滑的牙釉質(zhì)表面的寬槽，切牙透明度上升，以致負(fù)面的影響美觀。而且，牙釉質(zhì)流失導(dǎo)致牙本質(zhì)暴露和過(guò)敏反應(yīng)，甚至在一些極端案例中致使牙髓暴露。

牙齒侵蝕的流行病學(xué)研究報(bào)告，46%的13周歲至19周歲的兒童至少一顆牙齒被侵蝕，尤以上頜牙齒更為普遍(mcguirej,szaboa,jacksons,bradleyt.g.,okunseric.美國(guó)兒童的牙齒侵蝕:與種族/族裔和肥胖的關(guān)系.intjpeddent2009:19(2):91-8)。牙齒侵蝕在發(fā)達(dá)國(guó)家成為日益關(guān)注的問(wèn)題(nunnj.牙齒侵蝕的發(fā)病率和口腔健康的意義.eurjoralsci1996;104(2):156-161)。鑒于日益增長(zhǎng)的碳酸軟飲料和果汁飲料的消費(fèi)量，牙齒侵蝕的發(fā)病率和嚴(yán)重性日趨增加。

導(dǎo)致牙齒侵蝕的許多風(fēng)險(xiǎn)因素在過(guò)去已經(jīng)被研究確認(rèn)。例如，由貪食癥或者厭食癥引發(fā)嘔吐、胃食管反流病等特定條件。大量酗酒可能引發(fā)牙齒侵蝕。抗壞血酸、鹽酸、乙酰水楊酸也可能引發(fā)牙齒侵蝕。過(guò)量攝入或者過(guò)快攝入酸性水果、純果汁和酸性飲料也可引發(fā)牙齒侵蝕。其他可能的風(fēng)險(xiǎn)因素包括個(gè)人職業(yè)和非法使用毒品。

研究證實(shí)，兒童牙齒磨損的主要誘因是牙齒侵蝕(dugmorec,&rockw.牙齒侵蝕的多因素分析.brdentj2004;196(5):283-6)。在早期階段預(yù)防和治療牙齒侵蝕非常重要。牙齒侵蝕是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，當(dāng)發(fā)生時(shí)必須仔細(xì)評(píng)估。該狀況不可逆轉(zhuǎn)，除非情況得到處理否則可能延續(xù)至成人。嚴(yán)重的牙齒結(jié)構(gòu)損傷可能需要更多更廣泛的口腔治療。因此，及早預(yù)防和治療牙齒侵蝕非常重要。

牙齒侵蝕在乳牙和恒牙牙列期期間發(fā)生，可能影響任何牙齒表面,尤以面向，咬合，和舌面為甚(bartlettdw,shahp.a非齲頸椎損傷和腐蝕及摩擦作用的嚴(yán)格審查.jdentres2006;85(4):306-12.williamsd,croucherr,marcenesw,o’farrellm.生活于英國(guó)倫敦倫敦塔橋和哈克尼地區(qū)的14周歲在校兒童的上頜骨切牙牙齒侵蝕發(fā)生率.intdentj1999;49(4):211-6)。

因此，當(dāng)前需要能預(yù)防和治療患者的牙齒侵蝕的組合物及其方法，尤其是兒童。再礦化牙齒需要額外的更有效的組合物及其方法。遭受牙齒侵蝕困擾的患者亟需牙齒再礦化治療。牙釉質(zhì)流失可能導(dǎo)致牙本質(zhì)暴露和過(guò)敏反應(yīng)，甚至在一些極端案例中致使牙髓暴露。

再礦化

再礦化用于預(yù)防和治療齲齒是受到提倡鼓勵(lì)的。再礦化發(fā)生在礦物質(zhì)被添加到牙齒里以替代被消耗的牙齒礦物質(zhì)成分時(shí)。常見(jiàn)的再礦化劑之一是氟化物。其他幾種再礦化劑包括無(wú)定形磷酸鈣，三磷酸鈣，酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣，生物活性的磷硅酸鈣鈉鹽和復(fù)合精氨酸碳酸氫鹽碳酸鈣。除此之外，再礦化劑還包括鈣鹽，和/或磷酸鹽或者上述二者組合。基于磷酸鈣的再礦化產(chǎn)品作為無(wú)氟預(yù)防齲齒劑，可以給牙齒表面提供具有生物活性的及足夠的濃度的鈣離子和磷酸根離子，而以驅(qū)動(dòng)牙齒再礦化過(guò)程。然而，近期臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，需要更有效地輸送磷酸鈣以充分減少齲齒。

根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例，提供一種用于再礦化牙齒的組合物，所述組合物包含再礦化劑。根據(jù)一些實(shí)施例，所述鈣源再礦化劑包括氯化鈣、磷酸鈣、無(wú)定形磷酸鈣及其組合。根據(jù)一些實(shí)施例，所述磷源再礦化劑包括從磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸酪蛋白、酪蛋白及其消化物或者磷酸酪蛋白衍生物、無(wú)定形磷酸鈣及其組合。根據(jù)一些實(shí)施例，添加至所述組合物的所述再礦化劑的濃度介于0.001%至10%w/w,w/v或v/v。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，添加至所述組合物的再礦化劑的濃度為0.001%,0.005,0.010,0.015,0.020,0.025,0.030,0.035,0.040,0.045,0.050,0.055,0.060,0.065,0.070,0.075,0.080,0.085,0.090,0.095,0.10,0.15,0.20,025,0.30,0.35,0.40,0.45,0.50,0.55,0.60,0.65,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.95,1.0,1.05,1.10,1.15,1.20,1.25,1.30,1.35,1.40,1.45,1.50,1.55,1.60,1.65,1.70,1.75,1.80,1.85,1.90,1.95,2.0,2.05,2.10,2.15,2.20,2.25,2.30,2.35,2.40,2.45,2.50,2.55,2.60,2.65,2.70,2.75,2.80,2.85,2.90,2.95,3.0,3.05,3.10,3.15,3.20,3.25,3.30,3.35,3.40,3.45,3.50,3.55,3.60,3.65,3.70,3.75,3.80,3.85,3.90,3.95,4.0,4.05,4.10,4.15,4.20,4.25,4.30,4.35,4.40,4.45,4.50,4.55,4.60,4.65,4.70,4.75,4.80,4.85,4.90,4.95,5.0,5.05,5.10,5.15,5.20,5.25,5.30,5.35,5.40,5.45,5.50,5.55,5.60,5.65,5.70,5.75,5.80,5.85,5.90,5.95,6.0,6.05,6.10,6.15,6.20,6.25,6.30,6.35,6.40,6.45,6.50,6.55,6.60,6.65,6.70,6.75,6.80,6.85,6.90,6.95,7.0,7.05,7.10,7.15,7.20,7.25,7.30,7.35,7.40,7.45,7.50,7.55,7.60,7.65,7.70,7.75,7.80,7.85,7.90,7.95,8.0,8.05,8.10,8.15,8.20,8.25,8.30,8.35,8.40,8.45,8.50,8.55,8.60,8.65,8.70,8.75,8.80,8.85,8.90,8.95,9.0,9.05,9.10,9.15,9.20,9.25,9.30,9.35,9.40,9.45,9.50,9.55,9.60,9.65,9.70,9.75,9.80,9.85,9.90,9.95和10.0%w/w,w/v或v/v。

