本申請涉及葉酸分子靶向磁性納米藥物的制備方法。

背景技術(shù)：

葉酸(folic acid，F(xiàn)A)又稱蝶酰谷氨酸、維生素B11，是一種人體必需的維生素，在細胞內(nèi)可還原為四氫葉酸，后者是一碳單位轉(zhuǎn)移酶的輔酶，參與一碳單位代謝和嘌呤、胸腺嘧啶的合成，是細胞代謝、DNA合成及修復(fù)的基本組成成分。腫瘤細胞的快速生長需要充足的葉酸以維持DNA的合成。動物細胞內(nèi)缺少合成葉酸的酶，細胞的生長和增殖依賴從外界環(huán)境獲得葉酸。葉酸受體(folate receptor,FR)是細胞膜表面糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定的糖化多肽，包括三種異構(gòu)體：α-FR、β-FR和γ-FR。β-FR是細胞膜相關(guān)蛋白，通過GPI錨定在細胞膜上，二者具有約70％的同源性。α-FR和γ-FR缺少修飾GPI錨附著的羧基末端信號肽，組成上屬于分泌型蛋白。葉酸受體有三個顯著特點：1.FR與游離葉酸的親和力非常高，解離常數(shù)Kd<1nmol/L；2.FR對葉酸分子通過化學(xué)鍵與其他大分子物質(zhì)連接形成的復(fù)合物的親和力和胞吞效應(yīng)與游離葉酸相當(dāng)，具有良好的入胞轉(zhuǎn)運潛能；3.FR對葉酸及其衍生物的結(jié)合、轉(zhuǎn)運是特異的受體－配體結(jié)合，并能被游離葉酸競爭抑制。葉酸與受體結(jié)合，通過內(nèi)化方式穿過細胞膜，是葉酸進入細胞內(nèi)的主要途徑。已有研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在卵巢癌、宮頸癌、非小細胞肺癌、頭頸癌等多種上皮源性惡性腫瘤細胞表面過表達，已證實喉癌和鼻咽癌高表達葉酸受體。而在正常組織細胞除脈絡(luò)叢、胎盤、肺、胸腺、腎低水平表達外，均高度保守。葉酸受體表達分布的腫瘤特異性、高效的轉(zhuǎn)運潛能和與葉酸的高親和力，為葉酸分子靶向藥物載體的制備及抗腫瘤分子靶向治療提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新的葉酸分子靶向磁性納米藥物的制備方法。

本發(fā)明提供一種葉酸分子靶向磁性納米藥物，包括內(nèi)核和外殼，所述內(nèi)核是攜帶有抗癌藥物的高分子材料改性的磁性納米顆粒，所述外殼是通過PH敏感的化學(xué)鍵偶聯(lián)的葉酸分子和高親水材料。

所述抗癌藥物是順鉑，所述高親水材料是PEG，所述高分子材料是醛基化海藻酸鈉。

一種葉酸分子靶向磁性納米藥物的制備方法，包括：

a)制備醛基化海藻酸鈉ASA溶液的步驟；

b)制備Fe3O4磁性納米粒子MNPs水溶液的步驟；

c)制備醛基化海藻酸鈉改性Fe3O4磁性納米粒子ASA-MNPs的步驟；

d)制備醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米顆粒CDDP-ASA-MNPs的步驟；

e)制備葉酸修飾的雙肼基PEG的步驟，所述步驟的產(chǎn)物是FA-PEG-NHNH2；

f)制備肼基PEG葉酸修飾的醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米顆粒CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的步驟；

g)合成MMP-9-ASODN的步驟；

h)制備磁性納米復(fù)合物CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN的步驟。

所述步驟a)中，將海藻酸鈉溶于雙蒸水中，避光條件下加入高碘酸鈉，攪拌均勻后避光反應(yīng)，加入無水乙醇終止反應(yīng)，超濾得到所需ASA溶液。

所述步驟b)中，取FeCl3·6H2O及FeSO4·4H2O溶解于去離子水中，在攪拌條件下加入NH3·H2O調(diào)節(jié)pH值，直至溶液的顏色變?yōu)樯詈谏畔粗辽锨逡弘妼?dǎo)率值＜50μs，超聲振蕩使磁性納米顆粒均勻分散于去離子水中，得到磁性納米粒子MNPs水溶液。

