用于安全和有效的溶栓的方法和組合物與流程
本發(fā)明涉及安全和有效的溶栓的方法和組合物。
發(fā)明背景
當(dāng)血管內(nèi)形成血液凝塊(血栓)并阻塞血液流動(dòng)通過循環(huán)系統(tǒng)時(shí)，發(fā)生血栓形成。當(dāng)血管受損時(shí)，身體使用血小板和纖維蛋白形成血液凝塊，以密封受損的血管并防止失血。這個(gè)過程被稱為止血。即使當(dāng)血管沒有受損時(shí)，在某些情況下也可能在體內(nèi)形成血液凝塊。血液凝塊主要由聚集的血小板和交聯(lián)的纖維蛋白網(wǎng)組成，其是血液中纖維蛋白原的天然聚合物。當(dāng)血栓大到足以減少至組織的血流時(shí)，可能會(huì)發(fā)生缺氧(hypoxia/anoxia)，導(dǎo)致組織損傷甚至組織死亡。根據(jù)在動(dòng)脈系統(tǒng)中的位置，即心臟、腦或腿，血栓可引發(fā)心臟病發(fā)作、中風(fēng)或外周壞疽。在靜脈循環(huán)中，相同的過程可引起血栓性靜脈炎(深靜脈血栓形成)或肺栓塞?？傊?，在工業(yè)化國(guó)家，這些心血管疾病構(gòu)成了死亡和殘疾的主要原因。
溶栓主要涉及使用溶栓藥物來溶解引起疾病的血液凝塊并恢復(fù)血流。當(dāng)前使用的溶栓藥物如tpa及其衍生物通過將酶原纖溶酶原激活為蛋白酶纖溶酶而起作用，所述蛋白酶纖溶酶降解血液凝塊中的纖維蛋白網(wǎng)，使凝塊溶解，從而使血流恢復(fù)通過閉塞的血管。然而，目前的溶栓藥物也會(huì)引起密封傷口的止血纖維蛋白的降解，并在血漿中產(chǎn)生降解三種凝血因子即纖維蛋白原、因子v和因子vii(血友病因子)的纖溶酶。因此，目前的溶栓治療具有由于血友病樣副作用或止血纖維蛋白降解引起的出血的風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)符合治療條件的患者的數(shù)目施加了嚴(yán)重限制，并限制了可使用的溶栓劑量。因此，只有約5％的中風(fēng)患者接受治療，且這種治療的療效有限。
中風(fēng)可以由血液凝塊或腦中血管出血引起。然而，正確診斷中風(fēng)的具體原因需要ct掃描或mri，如果不能立即獲得，則可能會(huì)延遲治療。在沒有這樣適當(dāng)?shù)脑\斷下，如果原因碰巧是出血而不是血液凝塊，則施用凝塊溶解劑如組織纖溶酶原激活物(“tpa”)可能是非常危險(xiǎn)的，因?yàn)橄蚰X出血患者施用tpa或其他溶栓劑可能是致命的。
發(fā)明概述
本公開至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：tpa和尿激酶原突變體(“prouk突變體”或“mprouk”)的獨(dú)特和不同的特異性意味著，例如對(duì)于治療中風(fēng)或急性心肌梗塞(“ami”)，相比以高劑量使用單獨(dú)的任一種(單一療法)可能達(dá)到最大的血液凝塊溶解速率，但伴隨高的出血并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，每一種均為小劑量的組合誘導(dǎo)更快且更安全，即更特異的且伴隨更低的出血并發(fā)癥發(fā)生率的溶栓。
mprouk可包含在尿激酶原的氨基酸位置300處的賴氨酸被組氨酸的替換(lys300→his)，在本文稱為“m5”。mprouk(與prouk一樣)是一種酶原，即活性酶的無活性前體。它與prouk的不同之處在于，其酶形式的突變型尿激酶或muk(與尿激酶(uk)不同)受到血漿抑制劑c1-抑制劑的抑制，c1-抑制劑除了較低的必要?jiǎng)┝恐膺€有助于減少利用pro-uk所觀察到的出血性副作用，所述出血性副作用是由于在血漿中針對(duì)uk的抑制劑(纖溶酶原激活物抑制劑-1，pai-1)不足。
對(duì)于中風(fēng)或ami患者，溶栓和再灌注所需的時(shí)間對(duì)臨床結(jié)果和存活率至關(guān)重要。這意味著治療必須足夠安全，以便無需進(jìn)行初步診斷測(cè)試即可在醫(yī)院外進(jìn)行。然而，只有在出血風(fēng)險(xiǎn)大大降低或消除時(shí)，這才是可能的，如本文所述新方法的情況，包括組合施用微量的tpa(例如，小于5.0mg的彈丸劑，例如小于或等于4.5mg、4.0mg、3.5mg、3.0mg、2.5mg或2.0mg)和低劑量的mprouk(例如以60-120mg/h的速率，例如60-90mg/h，如60、65、70、75、80、85或90mg/h，進(jìn)行輸注持續(xù)60-90min，如60、70、80或90min)。
如果在給定對(duì)象中內(nèi)源性c1-抑制劑濃度不足，則可以在新方法中通過施用有效量的c1-抑制劑來補(bǔ)充，所述c1-抑制劑例如市售的c1-抑制劑，如
在第一方面，本文提供了以最大的血液凝塊溶解速率和最小的相關(guān)出血性副作用來治療具有中風(fēng)或急性心肌梗塞(ami)癥狀的對(duì)象(如人類患者)的方法，所述方法包括：(a)通過觀察中風(fēng)或ami的一種或多種癥狀來鑒定潛在地患有中風(fēng)或ami的對(duì)象，而不確定中風(fēng)的原因；和(b)向所述對(duì)象施用含有小劑量，即小于5mg組織纖溶酶原激活物(tpa)，例如2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5mgtpa的第一組合物的彈丸劑，然后以60-120mg(例如60、70、75、80、85、90、100或120mg/h)的低劑量速率，靜脈內(nèi)輸注包含低劑量的尿激酶原突變體(mprouk)的第二組合物，輸注60-90min，例如60、65、70、75、80、85或90min；其中以最小的相關(guān)出血性副作用實(shí)現(xiàn)最大的凝塊溶解速率。
在這些方法的一些實(shí)施方案中，最小的相關(guān)出血性副作用可以被確定為對(duì)象血液中纖維蛋白原降解的水平低于約30％，例如小于27.5％、25％、22.5％或20％的纖維蛋白原降解(然而，在使用任一種單獨(dú)的組合物進(jìn)行的單一療法中，纖維蛋白原降解為約50％-80％)。在一些實(shí)施方案中，最大的凝塊溶解速率被表示為通過2或更高的心肌梗塞溶栓(timi)評(píng)分來實(shí)現(xiàn)的。在其他實(shí)施方案中，最大的凝塊溶解速率被表示為通過在75min內(nèi)，例如在70、60、50、40、04、30min內(nèi)實(shí)現(xiàn)的溶解對(duì)象中至少一個(gè)凝塊的約50％的質(zhì)量來實(shí)現(xiàn)的。
在這些方法中，尿激酶原突變體可以包含在尿激酶原的氨基酸位置300處的賴氨酸被組氨酸的替換(lys300→his)。所述方法可以包括在施用第一組合物后5、10或15min內(nèi)開始施用第二組合物。在一些實(shí)施方案中，第一組合物和第二組合物在少于1h內(nèi)共同溶解對(duì)象中至少一個(gè)血液凝塊的50％的質(zhì)量。
在某些實(shí)施方案中，所述方法可以進(jìn)一步包括向?qū)ο笫┯冒琧1-抑制劑的彈丸劑的第三組合物。第三組合物可以在施用第二組合物之前或大約同時(shí)(例如5min內(nèi))施用于對(duì)象。在某些實(shí)施方案中，以足以建立對(duì)象血液中約500-750μg/ml的c1-抑制劑濃度的量施用第三組合物。在一些實(shí)施方案中，第三組合物是500-1500mgc1-抑制劑的彈丸劑。
在這些方法的一些方法中，當(dāng)與通過單獨(dú)的tpa或尿激酶原進(jìn)行的單一療法相比時(shí)，在c1-抑制劑存在下，第一組合物和第二組合物共同溶解血液凝塊并伴有小于30％的纖維蛋白原降解。
在另一方面，本公開提供了包括在第一容器中的第一組合物和在第二容器中的第二組合物的試劑盒；所述第一組合物包含2-5mg組織纖溶酶原激活物(tpa)，所述第二組合物包含60-120mg尿激酶原突變體(mprouk)，所述尿激酶原突變體含有在尿激酶原的氨基酸位置300處的賴氨酸被組氨酸的替換(lys300→his)。在這些試劑盒中，第一組合物可以被配制成適于作為彈丸劑施用，和/或第二組合物可以被配制成適于靜脈內(nèi)輸注。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包括包含500-1500mgc1-抑制劑的第三組合物，例如其被配制成適于作為彈丸劑施用。
在另一方面，本公開提供了用于本文所述方法中任何一種的組合物。在某些實(shí)施方案中，組合物用于以最大的凝塊溶解速率和最小的相關(guān)出血性副作用治療具有中風(fēng)或急性心肌梗塞(ami)癥狀的對(duì)象。這些組合物包括第一組合物和第二組合物；所述第一組合物包含小于5mg組織纖溶酶原激活物(tpa)，其中所述第一組合物被或被制備好以彈丸劑的劑量方案施用于對(duì)象；所述第二組合物包含尿激酶原突變體(mprouk)，其中在施用所述第一組合物后，所述第二組合物被或被制備好以60-120mg/h持續(xù)60-90min的劑量方案通過靜脈內(nèi)輸注施用于對(duì)象；其中在施用第一組合物之前，通過觀察中風(fēng)或ami的一種或多種癥狀將對(duì)象鑒定為潛在地患有中風(fēng)或ami，而不確定中風(fēng)的原因；和其中以最小的相關(guān)出血性副作用實(shí)現(xiàn)最大的凝塊溶解速率。這些組合物可以包括本文所述的所有特征和成分。
術(shù)語“治療”或“治療處理”是指向?qū)ο笫┯靡环N或多種藥劑或者在對(duì)象的身體上實(shí)施醫(yī)療程序。術(shù)語治療處理還包括對(duì)象可能在接受的一種或多種藥劑的劑量或頻率的調(diào)整(例如，增加或減少)，向?qū)ο笫┯靡环N或多種新的藥劑，或者從對(duì)象的治療計(jì)劃中移除一種或多種藥劑。
如本文所用，“對(duì)象”或“患者”是人。
本文使用的“有效量”是足以實(shí)現(xiàn)溶栓而不引起顯著的出血性或血友病樣副作用的量。有效量可以在一個(gè)或多個(gè)施用、應(yīng)用或劑量中給予。藥物組合物的治療有效量(即有效劑量)取決于所選擇的藥物組合物。