根據(jù)一些實(shí)施例，所述再礦化劑被包封于聚合物，鈣源和磷源分別包封以穩(wěn)定組合物。當(dāng)所述鈣源和所述磷源置于口腔環(huán)境時(shí)，鈣離子和磷酸根離子從聚合物釋放出而形成無(wú)定形磷酸鈣，為再礦化牙齒提供鈣離子和磷離子的來(lái)源。根據(jù)一些實(shí)施例，所述聚合物包括殼聚糖。根據(jù)另一些實(shí)施例，所述組合物包括納米球和/或微球。所述再礦化劑被包封于聚合物微球，其濃度從0.001%至7.5%或者從0.01%至1%或者從0.05%至2%或者2%至5%w/w,w/v或v/v。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述再礦化劑被包封于聚合物微球，其濃度為0.001%,0.005,0.010,0.015,0.020,0.025,0.030,0.035,0.040,0.045,0.050,0.055,0.060,0.065,0.070,0.075,0.080,0.085,0.090,0.095,0.10,0.15,0.20,025,0.30,0.35,0.40,0.45,0.50,0.55,0.60,0.65,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.95,1.0,1.05,1.10,1.15,1.20,1.25,1.30,1.35,1.40,1.45,1.50,1.55,1.60,1.65,1.70,1.75,1.80,1.85,1.90,1.95,2.0,2.05,2.10,2.15,2.20,2.25,2.30,2.35,2.40,2.45,2.50,2.55,2.60,2.65,2.70,2.75,2.80,2.85,2.90,2.95,3.0,3.05,3.10,3.15,3.20,3.25,3.30,3.35,3.40,3.45,3.50,3.55,3.60,3.65,3.70,3.75,3.80,3.85,3.90,3.95,4.0,4.05,4.10,4.15,4.20,4.25,4.30,4.35,4.40,4.45,4.50,4.55,4.60,4.65,4.70,4.75,4.80,4.85,4.90,4.95,5.0,5.05,5.10,5.15,5.20,5.25,5.30,5.35,5.40,5.45,5.50,5.55,5.60,5.65,5.70,5.75,5.80,5.85,5.90,5.95,6.0,6.05,6.10,6.15,6.20,6.25,6.30,6.35,6.40,6.45,6.50,6.55,6.60,6.65,6.70,6.75,6.80,6.85,6.90,6.95,7.0,7.05,7.10,7.15,7.20,7.25,7.30,7.35,7.40,7.45和/或7.50%w/w,w/v或v/v。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述再礦化劑的粒徑從1μm至100μm或者從5μm至100μm或者從100μm至200μm或者從1μm至200μm。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述再礦化劑的粒徑1,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,165,170,175,180,185,190,195和/或200μm。

根據(jù)另一些實(shí)施例，所述聚合物微球的粒徑從1μm至500μm或者從10μm至100μm或者從10μm至500μm。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述聚合物微球的粒徑從l,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,165,170,175,180,185,190,195,200,205,210,215,220,225,230,235,240,245,250,255,260,265,270,275,280,285,290,295,300,305,310,315,320,325,330,335,340,345,350,355,360,365,370,375,380,385,390,395,400,405,410,415,420,425,430,435,440,445,450,455,460,465,470,475,480,485,490,495和/或500μm。

根據(jù)一些實(shí)施例，所述組合物包括微球一，所述微球包含殼聚糖和鈣鹽，或者微球二，所述微球包含殼聚糖和磷元素。所述組合物進(jìn)一步包含第一微球和第二微球。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述含鈣微球和所述含磷微球按鈣磷比為1:1至1:2混合。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述含鈣微球和所述含磷微球按鈣磷比為1:1,1:2,1:3,1:4,4:1,3:1和/或2:1混合。

本申請(qǐng)所述組合物為牙膏、凝膠、漆、漱口水或者密封膠。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，所述組合物是牙膏。根據(jù)一些實(shí)施例，所述鈣源和所述磷源分別包封于各自的微球而在無(wú)水組合物中物理隔離。因此，所述含鈣微球和所述含磷微球穩(wěn)定所述鈣離子和所述磷離子以提供生物活性的磷酸鈣。

在含水的口腔環(huán)境，所述含鈣微球和所述含磷微球釋放所述鈣離子和所述磷離子而形成無(wú)定形磷酸鈣。所述無(wú)定形磷酸鈣的酸堿度為1至10或者1至6或者5至10。根據(jù)一些實(shí)施例，所述無(wú)定形磷酸鈣的酸堿度為1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。所述無(wú)定形磷酸鈣為鈣離子和磷離子提供來(lái)源以穿透牙齒并且?guī)椭例X再礦化。

根據(jù)另一些實(shí)施例，為預(yù)防或者治療牙齒侵蝕或者腐蝕提供一種方法，所述方法包含為牙齒提供有效治療量的被包封于聚合物的再礦化劑。

根據(jù)另一些實(shí)施例，提供一種制備用于再礦化牙齒的口腔用組合物的方法。所述方法包括包封鈣源于第一系列殼聚糖微球，包封磷源于第二系列殼聚糖微球于及混合所述第一系列微球和所述第二系列微球。

本組合物提供殼聚糖和無(wú)定形磷酸鈣，各組分為預(yù)防齲齒提供獨(dú)特且互補(bǔ)/協(xié)同效益。無(wú)定形磷酸鈣是一種固溶體并被轉(zhuǎn)化為磷灰石。本組合物通過(guò)無(wú)定形磷酸鈣技術(shù)為再礦化牙齒表面的微環(huán)境提供新鮮的鈣離子和磷離子。無(wú)定形磷酸鈣提供足夠的磷酸鈣以深度穿越牙齒的損傷主體。相比于其它復(fù)合磷酸鈣，所述無(wú)定形磷酸鈣的優(yōu)勢(shì)包括快速生成率，快速溶解率，高溶解度，快速轉(zhuǎn)化為磷灰石，適于深度穿越的微粒徑。本申請(qǐng)適于再礦化牙齒，還提供一種安全、生物兼容的組合物。兒童(小于等于2周歲)通常在刷牙期間可以安全地吞咽一些含殼聚糖和無(wú)定形磷酸鈣的牙膏。

所述殼聚糖鈣磷復(fù)合物可提供緩沖作用來(lái)中和酸性微環(huán)境。所述雙微球系統(tǒng)，將鈣源和磷源包封于不同的殼聚糖微球以物理隔離鈣離子和磷離子，具有獨(dú)特的供應(yīng)功效和穩(wěn)定性以獲得較長(zhǎng)的保質(zhì)期。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述殼聚糖鈣磷復(fù)合物具有6個(gè)月至2年的保質(zhì)期。根據(jù)一些實(shí)施例，所述殼聚糖鈣磷復(fù)合物的保質(zhì)期為6個(gè),7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或者24個(gè)月。