所述步驟c)中，將制備好的ASA溶液加入攪拌中的所述磁性納米粒子MNPs水溶液，高溫下反應(yīng)，離心后取上清液超濾除去游離的SA，直至濾出液電導(dǎo)率值＜50μs，產(chǎn)物冷凍干燥后得到所述磁性納米粒子ASA-MNPs。

所述步驟d)中，將CDDP與ASA-MNPs反應(yīng)，反復(fù)透析和超濾，制備出納米顆粒CDDP-ASA-MNPs。

所述步驟e)中，將葉酸溶于無水二甲基亞砜中，室溫、攪拌條件下加入二環(huán)己基碳二亞胺及N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應(yīng)，然后加入雙肼聚乙二醇，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入雙蒸水，過濾除去不溶物后，得到所述FA-PEG-NHNH₂。

所述步驟g)中，MMP-9的反義序列如SEQ ID NO:1所示，MMP-9的無義序列如SEQ ID NO:2所示，所述序列中的堿基采用硫代修飾，5’氨基修飾，得到所述MMP-9-ASODN。

所述步驟h)中，取CDDP-ASA-MNPs、FA-PEG-NHNH2、硫代及氨基修飾的MMP-9-ASODN，攪拌均勻，避光反應(yīng)，加入硼氫化鈉溶液，充分離心沉淀，沉淀物用PBS溶液重新分散均勻，得到所述磁性納米復(fù)合物CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN。

本發(fā)明的有益效果是：以磁性納米粒為核，通過高分子材料攜帶抗癌藥物如順鉑，外殼采用偶聯(lián)葉酸分子的高親水材料如聚乙二醇通過pH敏感的化學(xué)鍵如腙鍵連接，構(gòu)建葉酸受體靶向和磁靶向的雙重靶向納米抗癌藥物，利用其靶向轉(zhuǎn)運、pH敏感釋藥、細胞內(nèi)化療的特征，可避免抗癌藥物如順鉑對非靶器官的損傷；另外，在外加磁場作用下，磁性納米粒會提高腫瘤細胞內(nèi)溫度加速其死亡或凋亡，這種集磁熱放化療于一體的綜合治療可實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向殺傷和放射增敏，有望在提高療效的同時減輕局部和全身毒副反應(yīng)，改善治愈后的生存質(zhì)量，這種基于葉酸靶向磁性納米藥物的綜合治療模式適合所有葉酸受體陽性的腫瘤。

附圖說明

圖1是FA-PEG-ASAMNPs中鐵含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2是CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs中順鉑含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3是SA-MNPs、ASA-MNPs及CDDP-FA-ASA-MNPs的流體力學(xué)粒徑分布示意圖；

圖4是SA-MNPs、ASA-MNPs及CDDP-FA-ASA-MNPs的zeta電位擬合曲線；

圖5是透射電鏡下CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的分布圖；

圖6是CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的粒徑分布直方圖；

圖7是SA、ASA、SA-MNPs及ASA-MNPs的紅外光譜圖；

圖8是FA、ASA-MNPs及FA-ASA-MNPs的紫外光譜圖；

圖9是ASA-MNPs的磁化曲線圖；

圖10是FA的紫外光譜圖；

圖11是FA-PEG-NH₂的紫外光譜圖；

圖12是CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN的紫外光譜圖；

圖13是葉酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1：

一種葉酸分子靶向磁性納米藥物的制備方法，包括：

a)制備醛基化海藻酸鈉ASA溶液的步驟；

b)制備Fe3O4磁性納米粒子MNPs水溶液的步驟；

c)制備醛基化海藻酸鈉改性Fe3O4磁性納米粒子ASAMNPs的步驟；

d)制備醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米顆粒CDDP-ASAMNPs的步驟；

e)制備葉酸修飾的雙肼基PEG的步驟，所述步驟的產(chǎn)物是FA-PEG-NHNH2；

f)制備肼基PEG葉酸修飾的醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米顆粒CDDP-FA-PEG-ASA-MNPS的步驟；

