本發(fā)明涉及含有作為活性成分的能夠刺激彈性蛋白和膠原蛋白的生物合成的氨基酸混合物的組合物。發(fā)明背景真皮是皮膚的中間部分，其執(zhí)行支撐和營(yíng)養(yǎng)功能，并整體上賦予皮膚的強(qiáng)度、彈性、緊漲度(turgidity)和代謝活力。真皮包含稱為成纖維細(xì)胞的細(xì)胞，即間充質(zhì)來(lái)源的特定細(xì)胞，其不斷再生主要由糖胺聚糖(gag)和蛋白聚糖(pg)、分別具有糖苷和糖肽性質(zhì)的親水性物質(zhì)組成的間質(zhì)基質(zhì)。所述大分子保留大量的水，構(gòu)成凝膠形式的親水網(wǎng)絡(luò)，其中浸沒(méi)有所有賦予皮膚其強(qiáng)度和色調(diào)(tone)的纖維蛋白質(zhì)。成纖維細(xì)胞還負(fù)責(zé)彈性蛋白的合成，彈性蛋白是具有彈性的蛋白質(zhì)，其使皮膚和粘膜具有適應(yīng)其經(jīng)歷的形態(tài)和機(jī)械變化的基本特性。彈性蛋白能夠延伸達(dá)其自身長(zhǎng)度的7倍并恢復(fù)其尺寸模量(dimensionalmodulus)而沒(méi)有顯著的分子改變，并且理論上可以無(wú)限次重復(fù)這種拉伸。稱為皮膚老化和光老化的病癥表示涉及細(xì)胞、表面組織結(jié)構(gòu)以及最重要的深層組織結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜的生物化學(xué)現(xiàn)象的客觀皮膚病學(xué)表現(xiàn)。光老化使皮膚表面出現(xiàn)不同數(shù)量和深度的皺紋(特別是暴露于光的部位(面部、領(lǐng)口和軀干))、彈性組織變性和或多或少的彌漫性色素斑、表皮增厚和雀斑。位于真皮組織的遠(yuǎn)端部分(網(wǎng)狀真皮層)的彈性蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)所代表的皮膚的彈性組分，由于上述光老化現(xiàn)象而發(fā)生顯著改變，引起皮膚的總彈性能力顯著損失。在宏觀層面上，所述現(xiàn)象降低了皮膚結(jié)締組織適應(yīng)機(jī)械拉伸的能力，導(dǎo)致組織下垂和彈性組織變性。編碼蛋白質(zhì)彈性蛋白原(其為彈性蛋白前體)的基因(eln-基因)是唯一的；不存在編碼不同形式的彈性蛋白的數(shù)種基因(超家族)，如膠原蛋白的情況[1]。所述基因編碼不同形式的彈性蛋白原(因此，對(duì)于健康和新形成的組織，例如應(yīng)對(duì)諸如燃燒或光老化的物理?yè)p傷，可能存在不同的彈性蛋白原編碼過(guò)程)。它在胎兒階段已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)，在生命的頭5年保持活躍，然后急劇減緩，直到其停止活動(dòng)[1,2]。換言之，結(jié)締組織的彈性組分，特別是真皮、粘膜、軟骨組織、內(nèi)膜、肺和瓣膜/心肌結(jié)締組織的彈性組分已經(jīng)在生命的早期停止合成了。所述組分因此代表身體的“彈性供應(yīng)”，并且在其壽命期間永遠(yuǎn)不會(huì)補(bǔ)充，除非發(fā)生嚴(yán)重的組織損傷，例如灼傷和嚴(yán)重的光老化。在這些情況下，存在lox(賴氨酸氧化酶)基因的過(guò)度表達(dá)，其編碼5種不同的酶，催化彈性蛋白原前體分子中賴氨酸殘基的氧化，這是合成功能性彈性蛋白、及其隨后摻入附著在細(xì)胞表面的微原纖維的必要步驟[3,4]。特別地，所述酶依賴性過(guò)程由以下組成：賴氨酸氧化和同時(shí)的l-lys的氨基與醛糖形成希夫堿(引起交聯(lián)的分子內(nèi)鍵合)[5,6]。彈性蛋白是唯一的結(jié)締組織蛋白質(zhì)，其基本上不會(huì)被替代，并且保持不變達(dá)70年以上(平均半衰期為74歲)。在膠原蛋白的情況下，iv型膠原蛋白在構(gòu)建基底真皮表皮膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的超分子組織的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，特別是基質(zhì)中的細(xì)胞取向。