殼聚糖。

殼聚糖是一種幾丁質(zhì)的衍生物，節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼具有天然的生物聚合物穩(wěn)定性，例如甲殼類動(dòng)物（如螃蟹、龍蝦和對(duì)蝦）。殼聚糖的多糖結(jié)構(gòu)具有生物兼容性、生物降解性和天然抗菌性能。殼聚糖在食品行業(yè)被用于微生物抑制劑和提供鈣離子和磷離子的載體。不同于合成化學(xué)藥物，殼聚糖是安全的抗菌劑并可避免細(xì)菌耐藥性。根據(jù)本申請(qǐng)，殼聚糖微球作為供應(yīng)系統(tǒng)以在獨(dú)立微球內(nèi)封鈣離子和磷離子。在刷牙期間，形成足量新鮮的無(wú)定形磷酸鈣，磷酸鈣易于沉淀并再礦化羥基磷灰石晶體表面，有利于整個(gè)損傷主體（亞表層損傷）的均質(zhì)再礦化。具有生物粘合性的殼聚糖在牙齒表面形成一聚合物薄膜，作為無(wú)定形磷酸鈣的“蓄水池”并且擴(kuò)展再礦化。殼聚糖通過(guò)有效抑制引起牙齒侵蝕和/或齲齒的細(xì)菌而預(yù)防牙齒侵蝕和/或齲齒，尤其是摩爾質(zhì)量高的殼聚糖。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，提供一種適于口腔環(huán)境的抗菌組合物。所述組合物進(jìn)一步包括殼聚糖，其摩爾質(zhì)量為1kg/mol至10kg/mol，或者2kg/mol至5kg/mol，或者5kg/mol至10kg/mol。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述組合物進(jìn)一步包括殼聚糖，其摩爾質(zhì)量為1,2,3,4,5,6,7,8,9和/或10kg/mol。

根據(jù)一些實(shí)施例，高摩爾質(zhì)量的殼聚糖在酸堿度等于小于5的環(huán)境更為穩(wěn)定，低摩爾質(zhì)量的殼聚糖在酸堿度等于小于5的環(huán)境不太穩(wěn)定。根據(jù)一些實(shí)施例，酸性環(huán)境的酸堿度范圍介于2至6。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述低摩爾質(zhì)量殼聚糖的摩爾質(zhì)量范圍是1kg/mol至10kg/mol質(zhì)量單位。根據(jù)一些實(shí)施例，所述高摩爾質(zhì)量殼聚糖的摩爾質(zhì)量范圍是100kg/mol至200kg/mol。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述組合物進(jìn)一步包括殼聚糖，其摩爾質(zhì)量為100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199和/或200kg/mol。

根據(jù)一些實(shí)施例，殼聚糖的分子量范圍為100kg/mol至200kg/mol。殼聚糖的穩(wěn)定酸堿度范圍為2至6。殼聚糖是弱堿性（基本性質(zhì)），因此酸性環(huán)境有利于溶解殼聚糖并向牙齒供應(yīng)。低摩爾質(zhì)量的殼聚糖是水溶性的，溶解不需要低酸堿度。無(wú)論細(xì)菌或者化學(xué)有機(jī)酸使得口腔空間的酸堿度低于5時(shí)，容易致使齲齒和牙齒侵蝕。根據(jù)一些實(shí)施例，更高摩爾質(zhì)量的殼聚糖(如1000至5000kd或者2000至4000kd)適于這些口腔狀況。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述抗菌組合物減少和/或抑制10%至90%的細(xì)菌生長(zhǎng)。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述抗菌組合物減少和/或抑制細(xì)菌增速為10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94或95%。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，提供一種在口腔空間內(nèi)抗菌活性的方法。所述方法進(jìn)一步包括配給殼聚糖，其摩爾質(zhì)量為1kg/mol至10kg/mol，或者2kg/mol至5kg/mol，或者5kg/mol至10kg/mol。根據(jù)一些實(shí)施例，所述方法進(jìn)一步包括殼聚糖，其摩爾質(zhì)量為1,2,3,4,5,6,7,8,9和/或10kg/mol。根據(jù)一些實(shí)施例，被用于口腔空間的所述殼聚糖的濃度為0.1mg/ml至5mg/ml，或者1mg/ml至3mg/ml，或者1mg/ml至5mg/ml。根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，被用于口腔空間的所述殼聚糖的濃度為0.1,0.5,1.0,1.05,1.10,1.15,1.20,1.25,1.30,1.35,1.40,1.45,1.50,1.55,1.60,1.65,1.70,1.75,1.80,1.85,1.90,1.95,2.0,2.05,2.10,2.15,2.20,2.25,2.30,2.35,2.40,2.45,2.50,2.55,2.60,2.65,2.70,2.75,2.80,2.85,2.90,2.95,3.0,3.05,3.10,3.15,3.20,3.25,3.30,3.35,3.40,3.45,3.50,3.55,3.60,3.65,3.70,3.75,3.80,3.85,3.90,3.95,4.0,4.05,4.10,4.15,4.20,4.25,4.30,4.35,4.40,4.45,4.50,4.55,4.60,4.65,4.70,4.75,4.80,4.85,4.90,4.95和/或5.0mg/ml。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，牙齒再礦化比例為10%至90%。根據(jù)一些實(shí)施例，牙齒再礦化比例為30%至70%或者40%至60%。根據(jù)一些實(shí)施例，牙齒再礦化比例為10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99%。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施例，所述組合物減少已發(fā)蛀牙10%至90%。根據(jù)一些實(shí)施例，所述組合物減少已發(fā)蛀牙10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或99%。

示例。

以下將對(duì)于本發(fā)明特定實(shí)施例做出詳細(xì)說(shuō)明。盡管以下將通過(guò)結(jié)合闡述實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，但應(yīng)理解這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)于本發(fā)明的限制。相反，本發(fā)明意圖覆蓋任何由本發(fā)明附加權(quán)利要求涵蓋的代替方案、修正方案和等同方案。以下標(biāo)題并非限制任何公布，任何一個(gè)標(biāo)題包括的實(shí)施例可與其它任何一個(gè)標(biāo)題包括的實(shí)施例相結(jié)合以實(shí)施。

示例1：制備殼聚糖/無(wú)定形磷酸鈣的混合粉末。

提供一種用共沉淀制備殼聚糖無(wú)定形磷酸鈣混合的方法。用此法制備混合殼聚糖無(wú)定形磷酸鈣。簡(jiǎn)要地，將10mlcacl2溶液與15ml含1.7%殼聚糖(摩爾質(zhì)量5kg/mol,美國(guó)國(guó)際實(shí)驗(yàn)室)的k3po4，以鈣磷摩爾比例1.5攪拌混合。通過(guò)過(guò)濾搜集的沉淀，先后用30ml的2%氨溶液和40ml的100%乙醇沖洗后真空下干燥。通過(guò)x光衍射(參見(jiàn)附圖的圖1)確定形成了無(wú)定形磷酸鈣。

示例2：無(wú)定形磷酸鈣的再礦化作用。

研究確認(rèn)示例1中的無(wú)定形磷酸鈣有助于牙齒的再礦化過(guò)程。附圖的圖2展示出了無(wú)定形磷酸鈣的再礦化作用。對(duì)拔除的磨牙使用無(wú)定形磷酸鈣以再礦化。附圖圖2的圖像a，展示出了未經(jīng)治療的磨牙的腐蝕表面。無(wú)定形磷酸鈣治療有效地減少了牙小管的大小(附圖圖2，圖像b)。附圖圖2圖像c顯示，所述沉淀的高倍放大顯示納米聚焦體。