g)合成MMP-9-ASODN的步驟；

h)制備磁性納米復(fù)合物CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的步驟。

實施例2：

一種葉酸分子靶向磁性納米藥物的制備方法，其包括以下步驟：

1)醛基化海藻酸鈉(ASA)溶液的制備：醛基化海藻酸鈉(aldehyde sodium alginate，ASA)的制備：40g海藻酸鈉溶于1000ml雙蒸水中，避光條件下加入高碘酸鈉10g，攪拌均勻后于4℃條件下避光反應(yīng)24h，加入50ml無水乙醇終止反應(yīng)，超濾并使溶液體積減少至400ml備用。

2)磁性納米粒子MNPs溶液的制備：分別取27g FeCl3·6H2O及139g FeSO4·4H2O溶解于1000ml去離子水中，使其濃度分別為0.01mol/L及0.005mol/L，在攪拌條件下加入25％(w/w)NH3·H2O調(diào)節(jié)pH值至9.5，直至溶液的顏色變?yōu)樯詈谏?，得到Fe3O4(四氧化三鐵)，磁洗至上清液電導(dǎo)率值＜50μs。超聲振蕩使磁性納米顆粒均勻分散于600ml去離子水中，備用。

3)醛基化海藻酸鈉改性磁性納米粒子ASAMNPs的制備：將制備好的400ml ASA加入攪拌中的600ml Fe3O4磁性納米顆粒水溶液，85℃高溫下反應(yīng)40min，4000rpm離心后取上清液超濾除去游離的SA，直至濾出液電導(dǎo)率值＜50μs，產(chǎn)物冷凍干燥后備用。該產(chǎn)物實際就是醛基化海藻酸鈉包裹Fe3O4。

4)醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米顆粒的制備

CDDP100mg與一定體積ASA-MNPs(CDDP:ASA＝13.3:1,Fe3O410mg/mL,ASA50mg/mL)。每2～3mlASA改性水溶性磁性液體中加入10mg順鉑(CDDP)，在37℃條件下反應(yīng)24h，反復(fù)透析和超濾，制備出載順鉑磁性納米藥物(CDDP-ASAMNPs)。

5)葉酸修飾的雙肼基PEG的制備

將已干燥好的PEG(聚乙二醇)200g溶于600mL無水二氯甲烷中，然后在冰水浴條件下逐滴加入含60.5g對硝基氯甲酸苯酯的無水二氯甲烷溶液400mL和125ml的無水三乙胺中，PEG、對硝基氯甲酸苯酯、三乙胺的摩爾比為1：3：9。體系在避光條件下反應(yīng)12小時。然后旋蒸除去大部分二氯甲烷溶劑，加入無水乙醚沉淀。將沉淀物真空干燥，即得對硝基氯甲酸苯酯活化的PEG。

將上述產(chǎn)物溶于1000mL二氯甲烷中，然后滴加291ml的水合肼溶液，PEG與肼的摩爾比為1：30。反應(yīng)液在室溫條件下反應(yīng)4小時，然后旋蒸除去大部分二氯甲烷溶劑，加入一定量的無水乙醚沉淀。將沉淀物真空干燥，即得肼修飾的PEG。