膠原蛋白iv缺乏與人體皮膚的營(yíng)養(yǎng)和彈性功能的喪失密切相關(guān)，特別是在典型具有皮膚老化和光老化的皮膚退化現(xiàn)象中[7,8]。如果適當(dāng)?shù)財(cái)y帶并局部應(yīng)用或口服，氨基酸和寡肽的特定組合已知促進(jìn)在真皮表皮結(jié)締組織、粘膜和關(guān)節(jié)軟骨中引起新的蛋白質(zhì)合成的基因表達(dá)，尤其是膠原蛋白和彈性蛋白原的合成[9,10,11,12]。在皮膚老化和光老化中真皮表皮組織的彈性功能的逐漸衰減中涉及的主要現(xiàn)象之一表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞(負(fù)責(zé)膠原蛋白和彈性蛋白再生的細(xì)胞)的生物合成活性和皮膚細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的進(jìn)行性喪失。由于這種現(xiàn)象，在新的結(jié)構(gòu)真皮蛋白和親水細(xì)胞外基質(zhì)的合成不足或低合成的事件中，稱為彈性蛋白酶、金屬蛋白酶、膠原酶和明膠酶的特定分解代謝酶對(duì)它們的降解增加[13,14,15]。所述酶在老化的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的線粒體中被過(guò)度表達(dá)和合成，使“合成-破壞”平衡向破壞移動(dòng)，導(dǎo)致組織緩慢但漸行性地退化，從而變得較不緊實(shí)，彈性較小，含水較少(gag、pg和纖維彈性蛋白(fibroelastin)組分不足)。為了抑制或至少限制所述現(xiàn)象(部分是生理性的，但由于各種環(huán)境和遺傳原因而加劇)，有必要在所有存在成纖維細(xì)胞的區(qū)域促進(jìn)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(彈性蛋白原和膠原蛋白)合成的基因的表達(dá)，同時(shí)減少負(fù)責(zé)編碼金屬蛋白酶的基因的表達(dá)，特別是那些專(zhuān)門(mén)從事膠原蛋白和彈性蛋白降解的酶(膠原酶和彈性蛋白酶)。鑒于基質(zhì)降解酶、尤其是膠原酶和彈性蛋白酶的基因高表達(dá)介導(dǎo)的分解代謝活動(dòng)增加，將具有證實(shí)的抑制所述酶表達(dá)的活性的物質(zhì)局部或注射應(yīng)用直接進(jìn)入皮膚表皮組織、粘膜或關(guān)節(jié)特別有戰(zhàn)略上的意義。特別是n-乙酰半胱氨酸，即硫酸化氨基酸l-半胱氨酸的n-乙酰化形式，表現(xiàn)出明顯的抑制由光照射引起的金屬?gòu)椥缘鞍酌傅谋磉_(dá)的作用[16]。其同時(shí)引入發(fā)揮彈性和膠原活性的聚氨基酸組合物可有利地用于促進(jìn)結(jié)締組織的彈性蛋白和膠原蛋白含量的恢復(fù)和維持。透明質(zhì)酸(ha)是結(jié)締組織無(wú)定形間質(zhì)基質(zhì)中存在的主要gag。gag(糖胺聚糖)是由重復(fù)的單糖或二糖單元組成的多糖分子；透明質(zhì)酸是由n-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸組成的聚葡萄糖二聚體。ha是唯一分子不包含硫酸根基團(tuán)的gag，和唯一具有無(wú)支鏈線性結(jié)構(gòu)的gag。存在于結(jié)締組織的無(wú)定形基質(zhì)中的其他gag以及諸如肌腱和軟骨的其他結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的組分是硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和肝素。ha在ecm中具有極其重要的水合功能，促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，營(yíng)養(yǎng)和可溶性蛋白質(zhì)因子的交換，并調(diào)節(jié)纖維結(jié)締組織基質(zhì)的再生和組織(organisation)的生化現(xiàn)象。