本發(fā)明涉及用于皮膚美白(皮膚增白，skin whitening)的化妝品組合物，所述化妝品組合物包含藥草(中藥材，medicinal herbs)的組合提取物(混合提取物，combined extract)。

背景技術(shù)：

在決定人皮膚顏色方面涉及多種因素；這之中，存在最重要的因素，例如，黑色素細(xì)胞制備黑色素的活性、血管分布、皮膚厚度以及內(nèi)部和外部色素如類胡蘿卜素和膽紅素的存在與否。

黑色素色素的形成受遺傳因素、激素分泌、與應(yīng)激相關(guān)的生理因素以及環(huán)境因素如對UV輻射的暴露所影響。

皮膚的黑色素細(xì)胞中產(chǎn)生的黑色素是以深色色素和蛋白質(zhì)的復(fù)合物的形式存在的多酚的聚合物。黑色素在保護(hù)皮膚中的蛋白質(zhì)和基因中起有益作用，因?yàn)槠洳粌H抑制自太陽發(fā)出的UV光從而保護(hù)真皮下的皮膚器官而且還清除皮膚組織中產(chǎn)生的自由基。

由內(nèi)部或外部皮膚的應(yīng)激樣刺激產(chǎn)生的黑色素是一種穩(wěn)定的物質(zhì)，即使應(yīng)激消失，該物質(zhì)要直到通過皮膚角質(zhì)排出到外部才消失。然而，黑色素的過量產(chǎn)生引起色素沉著過度(hyperpigmentation)，包括黃褐斑、雀斑和斑點(diǎn)，并且不利地影響皮膚美觀。

在解決該問題的嘗試中，已將抗壞血酸、曲酸(kojic acid)、熊果苷(arbutin)、氫醌、谷胱甘肽或其衍生物或抑制酪氨酸酶的物質(zhì)與化妝品或醫(yī)藥產(chǎn)品組合使用。但是，這些物質(zhì)存在問題，如不充分的皮膚美白效果，對皮膚的安全性問題，以及當(dāng)與化妝品組合物組合時的制劑形式和穩(wěn)定性問題，因此它們的使用是受限的。因此，迫切地需要與常規(guī)用于皮膚美白的組合物相比對身體更安全并且更加高度有效的新型用于皮膚美白的化妝品組合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

因此本發(fā)明的一個目的是提供具有美白效果的化妝品組合物。

本發(fā)明的另一個目的是提供用于皮膚美白的方法，所述方法包括施用有效量的生地黃(鮮地黃，Rehmanniae Radix Recens)、枸杞子(Lycium fruit)、黃苓(Scutellaria root)和白芷(Angelica Dahurica root)的組合提取物。

本發(fā)明進(jìn)一步的另一個目的是提供生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物在制備用于皮膚美白的化妝品組合物中的用途。

技術(shù)方案

在開發(fā)具有皮膚美白效果的化妝品組合物的嘗試中，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以下事實(shí)，即生地黃(Rehmanniae Radix Recens)、枸杞子(Lycium fruit)、黃苓(Scutellaria root)和白芷(Angelica Dahurica root)的組合提取物在改善皮膚美白效果方面是高度有效的，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明提供生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物。

利用通過混合四種藥草的協(xié)同作用，根據(jù)本發(fā)明的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物與個體藥草相比細(xì)胞毒性更低并且在皮膚美白方面更有效。

在本發(fā)明中，生地黃(Rehmanniae Radix Recens)是指天然生長于韓國、中國和日本的作為玄參科(Scrophulariacea)的多年生草本植物的Rehmanniaglutinosa(Gaertner)Liboschitz ex Steudel的新鮮根。

在本發(fā)明中，枸杞子(Lyclum fruit)是從天然生長于韓國、中國和日本的作為茄科(Solanaceae)中的攀緣莖植物類的Lycium chinense Miller或Lycium barbarum Linne獲得的漿果。收獲成熟的漿果并陰干直至外皮軟化并干燥。

在本發(fā)明中，黃苓(Scutellaria root)是從分布于韓國、中國、蒙古和東西伯利亞的作為唇形科(Lamiaceae)中的多年生草本植物的Scutellaria baicalensis Georgi獲得的根。