8.8g葉酸(FA)溶于300ml無水二甲基亞砜(DMSO)中，室溫、攪拌條件下加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)8.4g及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)4.4g，攪拌反應(yīng)4h。然后加入雙肼聚乙二醇(PEG2000(NHNH2)2)40g，繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后加入雙蒸水1200ml，過濾除去不溶物后，產(chǎn)物冷凍干燥，該產(chǎn)物即FA-PEG-NHNH2。雙肼聚乙二醇即上述肼修飾的PEG。

6)肼基PEG葉酸修飾的醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米顆粒的制備

取3g的FA-PEG-NHNH2，溶解于100ml雙蒸水中，然后再緩慢滴入300ml含5g醛基化海藻酸鈉改性載順鉑磁性納米粒液體中，以冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5，氮氣保護，反應(yīng)液在室溫下攪拌48小時，肼基與醛基充分反應(yīng)形成腙鍵，反應(yīng)產(chǎn)物在蒸餾水中透析3天(截留分子量5000-14000)，然后冷凍干燥，得到的產(chǎn)物即CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs。

7)MMP-9-ASODN的合成：根據(jù)人MMP-9基因cDNA序列，選擇含起始密碼子及上游的6個堿基及后續(xù)的11個堿基，共20個堿基作為靶序列的反義寡核苷酸(ASODN)，經(jīng)Genbank計算機網(wǎng)上檢索證實與MMP-9以外的己知人類基因無同源性；無義寡核苷酸(NSODN)序列經(jīng)計算機網(wǎng)上檢索證實與己知人類基因無同源性。MMP-9反義序列如下：5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)，無義序列為：5’-CGTCCCTATACGACC-3’(SEQ ID NO:2)。上述寡核苷酸堿基均采用硫代修飾，5’氨基(NH2)修飾，修飾后的MMP-9-ASODN的總分子量為6682.4，用水稀釋至100μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

8)CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性納米復(fù)合物的制備：取CDDP-ASA-MNPs、FA-PEG-NHNH₂、硫代及氨基修飾的MMP-9-ASODN，攪拌均勻，于4-8℃下避光反應(yīng)24-36小時，加入一定量的硼氫化鈉溶液，使體系中硼氫化鈉的濃度為0.5-0.7mol.l^-1，體系繼續(xù)反應(yīng)3-6小時后，充分離心沉淀，沉淀物用0.01mol/L的PBS溶液重新分散均勻，制備成CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性納米復(fù)合物；

對比例1：

SAMNPs的制備：

制備方法與實施例1中步驟3)一樣，只是將ASA溶液換成SA溶液。

測試部分：

測試?yán)?：

鐵含量測定(鄰二氮菲法)

該方法的測定原理是：以鹽酸羥胺將Fe3+還原為Fe2+,在pH＝2～9的范圍內(nèi)，與鄰二氮菲反應(yīng)生成穩(wěn)定的橙紅色配合物[(C12H8N2)3Fe]2+,最大吸收峰在510nm處。

試劑：配制標(biāo)準(zhǔn)Fe溶液：準(zhǔn)確稱取0.8634克NH4Fe(SO4)2·12H2O，加入20ml 1∶1的濃HCl和少量水，溶解后，定量轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。每毫升含F(xiàn)e3+100μg；鄰二氮菲(0.15％水溶液，臨時配制)；鹽酸羥胺(10％水溶液，臨時配制)；醋酸鈉溶液(1mol·L-1)

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別準(zhǔn)確吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml標(biāo)準(zhǔn)Fe溶液(含F(xiàn)e3+100μg/ml)于6只已編號的50ml容量瓶中，各加入1ml 10％鹽酸羥氨溶液，充分搖動后加入2ml 0.15％鄰二氮菲溶液和5ml 1mol/L NaAc溶液，以水稀釋到刻度，搖勻。在在UVIKON 923紫外-可見光分光光度計上，用1cm比色皿，以空白溶液為參比溶液，在510nm波長下，分別測定各溶液的吸光度。以Fe2+的組成量度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN中Fe含量的測定