示例3：殼聚糖的抗菌活性。

殼聚糖是已知的抗菌材料。所述殼聚糖的抗菌活性用基于細(xì)菌代謝活性的xtt比色法測(cè)定。所述細(xì)菌包括s.sanguis,s.fecalis和s.mutans。所述殼聚糖的平均摩爾質(zhì)量為1kg/mol(1k),3kg/mol(3k),3kg/mol(5k)和10kg/mol(10k)。參見(jiàn)附圖的圖3，當(dāng)殼聚糖的摩爾質(zhì)量從1k增加至10k時(shí)，所述s.mutans的代謝活性和存活率降低。10k的殼聚糖抑制s.mutans的效果最佳。與對(duì)照組相比，經(jīng)10k殼聚糖處理的s.mutans的存活率僅為對(duì)照組的10%。與對(duì)照組相比，5k殼聚糖具有中等抑制作用，經(jīng)其處理的s.mutansd的存活率僅為對(duì)照組的55%。1k和3k殼聚糖無(wú)顯著的抗菌效果。殼聚糖的抗菌性能與其摩爾質(zhì)量有關(guān)，高摩爾質(zhì)量殼聚糖具有更好的抗菌性能?；趚tt比色法，10k殼聚糖具有對(duì)于s.mutans的最佳的抑制效果。

示例4：10k殼聚糖針對(duì)不同口腔細(xì)菌的抗菌活性。

采用三種引發(fā)齲齒的不同口腔細(xì)菌以測(cè)試所述10k殼聚糖的抗菌活性。參見(jiàn)附圖的圖4，10k殼聚糖對(duì)于s.mutans,s.fecalus和s.sanguis具有顯著抑制性。抗菌作用與濃度正相關(guān)。10k殼聚糖對(duì)于s.sanguisj(ic50=0.623mg/ml)具有最顯著的抑制性，其次為s.mutans(ic50=0.655mg/ml)和s.fecalus(ic50=0.986mg/ml)。

示例5：包含殼聚糖提供無(wú)定形磷酸鈣的牙膏的制備、優(yōu)選及性質(zhì)。

為增強(qiáng)輸送鈣離子和磷酸根離子，制備包含殼聚糖提供無(wú)定形磷酸鈣(具有生物活性磷酸鈣)的牙膏。采用噴霧-干燥方法將鈣鹽和磷酸鹽分別包封于不同的殼聚糖微球，形成原位殼聚糖無(wú)定形磷酸鈣微球。在使用時(shí)，鈣和磷酸根快速地從殼聚糖微球釋出并原位形成無(wú)定形磷酸鈣。這將增強(qiáng)鈣和磷酸根的生物利用性。殼聚糖通過(guò)增加無(wú)定形磷酸鈣的保留時(shí)間以進(jìn)一步提升其有效性。殼聚糖作為輸送載體，同時(shí)也作為一種抗菌劑。由于鈣離子和磷酸根離子分別被包封于不同的殼聚糖微球，該輸送系統(tǒng)僅在刷牙時(shí)激活生成無(wú)定形磷酸鈣。所述牙膏在儲(chǔ)存階段避免無(wú)定形磷酸鈣過(guò)早轉(zhuǎn)換為羥基磷灰石，從而顯著提升產(chǎn)品穩(wěn)定性、延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。據(jù)此目的，制備一種新穎的復(fù)合功能的包括混合無(wú)定形磷酸鈣微球的牙膏。

殼聚糖無(wú)定形磷酸鈣微球的制備和表征。

據(jù)此方法，用噴霧干燥機(jī)制備包含氯化鈣或磷酸鈉的兩種殼聚糖微球。制備溶有氯化鈣或磷酸鈉的殼聚糖。所述溶液采用帶0.77mm流體加壓霧化器的büchi-b190噴霧干燥機(jī)噴霧干燥。所述溶液的水和揮發(fā)性酸被氣流移除，同時(shí)收集得到懸浮于氣流的細(xì)顆粒。諸如給料速率、入口溫度、霧化氣流速率等參數(shù)將優(yōu)化以控制殼聚糖無(wú)定形磷酸鈣微球的性質(zhì)。

所述殼聚糖-氯化鈣微球和殼聚糖-磷酸納微球?qū)⒁遭}-磷摩爾比例1.5而混合。該混合微球在遇水時(shí)原位形成無(wú)定形磷酸鈣。

無(wú)定形磷酸鈣微球的表征。

(a)粒徑分析。微球懸浮于無(wú)水乙醇后，進(jìn)行激光衍射確定微球粒徑。

(b)鈣和磷的釋放曲線。殼聚糖微球懸浮于生理鹽水。在預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)采取釋放介質(zhì)樣品，鈣的濃度用鈣離子電極測(cè)量和磷的濃度將由比色法檢測(cè)試劑盒(biovisioninc,ca)確定。

(c)粉末x光衍射(xrd)。由粉末x光衍射確認(rèn)無(wú)定形磷酸鈣的生成。具有原位生成無(wú)定形磷酸鈣的殼聚糖微球與生理鹽水混合，收集、烘干和分析所得沉淀以確認(rèn)無(wú)定形磷酸鈣的形成。

制備含殼聚糖提供無(wú)定形磷酸鈣的牙膏。

在真空環(huán)境烘干的不含有任何有效成分(如氟化物)的標(biāo)準(zhǔn)牙膏將作為基礎(chǔ)配方牙膏。通過(guò)混合基礎(chǔ)配方牙膏、具有原位生成無(wú)定形磷酸鈣的殼聚糖微球，和適量甘油以制備含殼聚糖提供無(wú)定形磷酸鈣的牙膏。分別用鈣離子電極和比色法檢測(cè)試劑盒將用于評(píng)估鈣和磷的釋放曲線。

選擇合適濃度的殼聚糖、鈣鹽、磷酸鹽以及優(yōu)化給料速率有助于得到最優(yōu)粒徑。

示例6：含殼聚糖提供無(wú)定形磷酸鈣的牙膏的功效評(píng)估。

1.抗菌測(cè)試。

通過(guò)諸如xtt比色法、抑菌圈、菌落單位指數(shù)梯減實(shí)驗(yàn)等測(cè)試確認(rèn)口腔微生物對(duì)于殼聚糖的敏感性。

1.1xtt比色法。

重復(fù)xtt比色法以確定細(xì)菌的代謝活性。所述細(xì)菌包括s.sanguis,s.fecalis和s.mutans。10k殼聚糖將被用于測(cè)試。通過(guò)xtt比色法確認(rèn)濃度和治療時(shí)間對(duì)于細(xì)菌代謝活性的影響。

1.2抑菌圈。

抑菌圈被用于度量殼聚糖對(duì)于在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的口腔細(xì)菌的作用。所述細(xì)菌被均勻擦拭于培養(yǎng)板。浸漬有待測(cè)試復(fù)合物的濾紙盤被設(shè)置于瓊脂表面。所述復(fù)合物從濾紙盤擴(kuò)散進(jìn)入所述瓊脂。所述復(fù)合物濃度隨著離濾紙盤的距離的增加而降低。如果所述復(fù)合物在特定濃度對(duì)于細(xì)菌具有抑制作用，除了高于或者等同于該濃度瓊脂區(qū)域之外無(wú)菌落分布。因此，抑菌圈的尺寸將度量所述復(fù)合物的有效性：所述濾紙盤的凈區(qū)域越大，所述復(fù)合物越有效。