用于注射、局部或口服使用的氨基酸的混合物公開(kāi)于ep2033689、wo2007/048522和wo2011/064297中。然而，所公開(kāi)的組合物均不包含能夠刺激膠原蛋白和彈性蛋白二者的合成的適合比例的甘氨酸、l-脯氨酸、l-丙氨酸、l-纈氨酸、l-亮氨酸和l-賴氨酸鹽酸鹽的混合物。發(fā)明描述本發(fā)明涉及包含氨基酸混合物的組合物，其選擇性地觸發(fā)編碼彈性蛋白原(eln)、賴氨酸氧化酶(loxl-1)和iv型膠原蛋白(col4a1)的基因的表達(dá)，并抑制編碼金屬?gòu)椥缘鞍酌傅幕虻谋磉_(dá)。根據(jù)本發(fā)明的氨基酸混合物按以下重量比由甘氨酸、l-脯氨酸、l-丙氨酸、l-纈氨酸、l-亮氨酸和l-賴氨酸鹽酸鹽組成：-甘氨酸:1；-l-脯氨酸:0.7-0.8；-l-丙氨酸:0.47-0.76；-l-纈氨酸:0.35-0.56；-l-亮氨酸:0.13-0.27；-l-賴氨酸鹽酸鹽:0.10-0.12。l-半胱氨酸或n-乙酰基-l-半胱氨酸還可以以占總氨基酸混合物的1至20％范圍的重量百分比存在。優(yōu)選的重量比是：-甘氨酸:1；-l-脯氨酸:0.75；-l-丙氨酸:0.48-0.51；-l-纈氨酸:0.35-0.37；-l-亮氨酸:0.13-0.15；-l-賴氨酸鹽酸鹽:0.10-0.11，或：-甘氨酸:1；-l-脯氨酸:0.75；-l-丙氨酸:0.75-0.76；-l-纈氨酸:0.54-0.56；-l-亮氨酸:0.13-0.14；-l-賴氨酸鹽酸鹽:0.10-0.11，或-甘氨酸:1；-l-脯氨酸:0.75；-l-丙氨酸:0.75-0.76；-l-纈氨酸:0.54-0.56；-l-亮氨酸:0.13-0.14；-l-賴氨酸鹽酸鹽:0.10-0.11，或-甘氨酸:1；-l-脯氨酸:0.75；-l-丙氨酸:0.49-0.51；-l-纈氨酸:0.35-0.36；-l-亮氨酸:0.26-0.27；-l-賴氨酸鹽酸鹽:0.10-0.11。所述組合物可以是適于口服施用的形式，例如溶液劑、顆粒劑、可分散的粉末、片劑或膠囊劑。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以含有平均分子量在500,000至3,000,000da的范圍的透明質(zhì)酸或其鹽、特別是透明質(zhì)酸鈉，其百分比范圍為總組合物的0.01至3重量％。含有上述氨基酸混合物和透明質(zhì)酸的所述組合物適用于局部或可注射應(yīng)用?？捎弥苿┑膶?shí)例包括凝膠劑、軟膏劑、乳劑、透皮貼劑、無(wú)菌溶液劑和設(shè)計(jì)為要用透明質(zhì)酸化合物(hyaluronates)的無(wú)菌水溶液重新溶解配置的無(wú)菌氨基酸粉末。在口服制劑的情況下，甘氨酸的單位劑量范圍為100至1500mg。在注射制劑的情況下，甘氨酸的單位劑量范圍為10至50mg，透明質(zhì)酸或其鈉鹽的單位劑量為10至100mg。在局部制劑的情況下，甘氨酸濃度范圍可以為0.1至2％mg/ml。根據(jù)本發(fā)明的組合物可用于治療由光老化引起的彈性組織變性和真皮表皮萎縮、皮膚萎縮(dermoatrophic)和醫(yī)源性原因(iatrogenicbase)的皮膚病[17]、燒傷(包括放射性燒傷)、皮膚病損、褥瘡、由藥物(抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物、抗hiv藥物、皮質(zhì)類(lèi)固醇或化療藥)引起的真皮發(fā)育不良(dermalaplasia)、腱和關(guān)節(jié)病變。使用體外轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氨基酸的混合物在人成纖維細(xì)胞孵育120小時(shí)后誘導(dǎo)編碼彈性蛋白原(eln)和iv型膠原蛋白(coliv)的基因的表達(dá)增加。令人驚訝的是，如果即使氨基酸混合物中的一種氨基酸被除去或重量比改變，則所述效果就不再存在。以與鈉鹽形式的透明質(zhì)酸凝膠化的水溶液形式的氨基酸的遞送，恢復(fù)皮膚基質(zhì)的可塑性，并確保真皮表皮區(qū)域中氨基酸保留足夠的時(shí)間以誘導(dǎo)所需的生物效應(yīng)。