Fe3O4+8HCl＝FeCl2+2FeCl3+8H2O (1-1)

取1ml CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN樣品，加入一定量的濃HCl，使Fe3O4轉(zhuǎn)化成Fe3+離子(見式1-1)，然后稀釋至含F(xiàn)e濃度為10～100μg/ml，并保證溶液pH在2～9的范圍內(nèi)。用1ml吸量管吸取1ml未知溶液置于50ml容量瓶中，依次加入1ml 10％鹽酸羥氨溶液、2ml 0.15％鄰二氮菲溶液和5ml1mol/L NaAc溶液，以水稀釋至刻度，搖勻。在510nm波長下測定其吸光度，再對比標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計算樣品中Fe的含量。

反應(yīng)式1-1 鄰苯二胺與順鉑的配位反應(yīng)

采用鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPDA)比色法測定CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs中順鉑的含量。即OPDA通過配位絡(luò)和作用與CDDP結(jié)合，發(fā)生顯色反應(yīng)，在一定的CDDP濃度范圍內(nèi)，溶液在703nm處的吸光度與濃度成線性關(guān)系，可用于CDDP的定量分析。由于OPDA對CDDP的親和性與DNA相似，將載體上可與OPDA反應(yīng)的CDDP視為可逆釋放的CDDP。測定原理如反應(yīng)式1-1所示。

測定步驟和方法：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置1.2mg/ml OPDA/DMF溶液100ml(溶液Ⅰ)，10mg/250ml CDDP溶液(溶液Ⅱ)，取六支大試管，按表1-1數(shù)據(jù)配制一系列溶液。

表1-1 CDDP標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制表

將上述各試管浸于沸水浴中，煮沸10分鐘后取出，迅速冷卻后在703nm波長下比色。以標(biāo)準(zhǔn)CDDP溶液的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。吸光度測定在UVIKON 923紫外-可見光分光光度計上進行，結(jié)果如圖。

樣品測試：

將樣品稀釋至CDDP含量在0～30μg/ml范圍內(nèi)，吸取6毫升已稀釋的樣品，加入6ml 1.2mg/ml OPDA/DMF溶液，浸于沸水浴中，煮沸10分鐘后取出，迅速冷卻后在703nm波長下比色，記錄吸光度，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線得出CDDP的含量。

測試?yán)?：

包封率及載藥量的測定：

收集透析濾出液并以鄰苯二胺分光光度法測量濾出液中CDDP的含量，以下述公式分別計算包封率(drug encapsulation efficiency，DEE)。

包封率(％)＝[(理論藥物含量－濾出液藥物含量)/理論藥物含量]×100％；將CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs冷凍干燥后以下述公式計算載藥量(drug loading efficiency，DLE)：

載藥量(％)＝(微球內(nèi)藥物質(zhì)量/微球的總質(zhì)量)×100％。

測試?yán)?：

ASA中醛基濃度測定：

采用鹽酸羥胺-電位滴定法測定氧化后海藻酸鈉表面的醛基濃度。此方法是利用鹽酸羥胺與ASA上的醛基進行反應(yīng)生成HCl，并用NaOH對其進行滴定，從而根據(jù)滴定所用NaOH的體積，計算出醛基含量。其反應(yīng)式如式(Ⅵ)所示：

SA-(CHO)n+n(H₂N-OH-HCl)＝SA-(CH＝N-OH)n+nH₂O+n HCl (Ⅵ)

ΔV×0.001×n_NaOH＝n_CHO (Ⅶ)

OD＝(n_CHO/2)/(w_SA/198.11) (Ⅷ)