1.3cfulogreduction菌落單位指數(shù)梯減實(shí)驗(yàn)。

菌落單位指數(shù)梯減實(shí)驗(yàn)將用于s.sanguis,s.fecalis和s.mutans。該測(cè)試將度量殼聚糖的殺菌能力。通過(guò)搜集測(cè)試微生物再梯度稀釋其于mrd制備包含10⁴fcu/ml的測(cè)試微生物懸濁液。各個(gè)測(cè)試樣品按六份重復(fù)依次置于24孔無(wú)菌測(cè)試組織培養(yǎng)板。每培養(yǎng)板孔分別接種3ml所述懸濁液，其中1ml所述懸濁液被立即移除以提供0時(shí)刻基準(zhǔn)值，剩余2ml述懸濁液仍保留在各個(gè)培養(yǎng)板孔內(nèi)。培養(yǎng)板用封口膜密封于37℃及150rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24小時(shí)，再進(jìn)行菌落數(shù)枚舉。將液體培養(yǎng)基樣品通過(guò)梯度稀釋后涂置預(yù)制板計(jì)數(shù)瓊脂(difcolaboratories,detroit,mi)，在0,4,8,12和24小時(shí)分別確認(rèn)菌落數(shù)。在35℃培育培養(yǎng)板，在48小時(shí)培養(yǎng)期后用quebec菌落計(jì)數(shù)器(americanopticalcorp.)計(jì)算菌落數(shù)。

1.4口腔生物膜形成抑制。

涂有人類唾液的羥基磷灰石碟片與s.mutans31377的atcc系列培養(yǎng)，進(jìn)而被分隔為兩組：pbs對(duì)照組和10k殼聚糖組。經(jīng)過(guò)7天培養(yǎng)收集生物膜。通過(guò)xtt存活率試驗(yàn)確定定植細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)確定各個(gè)碟片的所述生物膜的干質(zhì)量。所有試驗(yàn)均一式三份并且重復(fù)三次。

殼聚糖的抗菌性能眾所周知，并被先前研究所證實(shí)(rabea,e.i.,m.e.,stevens,c.v.,smagghe,g.&steurbaut,w.殼聚糖作為抗菌劑：應(yīng)用和作用方式.biomacromolecules4,1457-1465(2003).)devlieghere,f.,vermeulen,a.&debevere,j.殼聚糖：抗菌活性，作為水果和蔬菜涂層與食物成分和適用性相互作用.foodmicrobiology21,703-714(2004).)。

先前的xtt存活率試驗(yàn)清楚地表明5k和10k殼聚糖具有有效抑制作用（參見(jiàn)附圖的圖3和圖4）。殼聚糖的抗菌性能有益于預(yù)防齲齒。根據(jù)第一階段研究，除了xtt比色法和抑菌圈，還可采用菌落單位指數(shù)梯減實(shí)驗(yàn)測(cè)試度量殼聚糖的殺菌能力，揭示殼聚糖的廣譜抗菌性能，以優(yōu)化牙膏配方的殼聚糖濃度。

1.脫礦/再礦化測(cè)試。

1.1脫礦/再礦化評(píng)估的離體酸堿循環(huán)模式。

為進(jìn)行脫礦/再礦化測(cè)試，費(fèi)瑟斯通實(shí)驗(yàn)室的酸堿循環(huán)模型，作為一個(gè)高效的、有效的、可重復(fù)的且已被多點(diǎn)驗(yàn)證并且20多年間廣泛使用的檢測(cè)手段，被用于牙膏配方的抗齲齒潛力研究(stookey,g.k.etal.費(fèi)瑟斯通實(shí)驗(yàn)室酸堿循環(huán)模式：一種前瞻性的多點(diǎn)驗(yàn)證方法.amjdent24,322-328(2011).)一種與此類似的酸堿循環(huán)模式先前已被用于氟化物漆的脫礦/再礦化研究.(hong,l.,ettinger,r.l.,c.a.&wefel,j.s.義齒基牙氟化物漆的離體評(píng)估.jprosthetdent89,28-36(2003).hong,l.,watkins,c.a.,ettinger,r.l.&wefel,j.s.離體牙根表面損傷的局部氟化物和氟化物漆作用.amjdent18,182-187(2005)。

隨機(jī)選取40個(gè)拔除的人類第三磨牙，只選取具有健全且完整表面的牙齒。，除了留有一個(gè)2mm*4mm的窗口，各個(gè)牙齒表面均涂有兩層耐酸的指甲油。牙經(jīng)牙根頂部的鉆孔系線用來(lái)將牙齒置于各種溶液內(nèi)。用脫礦溶液來(lái)離體形成早期齲齒損傷。recaldent?酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣(mipaste,gcamerica,alsip,il)和鈣鈉磷硅酸鹽(sootherxtoothpaste,3mespewestpalmbeach,fi)用作陽(yáng)性對(duì)照組，目前這兩種再礦化劑產(chǎn)品已應(yīng)用于臨床。

所述牙齒將隨機(jī)分為四個(gè)分組：陰性對(duì)照組、mipaste組、sootherx組和殼聚糖-無(wú)定形磷酸鈣組。治療方案如下。

組a：陰性對(duì)照組，無(wú)治療措施，除了用蒸餾去離子水沖洗20秒鐘，作為陰性對(duì)照。

組b：mipaste組，用棉簽每天兩次擦拭牙齒表面，放置不動(dòng)兩分鐘。

組c：sootherx牙膏組，用牙刷每天兩次刷牙齒表面兩分鐘。

組d：殼聚糖-無(wú)定形磷酸鈣原型牙膏，用牙刷每天兩次刷牙齒表面兩分鐘。

按各組治療方案第一次治療后，用去離子/蒸餾水沖洗牙齒20秒鐘，再置于脫礦溶液6小時(shí)，以形成人造類齲齒損傷。所述脫礦溶液包括2.2mmcacl2·2h2o，2.2mmkh2po4和50mm醋酸,酸堿度為4.3。6小時(shí)后，取回樣本，用去離子/蒸餾水沖洗20秒鐘。按各組方案，所有樣本按治療方案分別再處理一遍。第二次治療后，所有樣本均被置于人工唾液溶液17個(gè)小時(shí)。所述人工唾液溶液包括1.5mmcacl2·2h2o，0.9mmkh2po4和150mmkcl,酸堿度為7。17個(gè)小時(shí)后，用去離子/蒸餾水沖洗所述樣本20秒鐘。該酸堿度循環(huán)與食物攝入有關(guān)，被用于模仿口腔環(huán)境的變化。該循環(huán)持續(xù)保持14天。

1.表征和數(shù)據(jù)分析。

采用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)表征牙齒表面，包括形態(tài)、化學(xué)和機(jī)械分析。形態(tài)評(píng)估包括掃描電子顯微鏡(sem)和偏振光顯微鏡(plm)。由plm和μct度量損傷深度和再礦化寬度，μct還度量礦物質(zhì)密度。常規(guī)顯微壓痕是表征表面硬度和強(qiáng)度的極佳工具，特別是薄或者厚的薄膜。根據(jù)本申請(qǐng)，大載荷的常規(guī)壓痕用于表征表面硬度?；瘜W(xué)分析包括auger電子能譜和xps以度量鈣元素和磷元素的深度曲線。

采用anova比較4個(gè)分組的脫礦深度和再礦化寬度。spss統(tǒng)計(jì)程序處理脫礦深度數(shù)據(jù)、再礦化寬度數(shù)據(jù)、化學(xué)分析數(shù)據(jù)和機(jī)械分析數(shù)據(jù)，anova評(píng)估4個(gè)分組的差異。

示例7：殼聚糖/cacl2/na2hpo4用于原位生成無(wú)定形磷酸鈣以再礦化牙齒。

1.制備負(fù)載cacl2或者na2hpo4的殼聚糖微球。

10k殼聚糖溶解于雙蒸蒸餾水(dd)形成80mg/ml。離心或者過(guò)濾所述混合物以移除任何未溶解的殘留物以獲得工作用殼聚糖溶液。添加1v%的醋酸以溶解殼聚糖。cacl2溶解于雙蒸蒸餾水以制備工作用1mcacl2溶液，na2hpo4溶解于雙蒸蒸餾水以制備工作用0.667mna2hpo4溶液。