將無(wú)菌粉末形式的氨基酸溶解在無(wú)菌的透明質(zhì)酸鈉鹽溶液中(這通過(guò)將透明質(zhì)酸(鈉鹽)凝膠直接(例如用真皮植入注射器)引入含有粉末的小瓶中來(lái)進(jìn)行)，可以制備注射劑。當(dāng)完全溶解時(shí)，將所得凝膠溶液注入真皮表皮區(qū)域。無(wú)菌的透明質(zhì)酸鈉鹽水溶液可含有ph校正緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液)或滲透壓校正劑(例如氯化鈉)和能夠保證無(wú)菌可注射藥物形式所需的物理化學(xué)和組織相容性特征的其它技術(shù)輔助劑。在以下實(shí)施例中詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1透明質(zhì)酸鈉的無(wú)菌溶液無(wú)菌氨基酸粉末實(shí)施例2透明質(zhì)酸鈉的無(wú)菌溶液無(wú)菌氨基酸粉末實(shí)施例3透明質(zhì)酸鈉的無(wú)菌溶液無(wú)菌氨基酸粉末實(shí)施例4基于氨基酸和透明質(zhì)酸鈉的局部用水凝膠實(shí)施例5用于口服溶液劑的小藥囊(條狀包裝(stickpack))mg/20ml條狀包裝甘氨酸1208mgl-脯氨酸908mgl-亮氨酸168mgl-賴氨酸hcl132mgl-纈氨酸672mgl-丙氨酸912mg賦形劑：防腐劑：苯甲酸鈉、山梨酸鉀；酸度調(diào)節(jié)劑：檸檬酸、檸檬酸鈉。功效測(cè)試通過(guò)與對(duì)照混合物和透明質(zhì)酸混合物的比較，評(píng)價(jià)根據(jù)本發(fā)明的氨基酸混合物在保持膠原蛋白刺激的同時(shí)，在刺激產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分、特別是彈性蛋白的新合成(neosynthesis)中、以及促進(jìn)彈性纖維的更有效的沉積(彈性生成)中的功效。使用標(biāo)準(zhǔn)化人成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。構(gòu)造試驗(yàn)設(shè)計(jì)以評(píng)估彈性蛋白和膠原蛋白的基因表達(dá)。在以下時(shí)間點(diǎn)通過(guò)rt-qpcr評(píng)價(jià)基因表達(dá)：24、72和120小時(shí)。通過(guò)westernblot技術(shù)在120小時(shí)評(píng)價(jià)所述基質(zhì)蛋白質(zhì)的生成。進(jìn)行氨基酸和透明質(zhì)酸混合物的細(xì)胞毒性的初步評(píng)估，以確定沒(méi)有細(xì)胞毒性的最大測(cè)試濃度?；谒@得的數(shù)據(jù)選擇1000μg/ml的濃度。轉(zhuǎn)錄研究結(jié)果該研究包括陰性對(duì)照(nc)，對(duì)應(yīng)未處理的成纖維細(xì)胞(生理反應(yīng))。僅由構(gòu)成膠原蛋白的氨基酸(gly、l-pro、l-lys、l-leu)組成的混合物a不誘導(dǎo)顯著的基因表達(dá)。相反，由膠原蛋白和彈性蛋白中最多表達(dá)的氨基酸(gly、l-pro、l-lys、l-leu、l-ala和l-val)組成的，所測(cè)試的含有六種氨基酸的兩種混合物c和d，在120小時(shí)后誘導(dǎo)eln(彈性蛋白)和coliv(膠原蛋白iv)基因的顯著調(diào)節(jié)。所測(cè)試的混合物的組成列于下表中。通過(guò)與對(duì)照比較來(lái)量化彈性蛋白(eln)和膠原蛋白iv(coliv)的基因表達(dá)。ncacdeln11.4782.1212.164coliv11.4842.4643.197圖1顯示了翻譯后研究的結(jié)果如圖所示，混合物a僅誘導(dǎo)膠原蛋白的產(chǎn)生，而混合物c和d顯著調(diào)節(jié)彈性蛋白和膠原蛋白iv的產(chǎn)生。使用nc作為參考，相對(duì)定量蛋白質(zhì)膠原蛋白iv和彈性蛋白。