具體步驟：將1.75g鹽酸羥胺溶于水中后，加入質(zhì)量含量為0.5％的甲基橙水溶液0.6ml，稀釋至100ml，配成0.25mol/L的鹽酸羥胺溶液。取0.1g干燥后ASA加入25ml鹽酸羥胺溶液中，充分溶解后，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定，顏色由紅色變?yōu)辄S色后停止，此時pH約為5。由計算所得醛基量進一步可由式(Ⅶ)、(Ⅷ)推出海藻酸鈉的氧化程度(oxidation degree，OD)：被氧化的海藻酸鈉單體數(shù)目與總的海藻酸鈉單體數(shù)目之比，n_CHO為醛基的摩爾量，w_SA為起始海藻酸鈉的質(zhì)量，海藻酸鈉單體分子量為198.11。以上過程均在不同時間重復(fù)數(shù)遍取平均值。最后得到海藻酸鈉的氧化程度為21.78±0.98％，即每5個海藻酸鈉單體中約有一個生成了2,3-CHO。

測試?yán)?：

流體力學(xué)直徑與Zeta電位的測定：

高分辨Zeta電位及激光粒度分析儀(Zeta PALS Brook Haven Instruments Co.USA)上進行，測試之前CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs稀釋到一定濃度(Fe含量均為0.02mg/ml)，用0.1mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)待測液pH為7.4，并用0.45μm的濾器過濾。測試參數(shù)為：散射角90°，溫度25℃，測試數(shù)遍取平均值，重點考察制備過程納米粒粒徑變化。最后得到SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-SAMNPs平均流體力學(xué)粒徑分別為45.3±2.3nm、48.7±1.7nm及66.5±1.5nm。后者與前兩者相比，其流體力學(xué)粒徑略大，一方面證明葉酸及順鉑均連接在聚合物表面，另一方面說明連接了靶向配體葉酸及抗腫瘤藥物順鉑之后，其粒徑仍然符合靶向載藥系統(tǒng)對粒徑的要求(<200nm)。SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-SAMNPs的流體力學(xué)粒徑均呈正態(tài)對稱分布(圖3所示)。zeta電位擬合曲線如圖4所示。

表3給出了和圖4分別給出了SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-SAMNPs的zeta電位值及擬合曲線，可以看出ASAMNPs的Zeta電位最高，SA-MNPs及CDDP-FA-PEG-SAMNPs的Zeta電位相當(dāng)。CDDP-FA-PEG-SAMNPs的Zeta電位值低于ASAMNPs，估計與順鉑替代了表面陰性電荷有關(guān)。由圖4的Zeta電位曲線可知，SAMNPs的穩(wěn)定性較差，ASAMNPs和CDDP-FA-PEG-ASAMNPs穩(wěn)定性相當(dāng)。

表3 SAMNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的Zeta電位測定

由圖4的Zeta電位值可知，ASAMNPs的穩(wěn)定性非常好，SAMNPs和CDDP-FA-PEG-ASAMNPs穩(wěn)定性也很滿意，表明海藻酸鈉醛基化后可提高改性產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

測試?yán)?：

磁核粒徑、形狀及分散度的測定：

制樣方法為將CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs稀釋至一定濃度，然后滴在襯有高分子膜的銅網(wǎng)上成膜，緩慢干燥后于樣品上蒸鍍一層約10-20nm厚的碳膜，透射電鏡(JEOL-TEM 100)觀察并攝片，圖5為透射電鏡下CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的分布情況及形狀，可以看出其表面形狀為圓形，基本為單顆粒分散，但因其粒徑小，且表面含有多種活性基團，故鏡下可見輕微聚集現(xiàn)象。從中隨機選取100個納米顆粒，利用軟件測量其粒徑，可得平均粒徑8.116±0.24nm，并繪制成直方圖如圖6所示，由圖可知其分布為正態(tài)對稱分布。

測試?yán)?：

傅里葉變換紅外光譜測定：

取1～2mg的樣品在瑪瑙研缽中與干燥的溴化鉀粉末(A.R.級)混合并研磨成細粉末，裝入模具內(nèi)，在壓片機上壓制成片后在NEXVS 670FTIR(美國Nicolet公司)上測試。