為了制備殼聚糖/cacl2微球，1ml上述制備的10k殼聚糖溶液與0.2ml的cacl2溶液通過(guò)渦旋混合2分鐘。所述溶液被添加至10ml含100mg表面活性劑span80的輕質(zhì)礦物油。所述混合物高速渦旋3分鐘以形成乳白色的水-油乳化液。所述水-油乳化液被添加到放置于加熱/攪拌器的100ml燒杯。保持38℃，以400rpm磁力攪拌所述乳化液19個(gè)小時(shí)以蒸發(fā)移除水分。所述混濁物被添加至80ml正己烷以沉淀形成的殼聚糖/cacl2微球。所述液體通過(guò)離心得以澄清。用40ml正己烷再次沖洗所述沉淀，離心以移除殘留的表面活性劑。所述上層液體經(jīng)離心得以澄清。沖洗過(guò)程和離心過(guò)程分別重復(fù)兩次。經(jīng)真空烘干所述沉淀最終獲得干燥的殼聚糖/cacl2微球。產(chǎn)率為85wt%至95wt。采用離子選擇電極法確定cacl2的負(fù)載量為14wt%至16.6wt%。

替代地，上述制備的10ml10k殼聚糖溶液與2mlcacl2溶液通過(guò)渦旋混合2分鐘。于250ml燒杯內(nèi)，上述溶液被添加至120ml含1200mg表面活性劑span80的輕質(zhì)礦物油。所述混合物以1000rpm磁力攪拌30分鐘，再以750rpm磁力攪拌3個(gè)小時(shí)以形成乳白色的水-油乳化液。所述水-油乳化液被添加至設(shè)置于加熱/攪拌器的1000ml燒杯。以500rpm磁力攪拌所述乳化液,并在38℃保持19個(gè)小時(shí)然后升溫至45℃保持2至5個(gè)小時(shí)以蒸發(fā)移除水分。所述混合物被添加至400ml正己烷以沉淀制備的殼聚糖/cacl2微球。所述液體經(jīng)離心得以澄清。80ml正己烷再次沖洗所述沉淀，離心以移除殘留的表面活性劑。沖洗過(guò)程和離心過(guò)程分別重復(fù)兩次。經(jīng)真空干燥所述沉淀最終獲得殼聚糖/cacl2微球。所述產(chǎn)率為85wt%至95wt%。離子選擇電極法確定cacl2的負(fù)載量為14wt%至16wt%。

為了制備殼聚糖/na2hpo4微球，上述制備的1ml10k殼聚糖溶液與0.2ml的na2hpo4溶液通過(guò)渦旋混合2分鐘。所述溶液被添加至10ml含100mg表面活性劑span80的輕質(zhì)礦物油。所述混合物高速渦旋3分鐘以形成乳白色的水-油乳化液。所述水-油乳化液被添加至放置于加熱/攪拌器的100ml燒杯。保持38℃，以400rpm磁力攪拌所述乳化液19個(gè)小時(shí)以蒸發(fā)移除水分。所述混濁物被添加至80ml的正己烷以沉淀所形成的殼聚糖/na2hpo4微球。所述液體通過(guò)離心得以澄清。40ml正己烷再次沖洗所述沉淀，離心以移除殘留的表面活性劑。所述上層液體經(jīng)離心得以澄清。沖洗過(guò)程和離心過(guò)程分別重復(fù)兩次。經(jīng)真空干燥所述沉淀最終獲得干燥的殼聚糖/na2hpo4微球。產(chǎn)率為81wt%至85wt。采用abeam?磷酸鹽比色試劑盒確定na2hpo4的負(fù)載量為22wt%至23wt%。

替代地，上述制備的10ml10k殼聚糖溶液與2mlna2hpo4溶液通過(guò)渦旋混合2分鐘。250ml燒杯內(nèi)，上述溶液被添加至120ml的包括1200mg表面活性劑span80的輕質(zhì)礦物油。所述混合物以650rpm磁力攪拌3個(gè)小時(shí)以形成乳白色的水-油乳化液。所述水-油乳化液被添加至設(shè)置于加熱/攪拌器的1000ml燒杯。以500rpm磁力攪拌所述乳化液，并在38℃保持19個(gè)小時(shí)然后升溫至45℃保持2至5個(gè)小時(shí)以蒸發(fā)移除水分。所述混合物被添加至400ml正己烷以沉淀所形成的殼聚糖/na2hpo4微球。所述液體經(jīng)離心得以澄清。80ml正己烷再次沖洗所述沉淀，離心以移除殘留的表面活性劑。沖洗過(guò)程和離心過(guò)程分別重復(fù)兩次。經(jīng)真空干燥所述沉淀最終獲得殼聚糖/na2hpo4微球。所述產(chǎn)率為81wt%至85wt%。采用abeam?磷酸鹽比色試劑盒確定na2hpo4的負(fù)載量為22wt%至23wt%。

1.從殼聚糖微球釋放鈣離子或者磷酸根離子

在室溫下，以雙蒸蒸餾水為釋放介質(zhì)釋放鈣離子和磷酸根離子。在5分鐘，55分鐘，3小時(shí)，6小時(shí)10分鐘，22小時(shí)10分鐘從所述釋放介質(zhì)被分別取樣。經(jīng)適當(dāng)處理所述樣本，采用鈣離子選擇電極法或者abeam?磷酸鹽比色試劑盒分別確定鈣離子濃度和磷離子濃度。參見(jiàn)附圖的圖5，示出了由10k殼聚糖制備的殼聚糖/cacl2微球的鈣離子典型釋放曲線。鈣離子釋放非常迅速，接近瞬時(shí)，在5分鐘內(nèi)接近97%的鈣離子被釋放。為了延長(zhǎng)鈣離子的釋放時(shí)間，可采用水溶性低的鈣鹽，以及采用親水性弱的聚合物與殼聚糖混合而制備所述微球。

參見(jiàn)附圖的圖6，示出了由10k殼聚糖制備的殼聚糖/na2hpo4微球的磷酸根離子典型釋放曲線。磷酸根離子釋放迅速，在5分鐘內(nèi)超過(guò)63%的磷酸根離子被釋放，在190分鐘后85%的磷酸根離子被釋放。為了延長(zhǎng)磷酸根離子的釋放時(shí)間，可采用水溶性低的磷酸鹽，以及采用親水性弱的聚合物與殼聚糖混合而合成所述微球。在室溫下，從殼聚糖/na2hpo4微球釋放磷酸根離子。釋放介質(zhì)的酸堿度在釋放過(guò)程中被監(jiān)測(cè)。