在本發(fā)明中，白芷(Angelica Dahurica root)是從分布于韓國、中國和日本的作為傘形科(Apiaceae)中的一年生或兩年生草本植物的Angelica dahurica Bentham et Hooker f.或Angelica dahurica Bentham et Hooker f.var.formosana Shan et Yuan獲得的根。

這些可以容易地以低成本從國內(nèi)或國外獲得的藥草可以簡單地購買或手工收割。

在本發(fā)明中，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物可以是單一藥草的混合物的提取物或單一藥草提取物的混合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合提取物作為從生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的藥草混合物獲得的提取物使用。在本發(fā)明中，組合提取物可以以濃縮液或凍干粉的形式獲得。

基于生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的總重量，本發(fā)明的組合提取物可以包含40至50重量％的生地黃、15至25重量％的枸杞子、15至25重量％的黃苓和10至20重量％的白芷，優(yōu)選地40至50重量％的生地黃、17至25重量％的枸杞子、17至25重量％的黃苓和15至20重量％的白芷。

與單一藥草提取物或者兩種或更多種藥草的組合提取物的每一個相比，以上面限定的重量百分比含有全部四種藥草的本發(fā)明的組合提取物在皮膚美白，特別是抑制酪氨酸酶激活和抑制黑色素生物合成方面顯示顯著優(yōu)異效果，因此導(dǎo)致在皮膚美白方面更高的活性。

在本發(fā)明中，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物可以通過熱水提取、浸泡提取、回流冷卻提取、超聲提取等制備。提取的次數(shù)優(yōu)選為1至5次。提取溶劑的實(shí)例包括，但不限于，水和C₁-C₄醇或其混合物，優(yōu)選水或乙醇水溶液。提取過程中使用的提取溶劑的量為生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的總重量的2至15倍。為了獲得熱水(水)提取物，水浴回流提取可以在100至110℃重復(fù)一至四次達(dá)2至24小時，優(yōu)選地2至10小時。

本發(fā)明還提供通過進(jìn)一步分離生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物獲得的來自生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的級分(fraction)。級分分離可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離方法進(jìn)行。優(yōu)選地，將四種藥草生地黃、枸杞子、黃苓和白芷懸浮在水中然后用溶劑如己烷、氯仿、乙酸乙酯、丁醇等提取，得到生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的可溶性級分。

本發(fā)明還提供用于皮膚美白的化妝品組合物，其包含生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物。

根據(jù)本發(fā)明的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物由于使用了安全的天然成分而在應(yīng)用于皮膚時不導(dǎo)致副作用并且顯示優(yōu)異的皮膚-美白效果，因?yàn)槠渥C明了在抑制酪氨酸酶激活和抑制黑色素生物合成方面是有效的，因此其適合于用于皮膚美白的化妝品組合物。

與單一藥草提取物者兩種或更多種藥草的組合提取物的每一個相比，根據(jù)本發(fā)明的包含生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的用于皮膚美白的化妝品組合物，由于通過組合藥草生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組分的協(xié)同作用，而在皮膚美白方面顯示優(yōu)異的效果。

在本發(fā)明中，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物可以以粉末或液體的形式以基于化妝品組合物的總重量的0.001至10重量％，優(yōu)選地0.01至5重量％的量添加至化妝品組合物中。

除了作為活性成分的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物以外，本發(fā)明的化妝品組合物的組分還可以包括化妝品組合物中的常用成分，其包括，常規(guī)佐劑(例如，抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、色素、著色劑和香料)和載體。

本發(fā)明的化妝品組合物可以被配制成本領(lǐng)域中典型制備的任意類型的制劑形式，其實(shí)例包括，但不限于，溶液、混懸劑、乳液、糊劑、凝膠、霜劑、洗劑、粉劑、肥皂、含表面活性劑的清潔劑、油、粉底、粉底乳(emulsion foundation)、粉底蠟(wax foundation)、噴劑等。更特別地，本發(fā)明的化妝品組合物可以被配制成皮膚軟化劑、面部洗液(面霜，face lotions)、營養(yǎng)霜、按摩霜、精華液、面膜(pack)、眼霜、潔面霜、潔面泡沫(洗面奶，cleansing foam)、潔面水(卸妝水，cleansing water)、面膜、噴劑(spray)或粉劑的制劑形式。