血液凝塊的“最大溶解速率”，在本文中被定義為這樣的血液凝塊溶解速率，其至少與利用tpa、prouk或mprouk進(jìn)行單一療法可以在最大有效劑量(即，此時(shí)通過添加額外的藥物無法實(shí)現(xiàn)更快的凝塊溶解的藥物劑量，例如，在最大有效劑量下顯示凝塊溶解速率的穩(wěn)定時(shí)期)時(shí)所達(dá)到的血液凝塊溶解速率一樣快，而沒有任何相關(guān)的出血性副作用。重要的是要注意，使用單一療法(例如用tpa或m5)實(shí)現(xiàn)的最大溶解速率將導(dǎo)致患者顯著的出血，例如，通過大于30％的纖維蛋白原降解水平所示。令人驚奇的是，本發(fā)明的治療方法達(dá)到最大溶解速率而無出血性副作用，其可以通過小于30％的纖維蛋白原降解水平所示，這不會(huì)與過量出血相關(guān)，并且為臨床上可接受的。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述類似或等同的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中，但在下文描述合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。在發(fā)生矛盾的情況下，本說明書(包括定義)將占據(jù)主導(dǎo)地位。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為示例性的而非旨在限制性的。
從以下發(fā)明詳述和權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
附圖簡(jiǎn)述
圖1a是顯示通過tpa在三個(gè)劑量(1、2或3μg/ml)下溶解熒光素標(biāo)記的血漿凝塊的曲線圖。tpa以飽和劑量溶解50％的血漿凝塊所用的時(shí)間為60min。圖1b是顯示在凝塊溶解結(jié)束時(shí)以基線(bl)百分比表示的剩余的纖維蛋白原的柱狀圖。
圖2a是顯示通過mprouk(m5)在三種劑量(10、12.5或15μg/ml)下溶解熒光素標(biāo)記的血漿凝塊的曲線圖。m5以飽和劑量溶解50％的血漿凝塊所用的時(shí)間為50min。圖2b是顯示在凝塊溶解結(jié)束時(shí)以基線(bl)百分比表示的剩余的纖維蛋白原的柱狀圖。圖2c是顯示mprouk(m5)溶解熒光素標(biāo)記的血漿凝塊所用的時(shí)間不受c1-抑制劑(750μg/ml)影響的曲線圖。圖2d是顯示通過c1-抑制劑(750μg/ml)阻止了由m5引起的纖維蛋白原溶解的柱狀圖。
圖3是顯示通過tpa(0.2μg/ml)和m5(6μg/ml)組合(圓形)的最大的凝塊溶解速率的曲線圖。所述組合誘導(dǎo)的凝塊溶解比單獨(dú)的0.2μg/mltpa(正方形)或6μg/mlm5(三角形)快得多。結(jié)果代表一式三份進(jìn)行的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
圖4a是顯示通過tpa(0.2μg/ml)和m5(6μg/ml)組合(圓形)的凝塊溶解的曲線圖。所述組合誘導(dǎo)的凝塊溶解比單獨(dú)的0.2μg/mltpa(正方形)或6μg/mlm5(三角形)快得多。圖4b是顯示在凝塊溶解結(jié)束時(shí)以基線(bl)纖維蛋白原的百分比表示的剩余的血漿纖維蛋白原的柱狀圖。結(jié)果代表按一式三份進(jìn)行的10個(gè)實(shí)驗(yàn)。
圖5a是顯示通過tpa(0.2μg/ml)和m6(6μg/ml)的組合以及c1-抑制劑(750μg/ml)的最大的凝塊溶解速率的曲線圖。向組合中加入c1-抑制劑沒有抑制溶解，但是它抑制單獨(dú)tpa引起的溶解。圖5b是顯示在凝塊溶解結(jié)束時(shí)以基線(bl)纖維蛋白原的百分比表示的剩余的血漿纖維蛋白原的柱狀圖。c1-抑制劑減弱纖維蛋白原溶解。
圖6是顯示當(dāng)與6μg/mlm5組合時(shí)，tpa劑量高于0.2μg/ml不再進(jìn)一步增強(qiáng)凝塊溶解速率的曲線圖。
圖7是顯示通過0.2μg/mltpa和6μg/mlm5(“tpa+m5”)的組合、0.2μg/mltpa(“tpa0.2”)、6μg/mlm5(“m56”)、15μg/mlm5(“m515”)、3μg/mltpa(“tpa3”)，溶解50％的血漿凝塊所需的平均時(shí)間的柱狀圖。數(shù)據(jù)從多個(gè)實(shí)驗(yàn)匯總(實(shí)驗(yàn)數(shù)量顯示在每個(gè)柱上方)。
圖8是顯示在不同測(cè)試條件下，即：(1)在2ml血漿中；(2)在2ml血漿加c1-抑制劑(500μg/ml)中；和(3)在5ml血漿中；通過0.2μg/mltpa和6μg/mlm5的組合，在凝塊溶解結(jié)束時(shí)剩余的纖維蛋白原(％bl)的柱狀圖。血漿體積的增加自然地降低了纖維蛋白原降解(人類對(duì)象的血漿體積平均為約3000ml)，因此在體內(nèi)不太可能需要使用c1-抑制劑，但可用于體外研究以更好地模擬體內(nèi)條件。
圖9是這樣的曲線圖，其顯示在不存在血液凝塊的情況下，通過0.2μg/mltpa和6μg/mlm5的組合，至少3h不存在纖維蛋白原溶解，這表明在體內(nèi)不存在凝塊的情況下該組合也將是無活性的。
圖10a是顯示大鼠模型中腦內(nèi)出血后血腫體積的柱狀圖。在給藥后2h通過血紅蛋白含量測(cè)量血腫體積。在給予c1-抑制劑/m5的動(dòng)物和給予鹽水/鹽水的動(dòng)物之間，沒有測(cè)定出顯著性差異(p＝0.5194)。因?yàn)榇笫笕鄙賛5/uk抑制劑，所以將c1-抑制劑包括在內(nèi)。
圖10b是顯示大鼠模型中腦內(nèi)出血后出血體積的組織學(xué)測(cè)定的柱狀圖。在給予c1-抑制劑/m5的動(dòng)物和給予鹽水/鹽水的動(dòng)物之間的出血體積沒有測(cè)定出顯著差異(p＝0.6899)。
發(fā)明詳述
本公開至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：通過施用小劑量組織纖溶酶原激活物(tpa)和低劑量尿激酶原突變體(“pro-uk突變體”或“mprouk”)，例如，包含在尿激酶原的氨基酸位置300處的賴氨酸被組氨酸替換(lys300→his)的mprouk(本文稱為“m5”)的組合，可以以最大的凝塊溶解速率實(shí)現(xiàn)溶栓以實(shí)現(xiàn)增加的血流量，例如在約75min內(nèi)的心肌梗塞溶栓(timi)評(píng)分為2或更高，并且沒有預(yù)期的出血風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于中風(fēng)或急性心肌梗塞患者，溶栓和再灌注所需的時(shí)間對(duì)于臨床結(jié)果和生存率至關(guān)重要。為使這成為可能，治療也必須足夠安全，以便能夠在住院前對(duì)患者進(jìn)行治療。本文提供了治療潛在地患有中風(fēng)或急性心肌梗塞的對(duì)象的方法。
這些方法可以用于治療具有中風(fēng)或急性心肌梗塞癥狀的患者，而沒有耗時(shí)的診斷程序引起的延遲，從而提高這些患者的更好臨床結(jié)果和存活率的機(jī)會(huì)。由于可以利用小劑量tpa和低劑量mprouk的組合實(shí)現(xiàn)纖維蛋白溶解，與高劑量纖溶酶原激活物方案相關(guān)的纖溶酶原的非特異性激活和血友病樣副作用可以降低到最低水平，同時(shí)仍然實(shí)現(xiàn)最大的凝塊溶解速率。本文還提供了用于本文所述方法中的包含第一組合物和第二組合物的試劑盒，所述第一組合物包含tpa，且所述第二組合物包含mprouk。
通過蛋白酶纖溶酶(其是纖溶酶原的活化形式)在三個(gè)步驟中溶解血液凝塊。步驟1：存在于血漿中的纖溶酶原在鄰近tpa結(jié)合位點(diǎn)的d結(jié)構(gòu)域上的特異性結(jié)合位點(diǎn)處與完整的纖維蛋白凝塊結(jié)合。tpa激活在這種所謂的“三元復(fù)合物”中的纖溶酶原，該三元復(fù)合物由纖維蛋白、纖溶酶原和tpa組成并引發(fā)纖維蛋白溶解。步驟2：纖溶酶在賴氨酸殘基之后優(yōu)先切割纖維蛋白，產(chǎn)生代表新的纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)的羧基末端賴氨酸。這些新產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)之一是由纖維蛋白e結(jié)構(gòu)域中三個(gè)c末端賴氨酸組成的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)纖溶酶原結(jié)合纖維蛋白e結(jié)構(gòu)域中的該位點(diǎn)時(shí)，其經(jīng)歷特殊的構(gòu)象變化，使其能夠通過pro-uk和mprouk的內(nèi)在催化活性而被活化。步驟3：通過pro-uk/mprouk激活纖溶酶原，伴隨著通過纖溶酶將pro-uk/mprouk相互激活為尿激酶(uk)/muk。然后uk/muk激活剩余的結(jié)合纖維蛋白的纖溶酶原，從而完成纖維蛋白溶解(參見，美國(guó)專利第5,055,295號(hào)；第5,472,692號(hào)；第5,626,841號(hào)；第5,759,542號(hào)；第7,074,401號(hào)；第7,837,992號(hào)；第8,187,592號(hào)；pannell,j.clin.invest.81:853-859,1988；zarich,jamcollcardiol1995；26:374-379；lee,ajnramjneuroradiol25:1470-1475,2004)。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如上所述的纖維蛋白溶解步驟如何支持本文所述的新的聯(lián)合治療方法。只有tpa可以有效地執(zhí)行步驟1，因?yàn)橹挥衪pa與纖維蛋白結(jié)合并與纖溶酶原形成三元復(fù)合物，并由完整的纖維蛋白或纖維蛋白片段d特異性地促進(jìn)。在正常條件下pro-uk/mprouk不與體內(nèi)纖維蛋白結(jié)合(即它僅在非常高的非特異性劑量下可以與纖維蛋白結(jié)合)。因此，步驟2僅可以通過pro-uk/mprouk有效地進(jìn)行，因?yàn)樗鼘?duì)當(dāng)其結(jié)合降解的纖維蛋白的纖維蛋白e結(jié)構(gòu)域時(shí)形成的纖溶酶原構(gòu)象具有高的底物親和力。