討論圖2中的圖顯示了基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行的單層人成纖維細(xì)胞研究的結(jié)果，證明只有某些氨基酸混合物(任選地與透明質(zhì)酸組合)才能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的生物合成，尤其是促進(jìn)彈性生成(elastogenesis)。只有根據(jù)本專(zhuān)利中公開(kāi)的比例組合的氨基酸混合物增加彈性蛋白的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，并增強(qiáng)膠原蛋白(特別是膠原蛋白iv)的刺激。應(yīng)當(dāng)注意，基質(zhì)的完整性和質(zhì)量不限于膠原蛋白，而是限于由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的所有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的生成和生理相互作用、尤其是彈性蛋白。事實(shí)上，膠原蛋白和彈性蛋白保持基質(zhì)中的各向異性(anisotropy)，即所產(chǎn)生的纖維傳送張力的能力，這是一種隨著年齡而喪失的特征。還已經(jīng)證明，所討論的氨基酸的混合物引起生理彈性蛋白基因誘導(dǎo)，其動(dòng)力學(xué)與對(duì)uv輻照的應(yīng)答非常不同，在uv輻照中彈性蛋白的出現(xiàn)迅速快速、無(wú)序，并且通過(guò)誘導(dǎo)彈性蛋白酶實(shí)際上引起降解。結(jié)論這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，只有根據(jù)本發(fā)明的混合物促進(jìn)這兩種蛋白質(zhì)的顯著生成。因此已經(jīng)證明，不僅存在誘導(dǎo)機(jī)制，而且產(chǎn)生的mrna編碼功能性蛋白質(zhì)。參考文獻(xiàn)1.bashir,mm等人.(1989),jbiolchem264,8887-8891。2.chen,z等人,(2009),expdermatol18,378-386。3.indikz等人,(1989),amjmedgenet34,81-90。4.cenizov等人,(2006),expdermatol15,574-581。5.maki等人,(2005),amjpathol167,927-936。6.noblesse等人,(2004),jinvestdermatol122,621-630。7.abreu-velezam等人,namjmedsci.2012一月；4(1):1-8。8.vázquezf等人,maturitas.1996nov；25(3):209-15。9.lupomp等人,(2007).cosmeceuticalpeptides.dermatolther20,343-349。10.reddyb等人,bioactiveoligopeptidesindermatology:parti.expdermatol.2012八月；21(8):563-8.doi:10.1111/j.1600-0625.2012.01528.x.epub2012jun4。11.proksche等人,skinpharmacolphysiol.2014；27(3):113-9。12.dioguardifs,(2008)nov-cec；26(6):636-40。13.fishergj等人,jinvestdermatol.2001八月；117(2):219-26。14.rijkenf等人,jinvestigdermatolsympproc.2009八月；14(1):67-72.doi:10.1038/jidsymp.2009.15。15.quant等人,jinvestigdermatolsympproc.2009八月；14(1):20-4.doi:10.1038/jidsymp.2009.8。16.chungjh等人,jinvestdermatol.2002八月；119(2):507-12。17.schoepes等人,expdermatol.2006一月；15(6):406-20。當(dāng)前第1頁(yè)12