當(dāng)本發(fā)明的制劑形式為糊劑、霜劑或凝膠時，動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮(有機(jī)硅，silicone)、斑脫土、二氧化硅、滑石或氧化鋅等可以被用作載體組分。

當(dāng)本發(fā)明的制劑形式為粉劑或噴劑時，乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末可以被用作載體組分。特別地，如果其為噴劑，則其可以另外地含有推進(jìn)劑，如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。

當(dāng)本發(fā)明的制劑形式為溶液或乳液時，溶劑、增溶劑或乳化劑可以被用作載體組分，其實(shí)例可以包括水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、丁二醇、1，3-丁二醇油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、丙三醇、甘油、脂肪族酯、苯氧基乙醇、三乙醇胺、聚乙二醇、蠟、聚山梨醇酯60、脫水山梨醇倍半油酸酯、石蠟、脫水山梨醇硬脂酸酯、親脂性單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硬脂酸甘油酯/PEG-400硬脂酸酯、羧基聚合物、cytosterol、聚甘油2-油酸酯、神經(jīng)酰胺、膽甾醇、steareth-4、磷酸二鯨蠟酯、澳洲胡桃油(macadamia oil)、羧基乙烯基聚合物、黃原膠或脫水山梨醇的脂肪族酯等。

當(dāng)本發(fā)明的制劑形式為混懸劑時，液體稀釋劑(例如，水、乙醇、丁二醇或丙二醇)、助懸劑(例如、乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脫水山梨醇酯)、微晶纖維素、羥乙基纖維素、透明質(zhì)酸鈉、苯氧基乙醇、偏鋁酸(aluminum metahydroxide)、班脫土、瓊脂或黃蓍膠等可以被用作載體成分。

當(dāng)本發(fā)明的制劑形式為含表面活性劑的清潔劑時，脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、單酯磺基琥珀酸酯(monoester sulfosuccinate)、羥乙基磺酸酯(isethionate)、咪唑鎓衍生物、?；撬峒柞ァ⒓“彼狨?、脂肪族酰胺醚硫酸酯(aliphatic amide ether sulfate)、、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪族甘油酯、脂肪族二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等可以被用作載體成分。

本發(fā)明還提供用于皮膚美白的方法，所述方法包括施用有效量的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“有效量”是指具有皮膚美白效果的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的量。

根據(jù)本發(fā)明的皮膚美白方法包括將包含生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的組合物與皮膚接觸。當(dāng)在本文中使用時，皮膚包括，但不限于，面部、頸部、手臂以及腳和腿的皮膚。在皮膚美白中，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的量可以根據(jù)對象的年齡、色素沉積的嚴(yán)重度或皮膚的靶區(qū)域而變化。足夠的組合提取物的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮這些因素而確定。此外，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物可以與有效量的另外的有助于皮膚膚色增白的活性劑一起施用。

根據(jù)本發(fā)明的皮膚美白方法還可以包括鑒別需要皮膚美白的靶皮膚區(qū)域。鑒別過程可以由用戶或第三方進(jìn)行，所述第三方包括，例如，皮膚科醫(yī)生、美容師或另一個人。

本發(fā)明還提供生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物在制備用于皮膚美白的化妝品組合物中的用途。用于制備化妝品組合物的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物可以與可商購的佐劑、稀釋劑等組合，或者可以與另一種活性劑組合使用以產(chǎn)生協(xié)同作用。當(dāng)在本文中使用時，另一種活性劑的實(shí)例可以包括UV阻斷劑(UV blocks)、保濕劑、去角質(zhì)劑(exfoliators)、軟化劑、皺紋改善劑等。

有利效果

根據(jù)本發(fā)明的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物由于使用安全的天然成分而不具有副作用并且證明了在抑制酪氨酸酶激活和抑制黑色素生物合成，由此產(chǎn)生顯著的皮膚美白效果方面是有效的，因此其作為用于皮膚美白的化妝品組合物是高度有效的。