纖維蛋白片段e對(duì)tpa沒有影響，tpa不與該結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且僅通過prouk/mprouk促進(jìn)纖溶酶原激活。因此，步驟3也僅由pro-uk/mprouk促進(jìn)，因?yàn)楫?dāng)prouk激活與纖維蛋白e結(jié)構(gòu)域結(jié)合的纖溶酶原時(shí)，通過纖溶酶將prouk相互激活為uk，uk通過激活剩余的結(jié)合纖維蛋白的纖溶酶原來完成溶解(相比之下，tpa未經(jīng)歷活化，因?yàn)槠湟绘満碗p鏈形式具有相同的活性)。tpa可以執(zhí)行步驟2和3的唯一方式是，處在與高出血風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的高的非特異性劑量。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以利用小劑量tpa(僅標(biāo)準(zhǔn)100mg劑量的2-5％)加上低劑量mprouk例如m5(單一療法劑量的40-50％)的組合，以最大的凝塊溶解速率并伴有小于約30％(例如，小于約25％或20％)的最小水平的纖維蛋白原降解來實(shí)現(xiàn)纖維蛋白溶解。該tpa-mprouk組合以最大溶解速率達(dá)到纖維蛋白溶解，該最大溶解速率至少與使用tpa或mprouk的單一療法在最大劑量下可達(dá)到的最大溶解速率相同，但具有低得多的纖維蛋白原降解水平，其為安全和臨床可接受的，因?yàn)樵谶@些較低水平上不會(huì)出現(xiàn)出血風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)已知的單一療法是不可能的。因此，本文所述的本發(fā)明方法提供明顯優(yōu)于任何已聲稱的協(xié)同組合的溶栓，其不包括新發(fā)現(xiàn)的針對(duì)患者的最大的血液凝塊溶解速率和最大安全性，即最小的相關(guān)出血性副作用的雙重益處。
血液凝塊的“最大溶解速率”，在本文中被定義為至少與利用最大有效劑量(即通過添加額外的藥物不能獲得更快的凝塊溶解的藥物劑量，例如，在最大有效劑量顯示凝塊溶解速率的穩(wěn)定時(shí)期)的tpa、prouk或mprouk的單一療法能夠達(dá)到的血液凝塊溶解速率一樣快的血液凝塊溶解速率。然而，重要的是要注意，使用單一療法(例如用tpa或m5)實(shí)現(xiàn)的最大溶解速率將導(dǎo)致患者顯著的出血，例如，如通過大于30％的纖維蛋白原降解水平所示。令人驚奇的是，通過本文所述的新方法實(shí)現(xiàn)的“最大安全性”，被定義為小于30％的纖維蛋白原降解，其不會(huì)與過量出血相關(guān)并且為臨床上可接受的。
例如，tpa-mprouk組合可以在少于1h的時(shí)間內(nèi)，例如48、50、55、60、65、70、75、或80min的時(shí)間內(nèi)，溶解至少一個(gè)血液凝塊，例如多個(gè)血液凝塊的50％的質(zhì)量。該組合還允許顯著降低使用的劑量，其纖維蛋白特異性更高、更安全和更經(jīng)濟(jì)。使用mprouk(例如m5)而不是天然的pro-uk，因?yàn)樵谥委焺┝肯耺prouk在血漿中更穩(wěn)定，并保持其纖維蛋白特異性酶原形式，而天然的pro-uk傾向于自發(fā)轉(zhuǎn)化為尿激酶，其為可引起出血并發(fā)癥的非特異性纖溶酶原激活物。這就是為什么pro-uk在歐洲被emea否決了市場(chǎng)準(zhǔn)入，隨后在這些國(guó)家也停止了發(fā)展。
如以下實(shí)施例所示，當(dāng)不存在血液凝塊時(shí)在血漿中孵育時(shí)，tpa-mprouk組合中使用的非常低的劑量不會(huì)引起纖維蛋白原的任何降解，因此預(yù)期相同的組合將對(duì)凝血或傷口愈合具有很小或無影響。另外，由于m5是酶原并且需要纖維蛋白將其活化，預(yù)期即使在出血的情況下，例如在出血性中風(fēng)期間，其也是安全的。此外，可用作藥理學(xué)試劑的c1-抑制劑可用于猝滅，例如，在體外進(jìn)行的測(cè)試以及在體內(nèi)的治療中，如果需要，纖維蛋白溶解期間可能形成的任何muk的任何非特異性活性(pannell，jthrombhaemost.5(5)：1047-54,2007)。這種c1-抑制劑效應(yīng)不是uk共享的，而是prouk突變體獨(dú)有的。
臨床上，tpa-mprouk聯(lián)合治療可用于治療具有中風(fēng)或心臟病發(fā)作癥狀的患者，而不會(huì)有因耗時(shí)的診斷程序造成的延遲，因治療中風(fēng)中的與tpa相關(guān)的明顯出血風(fēng)險(xiǎn)而導(dǎo)致目前該聯(lián)合治療是強(qiáng)制性的。可以在懷疑發(fā)病時(shí)或在救護(hù)車中進(jìn)行治療。由于時(shí)間對(duì)這些患者的生存和臨床結(jié)果非常重要，聯(lián)合治療提供比tpa作為單一療法更好的療效和結(jié)果，這是目前唯一批準(zhǔn)且可用的治療方案。tpa單一療法治療中風(fēng)的治療益處仍有爭(zhēng)議，最近其獲準(zhǔn)受到質(zhì)疑(sandercockp,lancet.2014aug23；384(9944):660-1)。mprouk優(yōu)先激活“不良”閉塞凝塊中的纖溶酶原，同時(shí)避免作用于“良好”傷口密封凝塊中的纖溶酶原。因此，打開止血部位的風(fēng)險(xiǎn)很小。相比之下，tpa靶向由完整纖維蛋白組成的部位，如上述步驟1中的纖維蛋白溶解。血漿中的游離纖溶酶原也受到c1-抑制劑作用的保護(hù)，因此引起血友病樣狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)較小。
可以通過例如用于評(píng)估血管再通的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定本發(fā)明方法的最大的凝塊溶解速率。例如，可以用類似于心肌梗塞溶栓(timi)評(píng)分來評(píng)估血管閉塞等級(jí)，其中timi評(píng)分為0是完全閉塞，timi為1是最小灌注，timi為2是部分流量(再通)，timi評(píng)分為3分是全部流量。根據(jù)對(duì)梗塞動(dòng)脈造影劑混濁率的視覺評(píng)估，timi研究組開發(fā)了冠狀動(dòng)脈血流量的分級(jí)量表(參見，例如timi研究組，thethrombolysisinmyocardialinfarction(timi)trial:phaseifindings.nengljmed.1984；33:523-530；以及timi研究組，comparisonofinvasiveandconservativestrategiesaftertreatmentwithintravenoustissueplasminogenactivatorinacutemyocardialinfarction:resultsofthethrombolysisinmyocardialinfarction(timi)phaseiitrial.nengljmed.1989；320:618-627，將其通過引用并入本文作為對(duì)timi分級(jí)量表的描述)。
timi流量等級(jí)已經(jīng)成為冠狀動(dòng)脈再灌注治療前后心肌灌注半定量評(píng)估以及確定中風(fēng)治療的標(biāo)準(zhǔn)。timi流量等級(jí)2和3均被認(rèn)為是表明成功再灌注。因此，如本文所用，預(yù)期最大的凝塊溶解速率與約75min或更短時(shí)間內(nèi)(例如在70、65、60、55、50、45、40、35或30min內(nèi))在人對(duì)象或患者中達(dá)到2或更好的timi評(píng)分相關(guān)聯(lián)。
“良好”和“不良”血液凝塊之間的纖溶酶原構(gòu)象和區(qū)別
在轉(zhuǎn)化為活性纖溶酶之前，纖溶酶原可呈現(xiàn)至少三種不同的構(gòu)象。第一構(gòu)象是天然的“閉合”構(gòu)象，即未結(jié)合任何纖維蛋白，并且纖溶酶原以該第一構(gòu)象存在于血液中。尿激酶可以激活處于該第一構(gòu)象的纖溶酶原，并且可引起非特異性的出血性素質(zhì)，即血友病樣狀態(tài)。由于pro-uk在治療劑量不穩(wěn)定，易于在治療濃度轉(zhuǎn)化為尿激酶，因此pro-uk也可引起血友病樣副作用。
當(dāng)與纖維蛋白結(jié)合時(shí)，纖溶酶原可以采用兩個(gè)或三個(gè)不同的“開放”構(gòu)象，為區(qū)分良好的傷口愈合凝塊和不良的閉塞凝塊提供依據(jù)。這些中的第一個(gè)是當(dāng)纖溶酶原與完整纖維蛋白的d-結(jié)構(gòu)域中的內(nèi)部賴氨酸結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的纖溶酶原構(gòu)象。這些中的第二個(gè)是當(dāng)纖溶酶原與纖維蛋白片段e上的三個(gè)c-末端賴氨酸結(jié)合時(shí)出現(xiàn)的纖溶酶原構(gòu)象，纖維蛋白片段e僅在如上述纖維蛋白溶解步驟2中描述的一些纖維蛋白降解之后暴露。
當(dāng)止血纖維蛋白形成以密封傷口時(shí)，它的作用就像繃帶，不會(huì)導(dǎo)致對(duì)血流的干擾。這種止血液凝塊中的完整纖維蛋白僅具有位于d-結(jié)構(gòu)域中的內(nèi)部纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)，其誘導(dǎo)這些纖維蛋白結(jié)合構(gòu)象中的第一個(gè)構(gòu)象。在這種構(gòu)象中，纖溶酶原易于通過tpa來激活，tpa的纖維蛋白結(jié)合位點(diǎn)相鄰；但不能通過pro-uk來激活，因?yàn)橛衫w維蛋白e結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)的第二構(gòu)象導(dǎo)致pro-uk不結(jié)合纖維蛋白并具有底物結(jié)合。
當(dāng)在血管中形成血栓時(shí)，其妨礙或阻止血液流動(dòng)，觸發(fā)從閉塞血管壁局部釋放tpa，并導(dǎo)致纖維蛋白降解。纖維蛋白降解在纖維蛋白片段e上暴露新的纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)。纖溶酶原結(jié)合在纖維蛋白片段e上的這個(gè)新的結(jié)合位點(diǎn)。pro-uk優(yōu)先激活與纖維蛋白片段e結(jié)合的纖溶酶原。