附圖圖7展示出了殼聚糖微球釋放鈣離子或磷酸根離子的釋放過(guò)程中釋放介質(zhì)的酸堿度變化。所述雙蒸蒸餾水具有中性酸堿度。從5分鐘時(shí)的所述第一取樣時(shí)間至22小時(shí)10分鐘時(shí)的所述末次取樣時(shí)間，殼聚糖/cacl2微球的釋放介質(zhì)酸堿度相對(duì)穩(wěn)定地維持于6.1。與此同時(shí)，殼聚糖/na2hpo4微球的釋放介質(zhì)酸堿度從5分鐘時(shí)的7.56下降至55分鐘時(shí)的6.81，此后相對(duì)穩(wěn)定地維持于6.8。精氨酸添加至最終牙膏配方以增強(qiáng)殼聚糖中和口腔細(xì)菌導(dǎo)致的酸性環(huán)境的能力。精氨酸比殼聚糖堿性更強(qiáng)。因酸通常加入以增強(qiáng)不溶于中性水溶液的殼聚糖的水溶性，添加精氨酸將使殼聚糖成游離堿的狀態(tài)。添加精氨酸的其它益處包括促進(jìn)形成無(wú)定形磷酸鈣。一旦殼聚糖游離堿重新帶正電荷，將再顯示出其抗細(xì)菌性能。

采用ftir紅外光譜儀記錄所述10k殼聚糖，所述殼聚糖/cacl2微球和所述殼聚糖/na2hpo4微球的ftir紅外光譜。附圖圖8展示出了所述10k殼聚糖，所述殼聚糖/cacl2微球和所述殼聚糖/na2hpo4微球的典型傅里葉變換紅外光譜。10k殼聚糖在1153cm^-1(vc-o-c糖苷橋),1061cm^-1(vc-o伯羥基附近)和1017cm^-1(vc-c和vc-o)，1633cm^-1(酰胺帶i)和1538cm^-1(酰胺帶ii)具有特征峰。將na2hpo4加入到入殼聚糖而形成微球后，除已觀測(cè)得到的殼聚糖特征峰，還觀測(cè)得到1378cm^-1和858cm^-1兩個(gè)新的特征峰，858cm^-1特征峰是基于hpo4^2-。將cacl2加入到入殼聚糖而形成微球，除已觀測(cè)得到的殼聚糖特征峰，還觀測(cè)得到1527cm^-1，1450cm^-1，1378cm^-1的新峰。

額外可使用的鹽類。

化學(xué)品水溶性

醋酸鈣34.7g/100ml(20℃)

cacl281.1g/100ml(25℃)

泛酸鈣50mg/100ml(25℃)

抗環(huán)血酸鈣50g/100ml

葡萄糖酸鈣緩溶，4.33g/100ml

乳酸鈣7.9g/100ml(30℃),6.7g/100ml(25℃)

乙酰丙酮酸鈣

乳糖酸鈣

檸檬酸鈣0.095g/100ml(25℃)

糖庚糖酸鈣

苯甲酸鈣2.72g/100ml(20℃)

糖精鈣

山梨酸鈣

示例8：cacl2/殼聚糖和na2hpo4/殼聚糖微球的sem及edx分析。

采用掃描電子圖像表征制備的cacl2/殼聚糖和na2hpo4/殼聚糖微球。簡(jiǎn)要地，采用雙層碳粘合層將cacl2/殼聚糖和na2hpo4/殼聚糖微球分別固定于sem樣品架。于所述樣本的表面濺鍍一薄層金。采用sem觀測(cè)所述濺鍍金后的樣品。

附圖圖9展示出了制備的cacl2/殼聚糖微球的5000x和100x放大倍率的典型sem圖像。附圖圖9的圖像a展示出了微米級(jí)粒子（小于10μm納米結(jié)構(gòu)。edx分析顯示，微米級(jí)粒子及其納米結(jié)構(gòu)均具有鈣元素和氮元素，說(shuō)明它們中均存在cacl2和殼聚糖，微米級(jí)粒子易于進(jìn)一步形成小于100μm集體（附圖圖9的圖像b）。附圖圖10展示出了制備的na2hpo4/殼聚糖微球的5000x和100x放大倍率的典型sem圖像。附圖圖10的圖像a示出了微米級(jí)粒子（小于5μm納米結(jié)構(gòu)。edx分析顯示，微米級(jí)粒子和納米結(jié)構(gòu)均具有鈉元素、磷元素和氮元素，說(shuō)明它們中均存在na2hpo4和殼聚糖，微米級(jí)粒子易于進(jìn)一步形成小于100μm的聚集體（附圖圖10的圖像b）

附圖圖11闡述了添加酸堿度為9.6的精氨酸溶液時(shí)，cacl2/殼聚糖懸浮液或者na2hpo4/殼聚糖懸浮液的酸堿度變化。隨著不斷添加精氨酸，酸堿度迅速上升至8.3，隨后逐漸接近酸堿度9。

示例9：脫礦/再礦化測(cè)試的牙膏配方。

混合非離子增稠劑羥乙基纖維素和甘油/水共溶劑以制備均勻粘稠的增稠混合物。冷凍干燥所述含水混合物以移除水分，得到無(wú)水粘稠的增稠混合物。按15:85的質(zhì)量比例混合所述cacl2/殼聚糖微球和上述粘稠的增稠混合物以形成所述牙膏。

田納西大學(xué)健康科學(xué)中心大學(xué)牙學(xué)院有因臨床實(shí)踐從口腔病人收集的滅菌了的人類第三磨牙形成收集池。該池中牙齒不能一一確認(rèn)其口腔病人。使用上述牙齒是符合人類試驗(yàn)準(zhǔn)則的。

從上述收集池隨機(jī)選取健全的人類第三磨牙。除了留有一個(gè)2mm*7mm的窗口，在各個(gè)牙齒表面均涂有兩層耐酸的指甲油。牙線將經(jīng)過(guò)牙根頂部的鉆孔系好牙齒，以將牙齒懸浮于各種溶液內(nèi)。

涂有兩層耐酸的指甲油的所述牙齒被隨機(jī)分成三個(gè)組（每個(gè)組均有10個(gè)牙齒）：陰性對(duì)照組（contr組），mipasteplus組（陽(yáng)性對(duì)照組，mi+組）和實(shí)驗(yàn)組（chi-acp組）。mipasteplus(recalden^tm酪蛋白磷酸肽-無(wú)定形磷酸鈣，gcamerica)被用于陽(yáng)性對(duì)照分組，是因其已在離體酸堿循環(huán)模型中測(cè)試其再礦化牙釉質(zhì)亞層損傷。mipasteplus含有0.2%(900ppm)的氟化物，廠家不推薦6周歲以下兒童使用，也不推薦12周歲以下兒童整夜使用。mipasteplus由于含有乳蛋白和苯甲酸可能導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)。