附圖簡述

圖1是顯示在施用生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物后細(xì)胞生存力的變化的圖。

圖2是顯示在施用生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物后酪氨酸酶活性的降低的圖。

圖3是顯示在施用生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物后黑色素產(chǎn)生的減少的圖。

圖4是顯示在施用生地黃、枸杞子、黃苓或白芷的單一藥草提取物后黑色素產(chǎn)生的變化的圖。

實(shí)施本發(fā)明的最佳方式

下文中，將參考實(shí)施例和試驗(yàn)例來進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明的公開內(nèi)容，給出所述實(shí)施例和試驗(yàn)例用于理解本發(fā)明的公開內(nèi)容并且不意在限制本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍。

實(shí)施例1：制備生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物

為了制備生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物，從Omniherb Inc.購買藥草；生地黃(來源于韓國的慶北道)，枸杞子(來源于韓國的忠南道)，黃苓(來源于韓國的全羅南道)，白芷(來源于韓國的慶北道)。在使用前，將各個藥草用水洗滌，然后陰干。

將100g生地黃、50g枸杞子、50g黃苓和35g白芷放入1L蒸餾水中。在100℃使所得的混合物通過回流管進(jìn)行回流提取4小時，并且在真空下濃縮，得到62.26g的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物。

對于作為對照組的個體藥草提取物，將100g各個藥草放入1L蒸餾水中。在100℃使由此獲得的混合物各自通過回流管進(jìn)行回流提取4小時，并且在真空下濃縮，分別得到41g生地黃提取物、34g枸杞子提取物、35g黃苓提取物和31g白芷提取物。

實(shí)施例2：確定生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的細(xì)胞毒性

使用MTT測定來確定生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的細(xì)胞毒性。

將1ml細(xì)胞懸浮液添加至鼠源的B16F10黑素瘤細(xì)胞，以10⁴個細(xì)胞/孔的密度置于24-孔微板的各個孔中并且在細(xì)胞培養(yǎng)箱(在37℃用5％CO₂吹掃)中使用含10％胎牛血清、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。然后將培養(yǎng)的細(xì)胞用不同濃度(0至400μg/ml)的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物處理。在培養(yǎng)48小時后，將細(xì)胞用PBS(pH 7.4)洗滌兩次，并且將1ml在培養(yǎng)基中10倍稀釋的MTT試劑(0.5mg/ml)提供給細(xì)胞。將微板中的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(在37℃用5％CO₂吹掃)中持續(xù)4小時以反應(yīng)。在4小時的MTT反應(yīng)后，將培養(yǎng)基棄去，并加入1ml DMSO溶液以將細(xì)胞溶解。通過用分光光度計(jì)測量在540nm處的吸光度來確定該時間點(diǎn)形成的甲染料的濃度。

細(xì)胞生存力如由公式1給出的計(jì)算。結(jié)果顯示在圖1中。

[公式1]

結(jié)果顯示在圖1中。如圖1中所示，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物在其濃度為約100μg/ml以下時幾乎不影響細(xì)胞生存力，而在其濃度為200μg/ml以上時其相對于對照組顯示顯著的細(xì)胞毒性。

實(shí)施例3：對生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物抑制酪氨酸酶激活的效果的評價

將從鼠源B16F10黑素瘤細(xì)胞提取的酪氨酸酶用于評價估生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的酪氨酸酶抑制效果。

將黑素瘤細(xì)胞添加到100mm細(xì)胞培養(yǎng)板中并且培養(yǎng)至95％匯合度。將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS(pH 7.4)洗滌兩次并且使用含0.1％triton 100的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)來提取酶。將酶溶液的蛋白濃度定量至20μg并且用不同濃度(0至1μg/ml)的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物處理。在37℃反應(yīng)10分鐘后，將0.15％多巴(dopa)(3，4-二羥基-L-苯丙氨酸)溶液添加至反應(yīng)溶液以在37℃反應(yīng)20分鐘。然后，使用分光光度計(jì)來測量在475nm處的吸光度.