利用“良好”和“不良”纖維蛋白凝塊之間這一重要區(qū)別可以有效地實(shí)現(xiàn)溶栓，同時(shí)保護(hù)密封傷口的止血塞。pro-uk突變體與pro-uk具有相同的作用方式。
當(dāng)纖溶酶原結(jié)合單個(gè)c-末端位點(diǎn)(被認(rèn)為在纖維蛋白γ鏈上)時(shí)，存在第三種結(jié)合纖維蛋白的纖溶酶原構(gòu)象。
組織纖溶酶原激活物
組織纖溶酶原激活物是一種絲氨酸蛋白酶，其儲(chǔ)存在沿血管壁排列的內(nèi)皮細(xì)胞中。當(dāng)血栓堵塞血管時(shí)，tpa從血管壁釋放并溶解纖維蛋白凝塊。
目前大多數(shù)治療性溶栓治療是使用組織纖溶酶原激活物(tpa)及其衍生物進(jìn)行的，但tpa可引起出血性副作用。例如，150mg劑量的組織纖溶酶原激活物(tpa)已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)優(yōu)異的冠狀動(dòng)脈溶栓，但伴隨著不可接受的顱內(nèi)出血發(fā)生率，從而迫使采用效果欠佳的100mg劑量(braunwald,jamercollcardiol.9:467,1987；grossbard,jamercollcardiol.9:467,1987)。在急性心肌梗塞(ami)患者的比較臨床試驗(yàn)中，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(pci)的結(jié)果明顯優(yōu)于靜脈內(nèi)施用tpa，盡管pci費(fèi)用更昂貴、技術(shù)要求高且耗時(shí)長(zhǎng)。這種臨床結(jié)果令人驚訝，但可以通過以下tpa特性來解釋：(1)tpa的治療劑量受顱內(nèi)出血并發(fā)癥的限制；和(2)tpa的功效被相對(duì)高的冠狀動(dòng)脈血栓再形成率破壞，這與凝血酶生成的血液學(xué)證據(jù)相關(guān)(verheugt,jamcollcardiol1996,27:766-773；gurewich,circulation1993,87:1759-1761；rapold,blood1991,78:1490-1495；gulba,lancet1988,2:97；gulba,circulation1991,83:937-944)。
在缺血性中風(fēng)中，當(dāng)以與ami中使用的劑量相當(dāng)?shù)膭┝渴┯胻pa時(shí)，由于顱內(nèi)出血并發(fā)癥發(fā)生率為20％，需要進(jìn)一步減少劑量(hacke,jama1995,274:1017-1025)。在ami中使用與tpa一起使用的肝素在中風(fēng)中被排除，因?yàn)閳?bào)告了14-31％的再閉塞率(alexandrov,neurology2002,59:862-867；rubiera,stroke2005,36:1452-1456；saqqur,stroke2007；38:69-74)。最終結(jié)果是，在美國(guó)只有約2-5％的缺血性中風(fēng)患者用tpa治療(kleindorfer,stroke2008；39:924-928)。
據(jù)信tpa誘導(dǎo)的出血主要與修復(fù)血管壁中損傷部位所需的止血纖維蛋白的溶解有關(guān)，其通常是隱匿和不可預(yù)測(cè)的，但為tpa劑量依賴性的。如上所述，prouk/m5由于其不同的作用模式而避免了作用于這些部位。
尿激酶原和尿激酶原突變體
尿激酶原(pro-uk)作為溶栓藥物不太為人所知，但急性心肌梗塞的3期臨床研究已經(jīng)完成(michelsr,jthrombthrombolysis1995,2:117-124；primi試驗(yàn)研究組。lancet1989,1:863-867；tebbeu,jamcollcardiol1998,31:487-493)。pro-uk在這些研究中引起了很少(5％)或沒有引起冠狀動(dòng)脈血栓再形成，且沒有凝血酶生成的血液學(xué)證據(jù)(primitrialstudygroup.lancet1989,1:863-867；weaver,jamcollcardiol1994,241:242-1248)。不幸的是，在治療劑量下，血漿中的pro-uk易于自發(fā)激活成其酶形式，雙鏈尿激酶(tcuk)。發(fā)生這種情況時(shí)，會(huì)引發(fā)出血風(fēng)險(xiǎn)，因此市場(chǎng)準(zhǔn)入被拒絕，在西方放棄了pro-uk的研發(fā)。
pro-uk的不穩(wěn)定性與其相對(duì)高的內(nèi)在催化活性有關(guān)。結(jié)構(gòu)功能研究表明，由催化結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基297-313組成的柔性環(huán)中的帶電殘基負(fù)責(zé)此活性。在柔性環(huán)區(qū)域中的誘變導(dǎo)致了pro-uk內(nèi)在活性的調(diào)節(jié)。具有降低的內(nèi)在催化活性的示例性pro-uk“柔性環(huán)”突變體描述于美國(guó)專利第5,472,692號(hào)(通過引用整體并入本文)，如gly299→ala突變體，lys300→his突變體(稱為“m5”或“m5突變體”)，lys300→ala突變體，和glu301→his突變體。
這些pro-uk“柔性環(huán)”突變體之一m5(lys300→his)，已經(jīng)在體外和體內(nèi)都被測(cè)試，并且顯示出比天然pro-uk更快地溶解血液凝塊(liuetal.,circulationresearch,90:757-763,2002)。單鏈m5突變體的內(nèi)在活性比pro-uk低5倍，所以在血液中m5比天然pro-uk更穩(wěn)定，不太可能自發(fā)轉(zhuǎn)化為活性酶形式并引起血友病樣副作用(liu,biochemistry1996,35:14070-14076)。雙鏈酶形式的mprouk(例如m5)的活性和mprouk(例如m5)的作用模式，與天然pro-uk保持相同(sunz,jbiolchem1997,272:23818-23823；liu,circu.res.2002,90:757-763)。像m5這樣的mprouk擁有另一個(gè)優(yōu)越的特性；它們可以被內(nèi)源性血漿c1-抑制劑抑制，提供針對(duì)非特異性副作用的保護(hù)，而不會(huì)干擾由mprouk引起的纖維蛋白溶解(gurewich,jthromboshaemost,2006,4:1559-1565；pannell,jthrombhaemost,2007,5:1047-1054；gurewich,thrombhaemost,2009,102:279-286)。重要的是，諸如m5的mprouk不顯示通常與溶栓劑相關(guān)的任何出血性副作用，如美國(guó)專利第7,074,401號(hào)所描述(將其通過引用整體并入本文)。此外，諸如m5的mprouk可以根據(jù)美國(guó)專利第7,070,958號(hào)來合成(將其通過引用整體并入本文)。
預(yù)期m5和其他mprouk對(duì)于人類給藥是安全的，因?yàn)椋?1)它們基本上是天然的人類蛋白質(zhì)(與天然pro-uk具有99.8％的相似性)，(2)它們沒有抗原性(免疫)反應(yīng)，和3)在iii期臨床研究中，來自大腸桿菌的天然存在的人類pro-uk和重組人pro-uk已經(jīng)被安全地施用于約5,000名患者。
低劑量tpa和mprouk的聯(lián)合治療
通過利用tpa和pro-uk對(duì)纖溶酶原作用的互補(bǔ)作用機(jī)理，本發(fā)明人已經(jīng)證明，利用小劑量tpa(標(biāo)準(zhǔn)100mg劑量的2-5％，例如1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5mg的彈丸劑)加上mprouk如m5的輸注(在40-50％的單一療法劑量下，例如以60-120ug/ml輸注60-90min)的組合，可以達(dá)到最大的凝塊溶解速率的纖維蛋白溶解，該最大的凝塊溶解速率至少與通過利用單獨(dú)的tpa或mprouk的單一療法在其最大有效劑量下可達(dá)到的最大的凝塊溶解速率一樣快(圖1a-5b)。例如，tpa-mprouk組合可在少于1h(例如48min)內(nèi)平均溶解血液凝塊的50％質(zhì)量(參見圖7，tpa+mf)。盡管單獨(dú)的tpa和mprouk(m5)以非常高的劑量可以實(shí)現(xiàn)類似的溶解時(shí)間，例如，3μg/mltpa，或15μg/mlmprouk(m5)(圖7)，但在那些劑量下可以發(fā)生纖溶酶原的非特異性活化，以及對(duì)于m5約77％的(參見圖2b)和對(duì)于tpa約80％的(參見圖1b)纖維蛋白原降解，并且引起顯著的和臨床上不可接受的血友病樣副作用。
使用諸如m5的mprouk而非天然pro-uk，因?yàn)閙prouk在血漿中更穩(wěn)定并保持在酶原形式，而天然pro-uk傾向于自發(fā)轉(zhuǎn)化為尿激酶并引起血友病樣副作用。因此，通過tpa-mprouk組合使用tpa和mprouk單一療法劑量的一部分，可以達(dá)到最大的凝塊溶解速率。
當(dāng)在沒有血液凝塊的血漿中孵育時(shí)，tpa-mprouk組合不誘導(dǎo)纖維蛋白原的任何降解(圖9)，因此預(yù)期對(duì)體內(nèi)凝血和傷口愈合沒有影響。此外，c1-抑制劑可用于猝滅血漿中muk(mprouk的酶形式)的任何非特異性活性(圖2d和圖6)，進(jìn)一步增加了針對(duì)出血并發(fā)癥的保護(hù)作用。