SA及ASA：圖7顯示，3700～3100cm^-1為0-H的伸縮振動，1600cm^-1附近的吸收峰為羧酸鹽(―COO^-)基團的非對稱伸縮振動；1410cm^-1附近的吸收峰為羧酸鹽(―COO^-)基團的對稱伸縮振動；1030cm^-1附近的吸收峰為C-O伸縮振動；均為海藻酸鈉的典型吸收峰。與SA相類似，ASA上1603cm^-1及1411cm^-1附近的深寬吸收峰為海藻酸鈉羧酸鹽(―COO^-)基團的非對稱及對稱伸縮振動，說明海藻酸鈉氧化后并未改變表面的羧基基團，為表面修飾Fe₃O₄及偶聯(lián)CDDP提供了條件。但醛基的C＝O無明顯的峰出現(xiàn)，與2，3-CHO之間形成半縮醛有關(guān)。

SAMNPs及ASAMNPs：SAMNPs及ASAMNPs分別在609及615cm^-1附近出現(xiàn)了Fe-O鍵的伸縮振動，由此可以證明，SA及ASA都成功的吸附在Fe₃O₄的表面。

測試?yán)?：

紫外光譜測定：

紫外光譜顯示，與ASAMNPs相比，F(xiàn)A-PEG-ASAMNPs在350nm及366nm各出現(xiàn)了一個明顯的吸收峰，而葉酸也在360nm附近出現(xiàn)了明顯的吸收峰，故FA-PEG-ASAMNPs的吸收峰應(yīng)該為葉酸上的苯環(huán)上的共軛鍵所產(chǎn)生(圖8)，由此表明葉酸已連接在ASAMNPs上。

測試?yán)?：

飽和磁化強度的測定和磁響應(yīng)性評定

25℃條件下，-10KOe～10KOe范圍內(nèi)掃描樣品的磁滯曲線，如圖9所示為ASA-MNPs的磁化曲線圖。分別取兩個5ml離心管，取葉酸修飾的載順鉑磁性納米藥物CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs8ml，分裝到兩個離心管中，每管4ml，其中一個放置到恒定磁場中，2小時后觀察磁性粒子分布情況。

測試?yán)?

CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN中的葉酸成分及含量測定：

由于葉酸分子包含高度共軛的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在363nm處存在特征性的強吸收峰，利用這個特點可采用紫外光分光光度計法分析該磁性納米復(fù)合物中的葉酸成分結(jié)構(gòu)及測定含量，先稱取適量葉酸于蒸餾水稀釋溶解充分混勻，得到含葉酸1mg.ml^-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸棄0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml標(biāo)準(zhǔn)FA溶液于8只50ml的容量瓶中，分別加入蒸餾水至50ml，搖勻后，用1cm比色杯，以蒸餾水作空白對照，在紫外-可見分光光度計363nm波長測定各濃度的吸光度(OD值)。根據(jù)葉酸的不同濃度和相對應(yīng)的363nm波長下吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度OD值為橫坐標(biāo)，葉酸濃度為縱坐標(biāo)。測定磁性納米復(fù)合物稀釋10倍后的吸光度值，重復(fù)5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來得出其葉酸濃度。

從圖10、11、12可以看出，葉酸有個特征峰在363nm處，連上葉酸的FA-PEG-NH₂及FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性納米復(fù)合物都可檢測到這處特征峰，可見均連上了葉酸。

由圖13可見，在0～100μg.ml^-1范圍內(nèi)FA的含量與OD值有良好的線性關(guān)系(回歸公式Y(jié)＝112.08X-0.3832；R²＝0.9996)。FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN磁性納米稀釋10倍后的吸光度值為0.8508±0.0013，按此方法測得該納米復(fù)合物中葉酸的濃度為0.9498±0.0014mg.ml^-1。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。