當(dāng)反應(yīng)溶液為褐色時，加入蒸餾水代替0.15％多巴溶液以制備試驗(yàn)組(a)。另一方面，將反應(yīng)溶液用0.15％多巴溶液和取決于濃度的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物處理以制備試驗(yàn)組(b)。并且在從(b)組的吸光度減去(a)組的吸光度后，計(jì)算值。

根據(jù)公式2計(jì)算酪氨酸酶抑制活性。結(jié)果顯示在圖2中。

[公式2]

結(jié)果顯示在圖2中。相比于對照組，如圖2中所示，自0.1mg/ml以上的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷起，酪氨酸酶活性以依賴于濃度的方式下降。更具體地，利用濃度為0.1mg/ml和1mg/ml的組合提取物，酪氨酸酶活性分別降至12.1％和33.1％。

實(shí)施例4：對生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物對黑色素產(chǎn)生的抑制作用的評價

使用鼠源的B16F10黑素瘤來評價黑色素生物合成。

將B16F10黑素瘤細(xì)胞添加到100mm細(xì)胞培養(yǎng)板中并且在細(xì)胞培養(yǎng)箱(在37℃用5％CO₂吹掃)中使用含10％胎牛血清、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至90％匯合度。

為了測量對黑色素產(chǎn)生的抑制作用，將B16F10黑素瘤細(xì)胞以10⁴個細(xì)胞/孔的密度置于24-孔板的各孔中并且在細(xì)胞培養(yǎng)箱(在37℃用5％CO₂吹掃)中培養(yǎng)24小時。將細(xì)胞用不同濃度(0至100μg/ml)的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物、個體藥草提取物、兩種以上藥草的組合提取物、以及用作陽性對照的200μM曲酸處理，然后培養(yǎng)48小時。除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用PBS洗滌兩次，用1N NaOH處理并且培養(yǎng)30多分鐘。將培養(yǎng)的溶解的細(xì)胞收集并且在100℃沸騰30分鐘。對于所得的溶液，利用分光光度計(jì)測量在415nm處的吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黑色素濃度，并且確定細(xì)胞溶液的蛋白濃度以校準(zhǔn)黑色素濃度。利用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Thermo Scientific，23225)基于Lowry法測量蛋白濃度。

結(jié)果顯示在圖3和4中。

圖3(a)顯示在使用如實(shí)施例1中制備的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的情況下的黑色素濃度；并且圖3(b)顯示以實(shí)施例1的相同濃度使用生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的個體藥草提取物的組合時的黑色素濃度。如圖3中所示，在使用生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的情況下黑色素產(chǎn)生以依賴于濃度的方式顯著減少。而且，即使在使用個體藥草提取物的組合時，對黑色素產(chǎn)生的抑制作用也幾乎相同。

圖4顯示在使用生地黃、枸杞子、黃苓或白芷的單一藥草提取物的情況下黑色素生物合成的變化。如從圖4可見的，任何生地黃、枸杞子、黃苓或白芷的單一藥草提取物對黑色素的生物合成都沒有效果。

換言之，生地黃、枸杞子、黃苓或白芷的單一藥草提取物對黑色素合成的減少幾乎沒有效果，而由于個體藥草的協(xié)同作用，生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物在減少黑色素產(chǎn)生方面是高度有效的。

此外，當(dāng)考慮各個藥草提取物的細(xì)胞毒性時，與個體藥草提取物的任意組合相比，以上文限定的重量份構(gòu)成的生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物在皮膚美白方面都要有效得多。

制劑例1：制備含有生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的面部洗液

根據(jù)如以下給出的表1的組成，進(jìn)行程序以制備1kg的含有生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物(實(shí)施例1)的面部洗液。

[表1]含有生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的面部洗液的組成

制劑例2：制備含有生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的營養(yǎng)洗液

根據(jù)如以下給出的表2的組成，進(jìn)行程序以制備1kg的含有生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物(實(shí)施例1)的營養(yǎng)洗液。

[表2]含生地黃、枸杞子、黃苓和白芷的組合提取物的營養(yǎng)洗液的組成