臨床上，tpa-mprouk聯(lián)合治療可用于治療具有中風(fēng)或心臟病發(fā)作癥狀的患者，而沒有因耗時(shí)的診斷程序引起的延遲。本文提供了通過以下方法治療具有中風(fēng)或急性心肌梗塞癥狀的對(duì)象的方法：(a)通過觀察一種或多種癥狀來鑒定潛在地患有中風(fēng)或急性心肌梗塞的對(duì)象，而不確定中風(fēng)或急性心肌梗塞的根本原因；和(b)向所述對(duì)象施用含有5mg或更少tpa的第一組合物的彈丸劑，然后以60-120mg/h的速率輸注包含mprouk的第二組合物，輸注60-90min?？梢栽谑┯玫谝唤M合物后約5、10或15min施用第二組合物。以最大溶解速率溶解引起中風(fēng)或急性心肌梗塞癥狀的任何血液凝塊的量施用第一組合物和第二組合物。第一組合物可包含2-5mgtpa，例如約2mg、約2.5mg、約3mg、約3.5mg、約4mg、約4.5mg、約5mg?？赏ㄟ^靜脈內(nèi)輸注來施用包含mprouk(如m5)的第二組合物?？梢杂眉s60-120mg/h(例如60-100、70-90或75-85mg/h)的劑量，進(jìn)行mprouk(如m5)的靜脈內(nèi)輸注，持續(xù)60、70、80或90min。
本文所述的方法可用于治療中風(fēng)。中風(fēng)可能是缺血性或出血性的。缺血性中風(fēng)是由阻塞血流的血栓引起的，而出血性中風(fēng)是由血管破裂引起的。約85％的時(shí)間，中風(fēng)是缺血性的，例如由血液凝塊引起，因此易于通過溶栓劑治療。缺血性中風(fēng)后再灌注的時(shí)機(jī)至關(guān)重要，因?yàn)槟X細(xì)胞沒有氧合血液的時(shí)間越長(zhǎng)，損失的腦細(xì)胞就越多。然而，完全診斷中風(fēng)的原因是困難且耗時(shí)的，但是由于高的出血性副作用風(fēng)險(xiǎn)，準(zhǔn)確的診斷對(duì)于采用目前可用的溶栓劑進(jìn)行治療至關(guān)重要。將溶栓劑施用于缺血性中風(fēng)患者可能是適當(dāng)?shù)闹委煼椒?，但?duì)出血性中風(fēng)患者施用相同的溶栓劑將加劇問題并且可能殺死患者。盡管確定診斷需要時(shí)間，但醫(yī)療領(lǐng)域的技術(shù)人員，例如emt、護(hù)士、或醫(yī)生、或甚至接受最低限度培訓(xùn)的外行人可以容易地確定人表現(xiàn)的中風(fēng)基本癥狀(例如突發(fā)的單側(cè)麻痹)。
可以使用本文所述的方法，通過施用低劑量tpa的彈丸劑，然后輸注mprouk來治療具有中風(fēng)癥狀的對(duì)象。組合中非常低的tpa劑量降低潛在的出血風(fēng)險(xiǎn)。由于組合中的tpa是小劑量，并且mprouk可以溶解血栓但避免作用于止血纖維蛋白，所以該組合可用于安全地治療患有可能的缺血性中風(fēng)的患者，并且?guī)缀鯖]有加重大腦出血的風(fēng)險(xiǎn)。因此，有可能在臨床懷疑診斷的基礎(chǔ)上在救護(hù)車中開始治療。
本文所述的方法也可用于治療心臟病發(fā)作，例如急性心肌梗塞。當(dāng)冠狀動(dòng)脈之一例如被血液凝塊阻塞時(shí)，發(fā)生心臟病發(fā)作。心臟病發(fā)作后再灌注的時(shí)機(jī)至關(guān)重要，因?yàn)樾募]有氧合血液的時(shí)間越長(zhǎng)，損傷或損失的肌肉細(xì)胞越多。目前選擇的治療是通過導(dǎo)管插入術(shù)和血管成形術(shù)，其需要住院、可用的導(dǎo)管室和準(zhǔn)備就緒的工作人員。這延遲了治療并產(chǎn)生很高的費(fèi)用。冠狀動(dòng)脈閉塞后的第一個(gè)小時(shí)被稱為“黃金時(shí)段”，因?yàn)樗侨缦聲r(shí)間：在該時(shí)間中，心肌最大挽救和死亡率最大降低是可能的。由于多次研究顯示tpa顯著增加導(dǎo)管插入術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率，普遍放棄在導(dǎo)管插入術(shù)之前使用tpa進(jìn)行預(yù)處理以獲得時(shí)間。
如本文所述，具有心臟病發(fā)作癥狀的對(duì)象可以通過施用低劑量tpa的彈丸劑，然后輸注諸如m5的mprouk來治療。經(jīng)驗(yàn)表明，用pro-uk預(yù)處理與導(dǎo)管插入術(shù)后并發(fā)癥無關(guān)，因此用該組合的預(yù)處理應(yīng)該具有良好的耐受性，并且還可以減少對(duì)于隨后進(jìn)行導(dǎo)管插入術(shù)的需要。
c1-抑制劑
c1-抑制劑是104kd絲氨酸蛋白酶抑制劑，正常血漿濃度為約250μg/ml，半衰期為約28h。這種蛋白質(zhì)的缺乏與稱為遺傳性血管性水腫的疾病有關(guān)。c1-抑制劑早已被臨床用于治療遺傳性血管性水腫。市售的c1-抑制劑包括
纖維蛋白溶解期間產(chǎn)生的活性酶雙鏈uk或muk最終釋放到血漿中，其中纖溶酶原激活成為一種累贅。猝滅該活性需要血漿抑制劑。如美國(guó)專利第7,837,992號(hào)(通過引用并入本文)所描述，c1-抑制劑的抑制劑復(fù)合物出現(xiàn)在酶muk與人或犬血漿孵育幾分鐘內(nèi)。c1-抑制劑在人體中內(nèi)源性地存在，可以在藥理學(xué)上進(jìn)行補(bǔ)充。內(nèi)源性c1-抑制劑顯示在猝滅muk例如tcm5活性(而不是uk活性)方面非常有效(gurewichv,jthromboshaemost,2006；4:1559-1565；pannellr,jthrombhaemost,2007；5:1047-1054；gurewich,thrombhaemost,2009；102:279-286)。如美國(guó)專利第7,837,992號(hào)所示，c1-抑制劑通過抑制muk可以有效地穩(wěn)定血漿中的mprouk(如m5)，并允許更高濃度的mprouk(如m5)被耐受，而不會(huì)影響纖維蛋白特異性。
本文公開的治療具有中風(fēng)或急性心肌梗塞癥狀的對(duì)象的方法還可包括向?qū)ο笫┯冒琧1-抑制劑的第三組合物?？蓪1-抑制劑以足以在對(duì)象血漿中建立這樣的c1-抑制劑濃度的量來施用彈丸劑，該濃度在c1-抑制劑的正常生理水平(約250μg/ml)之上2-3倍的范圍，即約500-750μg/ml。例如，第三組合物可以包含500-1500mgc1-抑制劑。在一些實(shí)施方案中，可以在施用第二組合物之前，將第三組合物施用于對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，可以將第三組合物與第二組合物同時(shí)施用于對(duì)象。
藥物組合物、劑量方案和施用方法
本文提供的藥物組合物可以包含特定劑量的tpa和pro-uk突變體如m5作為活性成分。藥物組合物的活性成分，例如tpa或mprouk可以被配制成通過靜脈內(nèi)注射進(jìn)行遞送。
配制合適的藥物組合物的方法是本領(lǐng)域已知的，參見例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，2005；和drugsandthepharmaceuticalsciences系列書：一系列教科書和專著(aseriesoftextbooksandmonographs)”(dekker,ny)。例如，用于腸胃外施用的溶液或懸浮液可以包括以下組分：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸(edta)；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A，如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph。腸胃外制劑可以包封在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。
適用于注射的藥物組合物可以包括無菌水溶液(其中為水溶性的)、分散體和用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、cremophoreltm(basf,parsippany,nj)或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，并且應(yīng)該是易于注射的程度的流體。它在制備和儲(chǔ)存條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且必須保存防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其合適的混合物。例如，通過使用諸如卵磷脂的包衣，通過在分散體的情況下維持所需的粒度和通過使用表面活性劑，可以維持合適的流動(dòng)性。
防止微生物的作用可以通過各種抗細(xì)菌和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)，所述抗細(xì)菌和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨醇)和氯化鈉。無菌注射溶液可以通過在具有上述列舉的成分之一或其組合的適當(dāng)溶劑中并入所需量的活性化合物，需要時(shí)然后過濾滅菌來制備。通常，通過將活性化合物并入無菌媒介物中制備分散體，所述無菌媒介物含有基本分散介質(zhì)和上述列舉的所需的其它成分。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生來自其先前無菌過濾的溶液的活性成分以及任何另外的所需成分的粉末。
藥物組合物可以與用于施用的說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。
可以調(diào)整劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。參見例如，physicians'deskreference,第63版,thomsonreuters,2008年11月30日。例如，治療化合物的劑量、毒性和治療功效可以通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序來確定，例如用于確定ld50(對(duì)50％群體致死的劑量)和ed50(在50％群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，可以表示為ld50/ed50的比例。表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。盡管可以使用表現(xiàn)出毒性副作用的化合物，但應(yīng)注意設(shè)計(jì)將這些化合物靶向受影響組織的部位的遞送系統(tǒng)，以便將對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷最小化，從而減少副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于配制用于人的一系列劑量。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選位于包括ed50同時(shí)具有很少或沒有毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。根據(jù)所用劑型和使用的給藥途徑，所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中配制能實(shí)現(xiàn)包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的ic50(即，達(dá)到癥狀的最大抑制的50％的測(cè)試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量。這些信息可用于更精確地確定人體中的有用劑量。血漿水平可以例如通過高效液相色譜來測(cè)量。