為進(jìn)行脫礦/再礦化測(cè)試，費(fèi)瑟斯通實(shí)驗(yàn)室的酸堿循環(huán)模型，作為一個(gè)高效的、有效的、可重復(fù)的且已被多點(diǎn)驗(yàn)證并且20多年間廣泛使用的檢測(cè)手段，被用于牙膏配方的抗齲齒潛力研究(stookey,g.k.etal.費(fèi)瑟斯通實(shí)驗(yàn)室酸堿循環(huán)模式：一種前瞻性的多點(diǎn)驗(yàn)證方法.amjdent24,322-328(2011)。此模式在此用來(lái)評(píng)價(jià)牙釉質(zhì)礦物的獲得及流失以研究牙膏配方的抗蛀牙潛力。所述離體酸堿循環(huán)過(guò)程由15個(gè)脫礦階段和15個(gè)再礦化階段組成，每個(gè)脫礦階段為6個(gè)小時(shí)，每個(gè)再礦化階段為16.5個(gè)小時(shí)（每天脫礦后再礦化）。所述脫礦溶液包括2.2mmcacl2,2.2mmkh2po4，50mm醋酸，酸堿度為4.3。所述再礦化溶液包括1.5mmcacl2,0.9mmkh2po，150mmkcl，和酸堿度為7.0。所述牙齒在從脫礦溶液至再礦化溶液轉(zhuǎn)移間隙和從再礦化溶液至脫礦溶液轉(zhuǎn)移間隙時(shí)得到處理。所述陰性對(duì)照組除了采用重蒸餾水沖洗60秒鐘外無(wú)其它處理措施；根據(jù)制造商提供的指南，所述mipasteplus組采用刷子將mipasteplus涂刷于所述牙齒表面的暴露窗口，形成mipasteplus的薄層并靜置10分鐘。所述chi-acp組（即實(shí)驗(yàn)組），采用牙刷將選用的牙膏手動(dòng)涂刷至所述牙齒表面的暴露窗口（每個(gè)牙刷涂刷40mg牙膏和150μl的na2hpo4/殼聚糖溶液），手動(dòng)涂刷1分鐘。在此處理前后分別采用重蒸餾水沖洗三個(gè)分組的牙齒樣品。當(dāng)牙齒從脫礦溶液或者再礦化溶液內(nèi)移出時(shí)，所述牙齒各被沖洗60秒鐘。治療過(guò)程后，所述牙齒在室溫下被懸置于相應(yīng)的脫礦溶液或者再礦化溶液。

經(jīng)15天的脫礦/再礦化過(guò)程，首先用與sem連用的edx分析所述經(jīng)處理的牙釉質(zhì)表面的元素成分。edx分析后，用硬組織切片機(jī)將所述牙齒切片為120μm至150μm的薄片以暴露處理過(guò)的牙釉質(zhì)表面下的橫截面，采用plm偏光顯微鏡觀測(cè)上述薄片。

本申請(qǐng)的目的在于基于殼聚糖微球釋放的鈣離子和磷酸根離子原位生成無(wú)定形磷酸鈣以提供一種新式抗齲齒牙膏。為測(cè)試此概念，將所述過(guò)程簡(jiǎn)化為采用cacl2/殼聚糖微球和代替殼聚糖-磷元素微球的磷酸鹽溶液。配制包含cacl2/殼聚糖微球、多羥基纖維素和甘油的無(wú)水牙膏。該牙膏與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組一起測(cè)試其再礦化牙釉質(zhì)。在15天的脫礦/再礦化期內(nèi)，所述實(shí)驗(yàn)組采用該配方牙膏于溶解有na2hpo4和精氨酸雙蒸蒸餾水中涂刷所述牙釉質(zhì)窗口一分鐘，（附圖圖12和圖13中的chi-acp組）。

圖12闡述了三組處理后的牙釉質(zhì)表面(包括contr,chi-acp和mi+的三個(gè)組)的元素分析結(jié)果。與所述陰性對(duì)照組(contr組，采用蒸餾去離子水處理)相比，chi-acp組的牙釉質(zhì)表面鈣含量(37.23±4.25wt%與33.89±3.28wt%)和鈣/磷質(zhì)量比(2.02±0.19與1.88±0.11)均顯著上升(見(jiàn)圖像a和圖像b）。與此同時(shí)，所述用mipasteplus處理的陽(yáng)性對(duì)照組(mi+組)的牙釉質(zhì)表面鈣含量(36.51±4.14wt%與33.89±3.28wt%)和鈣/磷質(zhì)量比(1.99±0.14與1.88±0.11)均略有上升。三個(gè)組中，牙釉質(zhì)表面磷含量從所述陰性對(duì)照組的17.97±0.82wt%略有上升到，所述陽(yáng)性對(duì)照組的18.30±0.80wt%，再到所述實(shí)驗(yàn)組的18.41±0.59wt%，在任何兩個(gè)組之間均不存在顯著差異(參見(jiàn)圖像c)。掃描電子顯微鏡圖像被用于觀測(cè)治療后牙釉質(zhì)的表面形態(tài)(參見(jiàn)附圖d,e和f)。三個(gè)組均未在牙釉質(zhì)表面觀測(cè)到明顯的沉積。該觀測(cè)與報(bào)道的抗過(guò)敏研究相反，過(guò)敏研究常發(fā)現(xiàn)牙膏所產(chǎn)生沉淀而閉塞牙本質(zhì)管。然而，幾乎上述研究均未將經(jīng)處理的牙本質(zhì)暴露于酸堿循環(huán)，并且是在處理過(guò)程后立即予以評(píng)估表征。

用plm度量處理過(guò)的牙釉質(zhì)表面下的脫礦深度和再礦化厚度。對(duì)所有三個(gè)組，在三個(gè)組間和在任何兩個(gè)組之間，脫礦深度均無(wú)顯著差異。所述脫礦前緣深入牙釉質(zhì)表面下650μm(參見(jiàn)附圖圖13)，該深度大于先前研究報(bào)道的400μm，該差異的原因不是本研究的目的。然而，全部三個(gè)組的再礦化厚度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(參見(jiàn)附圖圖13)。所述陰性對(duì)照組（contr組）具有最小的再礦化厚度（73.8±24.9μm）,此與先前的報(bào)道一致，。所述實(shí)驗(yàn)組（chi-acp組）具有最大的再礦化厚度（131.4±63.6μm），其后為陽(yáng)性對(duì)照組（mi+組，115.2±26.8μm）。在p=0.05水平上，三個(gè)分組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。統(tǒng)計(jì)分析(dunnett’stest)顯示，在p=0.05水平，在contr組和chi-acp組之間或者在contr組和mi+組之間再礦化厚度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。進(jìn)一步分析顯示，在chi-acp組和mi+組間再礦化厚度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，chi-acp組的再礦化厚度略大于mi+組的再礦化厚度?；趍ipasteplus包含有900ppm氟化物的事實(shí)，其含氟濃度接近常見(jiàn)的含氟牙膏的氟化物含量，所制備的牙膏比mipasteplus在再礦化侵蝕了的牙釉質(zhì)更具有優(yōu)勢(shì)。

示例10：額外的牙膏配方。

配制包含殼聚糖微粒（16.7wt%，裝載cacl2或者na2hpo4），poloxamer124（53.3wt%），聚乙二醇（12.0wt%），羥丙基纖維素（1.3wt%）和精氨酸（16.7wt%）的無(wú)水牙膏。調(diào)整精氨酸鹽酸鹽對(duì)精氨酸游離堿的質(zhì)量比例得以使無(wú)水牙膏酸堿度被易于控制于8.5至9.7之間（參見(jiàn)附圖圖14）。其它牙膏中，所述殼聚糖含量為5wt%至18wt%，且cacl2和na2hpo4的含量少于2wt%。特別地，溶解羥丙基纖維素于聚乙二醇，添加poloxamer124可改變比例以制備均勻粘稠的增稠混合物。按不同比例混合殼聚糖微粒和上述均勻粘稠的增稠混合物以形成所述牙膏。添加游離精氨酸和鹽酸鹽以調(diào)節(jié)牙膏的酸堿度(參見(jiàn)附圖圖14)。在牙膏配方添加二氧化鈦等其他成分以調(diào)節(jié)固體的總含量。

上述描述及附圖中所示的本發(fā)明的實(shí)施例只作為舉例而并不限制本發(fā)明。本發(fā)明的目的已經(jīng)完整并有效地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的功能及結(jié)構(gòu)原理已在實(shí)施例中展示和說(shuō)明，在沒(méi)有背離所述原理下，本發(fā)明的實(shí)施方式可以有任何變形或修改。