tpa彈丸劑可以包括2-5mgtpa，例如約2mg、約2.5mg、約3mg、約3.5mg、約4mg、約4.5mg、或約5mg。mprouk(例如m5)的靜脈內(nèi)劑量可以為60-120mg/h(例如60-100、70-90、或75-85mg/h)持續(xù)60min、65min、70min、75min、80min、85min、或90min。可以以足以在對(duì)象血漿中建立約500-750μg/mlc1-抑制劑濃度的量以彈丸劑來施用c1-抑制劑。例如，c1-抑制劑的彈丸劑可以包括500-1500mgc1-抑制劑。
對(duì)于中風(fēng)或急性心肌梗塞患者，再灌注所需的時(shí)間對(duì)于存活和臨床結(jié)果至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)表明，小劑量tpa和m5的組合可以實(shí)現(xiàn)更安全和更有效方式的治療性溶栓。因此，中風(fēng)或急性心肌梗塞患者可以用tpa和m5的組合進(jìn)行治療，而幾乎沒有或沒有延遲。
溶栓的功效由溶解速率定義。然而，臨床效用需要將功效除以來自該速率的出血并發(fā)癥的發(fā)生率。使用本文所述的聯(lián)合治療，證據(jù)表明沒有最大的臨床效用，因?yàn)樽罴呀M合誘導(dǎo)了最大溶解速率而沒有明顯的纖維蛋白原降解(參見，pannelletal.,plosone,doi:10.1371/journal.pone.0122018，2015年3月26日，將其通過引用整體并入本文)。這產(chǎn)生了極為優(yōu)異的臨床效用指標(biāo)，事實(shí)上它提供可能的最大效用指標(biāo)，即針對(duì)纖溶酶原激活物可能的最大的凝塊溶解速率而無副作用。
試劑盒
本文還提供試劑盒，其包括在一個(gè)容器中的至少一種包含組織纖溶酶原激活物(tpa)的組合物和在不同的容器中的包含mprouk(例如m5)的另一種組合物。所述試劑盒用于實(shí)施本文所述的治療方法。第一組合物可以被配制成適于作為彈丸劑施用，并且可以包含2-5mgtpa。第二組合物可以被配制成適于靜脈內(nèi)輸注。第二組合物可以包含60-120mg(例如，60、65、70、75、80、85或90mg)pro-uk突變體，用于在60-90min的時(shí)段內(nèi)輸注。所述試劑盒還可以包括包含c1-抑制劑的第三組合物。第三組合物可以被配制成適于作為彈丸劑施用，并且可以包含約500-1500mgc1-抑制劑。
試劑盒通常包括以下主要元件：包裝、包含如上所述的結(jié)合組合物的試劑、任選的對(duì)照和說明書。包裝可以是用于容納包含組合物的小瓶和用于本文所述方法的說明書的盒狀結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地調(diào)整該包裝以適應(yīng)個(gè)人需要。
本文提供的組合物和試劑盒可以根據(jù)上述任何方法(例如，治療方法)使用。例如，組合物和試劑盒，其含有包含tpa的組合物和包含pro-uk突變體(例如m5突變體)的另一種組合物，可用于治療由諸如外周壞疽的血栓引起的中風(fēng)、心臟病發(fā)作或其它心血管疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到本文提供的組合物和試劑盒的其它合適用途，并且能夠使用用于此類用途的組合物和試劑盒。
實(shí)施例
在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不限制在權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1.通過tpa/m5引起的體外溶栓的最大的凝塊溶解速率
在體外的人血漿環(huán)境中，研究了tpa和m5的特異性組合的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解作用。
材料
由pxtherapeutics公司(grenoble，france)從大腸桿菌制備包含在尿激酶原的氨基酸位置300處的賴氨酸被組氨酸替換(lys300→his)的mprouk(m5)。組織纖溶酶原激活物(tpa)獲自genentech(southsanfrancisco，ca)。人纖維蛋白原(kabi，l級(jí))獲自意大利米蘭的chromogenix。抑肽酶和異硫氰酸熒光素獲自sigmachemicals(st.louis，mo)。凝血酶(thrombomax，100nihu/ml)獲自sigma(stlouis，mo)。臨床級(jí)別的c1-抑制劑獲自德國(guó)馬爾堡的cslbehring。在實(shí)驗(yàn)中使用來自四個(gè)供體合并的人類過期的血庫血漿。
請(qǐng)注意，各種動(dòng)物模型對(duì)人類pro-uk具有不同的敏感性(參見，例如gurewichetal.,j.clin.invest.,73:1731-1739(1984)的表1，將其通過引用整體并入本文)。因此，動(dòng)物劑量不能用于確定人的劑量，本文描述的劑量是基于在人體試驗(yàn)中使用各個(gè)組分的經(jīng)驗(yàn)。在人血漿中的體外研究顯示，相比針對(duì)同樣溶解速率的prouk，需要2x的m5。prouk/m5的單一療法劑量是從3-期研究中獲知的，本文所述聯(lián)合治療方法中的新發(fā)現(xiàn)的小劑量tpa加上低劑量m5是基于該2x因子。
血液凝塊溶解實(shí)驗(yàn)
在含抑制劑的血漿環(huán)境中研究了m5引起的纖維蛋白溶解。在痕量的凝血激酶和熒光纖維蛋白原的存在下，通過用35mm鈣再鈣化0.2ml合并的血庫血漿來制備血液凝塊(參見，dmitryv,jbiolchem,1996；271:2133-2138)。然后，將血液凝塊在37℃下孵育1h，然后在室溫下孵育過夜。第二天，將血液凝塊置于2ml血庫血漿中，然后加入tpa、m5、或tpa和m5的組合。通過在特定時(shí)間點(diǎn)取50μl血漿樣品并測(cè)量熒光發(fā)射來監(jiān)測(cè)凝塊溶解。樣品中的熒光發(fā)射表示從血液凝塊釋放的纖維蛋白降解產(chǎn)物的量。在一些實(shí)驗(yàn)中，將血漿體積增加至5ml，并加入未標(biāo)記的纖維蛋白原，以補(bǔ)足熒光纖維蛋白原的稀釋液。在這些實(shí)驗(yàn)中，目測(cè)確定血液凝塊溶解的結(jié)束。
每次血液凝塊溶解實(shí)驗(yàn)按一式三份進(jìn)行。用graphpadprism準(zhǔn)備圖表，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
將溶解曲線繪制為血液凝塊隨時(shí)間變化的溶解百分比。100％的點(diǎn)是從最高讀數(shù)的平均值得到的。通過減去血漿顯示的熒光量(約15％的全信號(hào))，在開始時(shí)得到基線讀數(shù)以獲得零點(diǎn)。從溶解圖確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下50％溶解的時(shí)間，并將其用作主要終點(diǎn)。
測(cè)定血液凝塊溶解后剩余的纖維蛋白原
血液凝塊溶解完成后，得到最終的血漿樣品(1.0ml)，用于測(cè)定剩余的纖維蛋白原。將抑肽酶(200kiu/ml)加入到樣品中，以防止進(jìn)一步的蛋白水解。將剩余的纖維蛋白原記錄為基線(bl)纖維蛋白原的百分比。
將纖維蛋白原測(cè)量為凝血酶可凝結(jié)蛋白。用等量的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋血漿樣品后，加入200μl凝血酶(1,000nih單位/ml溶液)。將溶液輕輕混合，并在37℃下孵育1h，然后在室溫下孵育過夜。第二天早晨，將每個(gè)血液凝塊纏繞到一個(gè)細(xì)的長(zhǎng)柄的塑料移液管尖端(其上粘附了凝膠)上，并且血清含量通過針對(duì)試管壁，然后是針對(duì)紙巾的壓力表示。然后將移液管柄上的白色纖維蛋白置于至少5ml鹽水中至少1h，以允許任何剩余的血清蛋白擴(kuò)散。然后將纖維蛋白從尖端剝離并置于1ml5％的naoh中，煮沸1min，然后保持在室溫直到所有纖維蛋白進(jìn)入溶液。在280nm處用分光光度法測(cè)量溶液中的蛋白質(zhì)。
通過單獨(dú)的tpa或m5測(cè)定最短溶解時(shí)間
如上所述，在1、2或3μg/mltpa存在下，進(jìn)行血液凝塊溶解實(shí)驗(yàn)。將溶解曲線繪制為血液凝塊隨時(shí)間變化的溶解百分比，并從溶解曲線確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下溶解50％的血液凝塊所用的時(shí)間。溶解的最短時(shí)間(可以由其確定最大的凝塊溶解速率)被定義為這樣的時(shí)間，在該時(shí)間下不再有進(jìn)一步的劑量依賴性的溶解時(shí)間的縮短。代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖1a，當(dāng)使用3μg/mltpa時(shí)，發(fā)現(xiàn)通過tpa溶解50％的血液凝塊所用的最短時(shí)間為60min。因此，在1h時(shí)最大的凝塊溶解率為50％的溶解。
圖1b顯示了每個(gè)測(cè)試的tpa劑量在溶解結(jié)束時(shí)19％-45％范圍的基線水平的剩余纖維蛋白原的百分比。因此，單獨(dú)的tpa引起55％-81％的纖維蛋白原降解。
對(duì)于m5，如上所述在10、12.5、15μg/mlm5存在下，進(jìn)行血液凝塊溶解實(shí)驗(yàn)。當(dāng)使用15μg/mlmprouk時(shí)，通過m5溶解50％的血液凝塊所用的最短時(shí)間被確定為50min(圖2a)。因此，在50min時(shí)最大的凝塊溶解速率為50％的凝塊溶解。
針對(duì)每個(gè)m5劑量，在溶解結(jié)束時(shí)25％-55％范圍的基線水平的剩余纖維蛋白原的百分比示于圖2b。因此，單獨(dú)的m5引起45％-75％的纖維蛋白原降解。
c1-抑制劑對(duì)m5引起的纖維蛋白原溶解的影響
在凝塊溶解實(shí)驗(yàn)中，為了防止纖維蛋白原溶解，向血漿中加入750μg/mlc1-抑制劑，然后加入10、12.5、15μg/mlm5。750μg/mlc1-抑制劑的存在不影響m5溶解50％的血液凝塊所用的時(shí)間，仍然是50min(圖2c)。然而，如圖2d所示，在c1-抑制劑存在下發(fā)生少量纖維蛋白原降解。
對(duì)于tpa，不再重復(fù)c1-抑制劑實(shí)驗(yàn)，因?yàn)橐呀?jīng)顯示c1-抑制劑通過tpa抑制血液凝塊溶解(tomasis,plosone.,2011；6:e21999)。
小劑量tpa和低劑量m5組合產(chǎn)生的最大的凝塊溶解速率
為了確定在組合使用時(shí)達(dá)到最短溶解時(shí)間(和最大的凝塊溶解速率)所需的最低劑量的tpa和m5，使用tpa和m5的各種組合以及比例進(jìn)行血液凝塊溶解實(shí)驗(yàn)。當(dāng)組合使用以持續(xù)達(dá)到最大的凝塊溶解速率時(shí)，最低劑量的tpa和mprouk被確定為0.2μg/mltpa和6μg/mlm5。這些劑量對(duì)應(yīng)于單獨(dú)用于單一療法時(shí)實(shí)現(xiàn)最短溶解時(shí)間所需的6％的tpa劑量加上實(shí)現(xiàn)最短溶解時(shí)間所需的40％的m5劑量。圖3顯示代表性凝塊溶解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中通過0.2μg/mltpa和6μg/mlm5組合來溶解50％的血液凝塊所用的時(shí)間為53min，而單獨(dú)使用6μg/mlm5來溶解50％的血液凝塊的時(shí)間為135min，單獨(dú)使用0.2μg/mltpa來溶解50％的血液凝塊的時(shí)間為225min。這些結(jié)果表明，小劑量tpa，例如0.2μg/ml，通過m5大大縮短了凝塊溶解時(shí)間。該觀察結(jié)果與在引發(fā)纖維蛋白溶解中的tpa功能一致。
使用組合(0.2μg/mltpa+6μg/mlm5)(圓形)的10個(gè)代表性凝塊溶解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4a，其誘導(dǎo)約75min的平均50％溶解的時(shí)間。在該劑量的單獨(dú)m5(三角形)下，溶解時(shí)間為135min，單獨(dú)tpa(正方形)誘導(dǎo)的溶解時(shí)間為225min。該發(fā)現(xiàn)表明，小劑量tpa導(dǎo)致由m5引起的溶解縮短約45％。圖4b顯示溶解結(jié)束時(shí)以基線(bl)纖維蛋白原的百分比表示的血漿纖維蛋白原。所有實(shí)驗(yàn)按一式三份進(jìn)行。
為了測(cè)試在組合中tpa的功能是否限于纖維蛋白溶解的起始，使用四種tpa-m5組合進(jìn)行血液凝塊溶解實(shí)驗(yàn)。每種tpa-m5組合包括固定劑量的6μg/mlm5和選自0.2、0.6、1.0和3.0μg/ml的不同tpa劑量。對(duì)于所有測(cè)試的四種組合，用于溶解50％的血液凝塊的時(shí)間為約48-60min，并且高于0.2μg/ml的tpa劑量不會(huì)進(jìn)一步縮短溶解50％的血液凝塊所需的時(shí)間(圖6)。這些發(fā)現(xiàn)與組合中tpa的功能是一致的，其對(duì)于起始纖維蛋白溶解是必不可少的，但不會(huì)引發(fā)超過起始的纖維蛋白溶解。
將來自多個(gè)血液凝塊實(shí)驗(yàn)的在體外溶解50％的血液凝塊所用的平均時(shí)間進(jìn)行列表并比較。圖7顯示，通過0.2μg/mltpa加上6μg/mlm5的組合溶解50％的血液凝塊所用的平均時(shí)間為48(±2.5)min(n＝10)；通過單獨(dú)的0.2μg/mltpa溶解50％的血液凝塊所用的時(shí)間為156(±5.3)min(n＝5)；對(duì)于單獨(dú)的6μg/mlm5，其為118(±7.2)min(n＝7)；對(duì)于單獨(dú)的15μg/mlm5，其為48(±1.6)min(n＝9)；對(duì)于單獨(dú)的3μg/mltpa，其為55(±5)min(n＝6)。通過0.2μg/mltpa加上6μg/mlm5的組合溶解50％的血液凝塊所用的時(shí)間顯著小于采用單獨(dú)的0.2μg/mltpa或單獨(dú)的6μg/mlm5進(jìn)行單一療法所用的時(shí)間(圖7)。盡管單獨(dú)的tpa和mprouk可以在非常高的劑量(例如3μg/mltpa，或15μg/mlm5)下實(shí)現(xiàn)類似的凝血溶解時(shí)間(圖7)，但是在這些劑量下可能發(fā)生纖溶酶原的非特異性活化，并導(dǎo)致血友病樣副作用。
體積和c1-抑制劑對(duì)tpa和m5組合引起的纖維蛋白原溶解的影響
纖維蛋白溶解期間，mprouk被纖溶酶激活并轉(zhuǎn)化為muk，然后可以擴(kuò)散到血漿中。將蛋白質(zhì)水解限制在凝塊上，成為血漿抑制劑例如c1-抑制劑的功能。在試管中，相對(duì)于體內(nèi)的血漿體積，體外有限的血漿體積可能是有影響的。因此，在三個(gè)條件下進(jìn)行凝塊溶解實(shí)驗(yàn)：(1)2ml對(duì)照血漿體積，(2)5ml增加的血漿體積，(3)2ml血漿和500μg/mlc1-抑制劑。將未標(biāo)記的血液凝塊用于這些實(shí)驗(yàn)，并且在所有三個(gè)測(cè)試條件下測(cè)定的用于溶解100％的血液凝塊的時(shí)間為75-80min。在標(biāo)準(zhǔn)的2ml血漿體積中，tpa-m5組合降解了70％的纖維蛋白原，反映了纖溶酶的快速tcm5產(chǎn)生率(圖8)。當(dāng)加入c1-抑制劑時(shí)，纖維蛋白原溶解降低至45％，剩余的纖維蛋白原為55％(圖8)。在5ml血漿體積中觀察到類似的效果，可能反映了在當(dāng)時(shí)的凝塊環(huán)境中tcm5的稀釋(圖8)。該體積效應(yīng)表明，tpa-m5組合引起的纖維蛋白原溶解可在體內(nèi)進(jìn)一步減弱，其中血漿體積與凝塊的比值相當(dāng)大。
與圖2d相比時(shí)c1-抑制劑的更適度作用與相比m5單一療法由tpa-m5組合誘導(dǎo)的更快的纖維蛋白依賴性纖溶酶生成有關(guān)。通過其他研究證實(shí)，與c1-抑制劑通過單獨(dú)的m5抑制纖維蛋白原溶解的能力相比，c1-抑制劑通過tpa-m5組合抑制纖維蛋白原溶解的能力降低。c1-抑制劑是相對(duì)緩慢的抑制劑，因此不太能猝滅由tpa-m5組合實(shí)現(xiàn)的更快速的纖維蛋白溶解中更快速產(chǎn)生的tcm5?？赡苄枰邼舛鹊腸1-抑制劑來充分猝滅由tpa-m5組合產(chǎn)生的tcm5。
代表性凝塊溶解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖5a，除了c1-抑制劑之外，還使用組合(0.2μg/mltpa+6μg/mlm5)(圓形)。加入活化劑30min后，加入c1-抑制劑(750μg/ml)。如圖5a所示，這不抑制溶解(圓形)，其平均縮短為約30min，但抑制單獨(dú)的tpa引起的溶解(正方形)。圖5b顯示溶解結(jié)束時(shí)表示為基線(bl)纖維蛋白原的百分比的血漿纖維蛋白原。如圖5b所示，c1-抑制劑減弱纖維蛋白原溶解。所有實(shí)驗(yàn)按一式三份進(jìn)行。
在沒有凝塊存在下由tpa-m5組合引起的纖維蛋白原溶解
為了測(cè)試血液凝塊不存在時(shí)tpa-m5組合對(duì)纖維蛋白原溶解的影響，將0.2μg/mltpa加上6μg/mlm5的組合與血漿在37℃溫育，并在2-5h后取樣用于纖維蛋白原測(cè)定。如圖9所示，至少3h沒有纖維蛋白原溶解，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過治療性溶栓的持續(xù)時(shí)間。這些發(fā)現(xiàn)表明，由tpa-m5組合誘導(dǎo)的纖溶酶生成是纖維蛋白依賴性的，并且在沒有血液凝塊存在下，該纖維蛋白溶解組合不誘導(dǎo)纖溶酶原激活。
實(shí)施例2.通過tpa和m5組合進(jìn)行體內(nèi)溶栓
用戊巴比妥鈉麻醉重量為10-15公斤的雄性雜種犬，并維持呼吸室空氣。由1ml天然的全犬血形成血液凝塊(如美國(guó)專利第7,074,401號(hào)所述)，向其加入放射性標(biāo)記的纖維蛋白原(1.9μci，0.75mci/mg蛋白)和凝血酶(10單位)。20min后，將凝塊用鹽水洗滌3次，然后切成小塊(約1mm3)并通過16g的針注入股靜脈。15min后，從對(duì)側(cè)股靜脈的套管獲得血液樣本，用于測(cè)量基線放射性。
將犬分為四組注射：(1)鹽水，(2)2-5mgtpa彈丸劑，(3)靜脈內(nèi)輸注m5(20μg/kg/min)持續(xù)60min，或(4)2-5mgtpa彈丸劑，然后靜脈內(nèi)輸注m5(20μg/kg/min)持續(xù)60min。在輸注期間的間隔獲得血液樣本，并測(cè)量放射性和纖維蛋白原。在四組之間確定用于溶解血液凝塊的時(shí)間，并進(jìn)行比較。
實(shí)施例3.腦內(nèi)出血(ich)的大鼠模型中c1-抑制劑和m5的表征
本研究的目的是研究m5對(duì)腦內(nèi)出血(ich)體積的影響。
使用20只成年雄性sprague-dawley大鼠進(jìn)行研究。隨機(jī)選擇用于手術(shù)日的大鼠。通過尾標(biāo)記給予大鼠獨(dú)特的識(shí)別號(hào)碼。在緊鄰手術(shù)開始之前，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行頭孢唑啉鈉腹腔內(nèi)注射(40mg/kg；hospira101c049)和丁丙諾啡皮下注射(1mg/kg；reckittbenckiser，219202)。雖然在異氟烷麻醉(1.5％-2％)下的大鼠在一氧化二氮/氧氣混合物(2：1)內(nèi)自發(fā)呼吸，但鉆了一個(gè)小鉆孔，并將30g的10μl顯微注射針(hamilton，700系列)慢慢地降至在距離前囟的下列坐標(biāo)處的右側(cè)紋狀體：前面0.0mm、側(cè)面3mm和深6mm。在3min時(shí)間內(nèi)，注入含有0.45u膠原酶vii-s(sigma，st.louis，mo)的3μl鹽水。將針放置在適當(dāng)位置2min，然后歷經(jīng)5min緩慢移除。之后，將頭皮縫合成閉合，使大鼠恢復(fù)。對(duì)于每只大鼠，整個(gè)手術(shù)過程持續(xù)約20min。用加熱墊(37±1℃)維持動(dòng)物體溫。
在給藥前配制c1抑制劑和測(cè)試物(m5)。在日常使用過程中測(cè)試溶液保持在冰上。剩余的未使用的溶液保持在-20℃。在ich后15min以4ml/kg開始，在以4ml/kg(iv)彈丸注射之后，立即通過靜脈內(nèi)輸注(歷經(jīng)30min)對(duì)動(dòng)物給藥。在輸注開始后2h，在100％n2o吸入下，在異氟烷下人道地地殺死動(dòng)物。移出腦，并根據(jù)2-mm大鼠腦基質(zhì)進(jìn)行切片。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用數(shù)碼相機(jī)拍攝腦薄片的圖像。由imagej軟件(可在rsb.info.nih.gov/ij在線獲取)計(jì)算血腫大小。
出血誘導(dǎo)2h后，在深度(5％)異氟烷麻醉(100％n2o)下處死大鼠。移出腦并置于在冰上的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中。將腦切成7個(gè)切片，每個(gè)切片為2mm，并拍照以對(duì)血腫進(jìn)行視覺評(píng)估。沒有對(duì)各個(gè)切片進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。將血紅蛋白含量確定為出血體積的定量測(cè)量。將出血側(cè)與正常側(cè)分離(包括所有7個(gè)切片)，并置于1.5ml冷pbs中。勻漿30秒(用polytronpt2100手動(dòng)操作)后，應(yīng)用超聲1min以溶解紅細(xì)胞膜。離心30min(13000rpm，4℃)后，向800μldrabkins試劑(sigma，st.louis，mo)中加入200μl上清液，并在室溫下靜置10min。使用光度計(jì)，在540nm處測(cè)定吸收率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦損傷一半的出血性血容量。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過使用來自年齡和體重匹配(一般研究對(duì)象)的八個(gè)初始腦半球產(chǎn)生的。這些初始腦半球摻有0到192μl的漸增體積的來自相同個(gè)體的合并的血液。通過方差分析(anova)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
從之前在biotrofix上優(yōu)化的工作，確定所測(cè)量的出血大小的時(shí)間(出血誘導(dǎo)后2h)。
在ich后15min，用媒介物(鹽水)(4ml/kg)的彈丸劑(4ml/kg)，隨后立即用30min的媒介物輸注，或用c1-抑制劑(200u/4ml/kg)的彈丸劑，隨后立即用30min的m5(10mg/4ml/kg)輸注，如所述給藥大鼠。
臨床觀察和生存
本研究的所有動(dòng)物在研究期間幸存下來。動(dòng)物#24不包括在分析中，因?yàn)樵谠搫?dòng)物中引起的出血不足。
出血量的組織學(xué)測(cè)定
在ich的大鼠模型中研究了在c1-抑制劑彈丸注射之后(立即)施用m5。在該模型中，通過將膠原酶注射到大腦的右側(cè)紋狀體中誘導(dǎo)腦內(nèi)出血。損傷后15min，在如上所述彈丸注射后，立即通過30min靜脈內(nèi)輸注施用m5(劑量為10mg/4ml/kg)或媒介物。在用c1inh/m5給藥的動(dòng)物和用鹽水/鹽水給藥的動(dòng)物之間未測(cè)定出顯著差異(p＝0.6899)(圖1)。
直接血腫體積
與出血體積的組織學(xué)測(cè)定一樣，在用c1inh/m5給藥的動(dòng)物和用鹽水/鹽水給藥的動(dòng)物之間未測(cè)定出顯著差異(p＝0.5194)(圖10a和10b)。圖10a是顯示大鼠模型中腦內(nèi)出血后血腫體積的柱狀圖。通過立體定向注射膠原酶誘導(dǎo)腦內(nèi)出血。在損傷后15min，利用c1-抑制劑的彈丸注射，隨后立即利用30min的m5(劑量為10mg/4ml/kg)輸注給藥大鼠。在給藥后2h，通過血紅蛋白含量測(cè)量血腫體積。在用c1inh/m5給藥的動(dòng)物和用鹽水/鹽水給藥的動(dòng)物之間未測(cè)定出顯著差異(p＝0.5194)。
圖10b是顯示大鼠模型中腦內(nèi)出血后出血體積的組織學(xué)測(cè)定的柱狀圖。通過立體定向注射膠原酶誘導(dǎo)腦內(nèi)出血。在損傷后15min，利用c1-抑制劑的彈丸注射，隨后立即利用30min的m5(劑量為10mg/4ml/kg)輸注給藥大鼠。在用c1inh/m5給藥的動(dòng)物和用鹽水/鹽水給藥的動(dòng)物之間的出血體積未測(cè)定出顯著差異(p＝0.6899)。
在這種膠原酶引起的腦內(nèi)出血的大鼠模型中，相對(duì)于鹽水/鹽水處理的動(dòng)物，ich誘導(dǎo)后15min施用c1-抑制劑/m5在血腫體積或出血大小方面沒有差異。因此，m5在該中風(fēng)模型中并沒有引起或增加出血，因此應(yīng)該可以安全地用于出血事件如出血性中風(fēng)。
實(shí)施例4.tpa和m5組合的臨床試驗(yàn)
將年齡為18-35歲(包含)，體重至少為60公斤，身體質(zhì)量指數(shù)(bmi)為18.5-25kg/m2(包含)的健康男性對(duì)象登記至本臨床試驗(yàn)中。在篩查和研究的第1天，對(duì)象具有正常的內(nèi)源性c1-抑制劑，α2-抗纖溶酶和纖維蛋白原水平，針對(duì)hiv、hbsag和hcv的陰性血清學(xué)，以及針對(duì)酒精和濫用藥物的陰性檢測(cè)。對(duì)象不能有臨床上的顯著異常。
如果對(duì)象符合以下一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，則不包括該對(duì)象：(1)對(duì)象具有影響止血或凝血途徑或與增加的出血傾向相關(guān)的已知或懷疑的遺傳性、先天性或獲得性疾病或病況；(2)對(duì)象有合理的機(jī)會(huì)發(fā)展臨床上顯著的出血事件或這樣的出血事件，其可能在研究期間相當(dāng)多的時(shí)間未被檢測(cè)到，例如，對(duì)象(a)在預(yù)期給藥日的近三個(gè)月內(nèi)經(jīng)歷了大的(內(nèi)部)手術(shù)或創(chuàng)傷，(b)具有腸或腦血管畸形，或(c)在預(yù)期給藥日的兩周內(nèi)參與高撞擊性接觸運(yùn)動(dòng)，例如自由搏擊；(3)在給藥前，對(duì)象接受了本方案不允許的任何全身吸收性藥物或物質(zhì)(包括處方、非處方藥或其他補(bǔ)救措施)，而沒有經(jīng)歷該產(chǎn)品的消除半衰期的至少7倍的清除期；(4)對(duì)象在給藥三個(gè)月內(nèi)以任何形式吸煙，或曾經(jīng)平均每天吸煙超過5支(或同等)；(5)對(duì)象在施用日的前一年接受了血液或血漿衍生物；(6)給藥前3個(gè)月，對(duì)象已經(jīng)失去當(dāng)?shù)孬I(xiàn)血服務(wù)(i.c.sanquin)的限制之外的血液或血漿；(7)對(duì)象對(duì)任何研究材料或相關(guān)化合物具有已知的超敏反應(yīng)；(8)對(duì)象具有嚴(yán)重的超敏反應(yīng)史或嚴(yán)重反應(yīng)的過敏史；(9)對(duì)象有濫用藥物的歷史，包括咖啡因、煙草和酒精；(10)對(duì)象患有病況或表現(xiàn)出調(diào)查人員認(rèn)為可能危及對(duì)象的健康或福祉、或研究成果的科學(xué)完整性的態(tài)度；(11)對(duì)象在精神上或法律上無行為能力提供知情同意書。
入選的對(duì)象被隨機(jī)分配到以下治療組之一：
(1)注射2.5mg的tpa彈丸劑，然后以約80mg/h(單一療法劑量的50％)靜脈內(nèi)輸注mprouk(例如m5)持續(xù)60-90min；
(2)注射2.5mg的tpa彈丸劑，然后靜脈內(nèi)輸注安慰劑持續(xù)60-90min；
(3)注射安慰劑彈丸劑，然后以約160mg/h靜脈內(nèi)輸注mprouk(例如m5)持續(xù)60-90min；或
(4)注射2.5mg的tpa彈丸劑，然后注射c1-抑制劑
mprouk的劑量范圍為60-120mg/h。c1-抑制劑的彈丸劑由25-100u/kg的
基于本研究收集的數(shù)據(jù)，評(píng)估了tpa和mprouk(如m5)組合的總體安全性和耐受性。評(píng)估了小劑量tpa對(duì)mprouk誘導(dǎo)的凝血變化的影響。評(píng)估了單劑量c1-抑制劑對(duì)tpa-mprouk組合的總體安全性和耐受性的影響，及其對(duì)tpa-mprouk誘導(dǎo)的凝血變化的影響。
其他實(shí)施方案
應(yīng)當(dāng)理解，盡管已經(jīng)結(jié)合其發(fā)明詳述描述了本發(fā)明，但是前述描述旨在說明而不是限制由所附權(quán)利要求的范圍限定的本發(fā)明范圍。其他的方面、優(yōu)點(diǎn)和修改也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
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