發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及血管周圍組織及其表征方法。

背景技術(shù)：

血管周圍脂肪組織(pvat)包圍(冠狀)動脈并且可參與動脈粥樣硬化斑塊形成的局部刺激?？墒褂枚喾N技術(shù)來對pvat進行定量，包括，例如，超聲波心動描記術(shù)、計算機斷層掃描(ct)和磁性共振成像(mri)。pvat的量與代謝性綜合征的一些參數(shù)相關(guān)，包括增加的腰圍、高甘油三酯血癥和高血糖癥、以及冠狀動脈粥樣硬化。pvat已經(jīng)長期已知分泌促炎蛋白質(zhì)并且誘導(dǎo)動脈壁發(fā)炎。對血管壁中動脈粥樣硬化的病理的長期理解是其是外部刺激的，并且提出pvat在這種過程中起到關(guān)鍵作用。

動脈粥樣硬化是其中動脈壁由于白細胞的侵入和累積導(dǎo)致動脈壁增厚的進行性過程。這種炎癥過程導(dǎo)致在含有活白細胞、死細胞碎片和沉積的脂肪(包括膽固醇和甘油三酯)的血管壁內(nèi)產(chǎn)生斑塊。

穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊(其往往無癥狀)一般在胞外基質(zhì)和平滑肌細胞中富集，同時不穩(wěn)定的斑塊在巨噬細胞和泡沫細胞中富集，并且將病灶與動脈腔(也稱為纖維帽)分開的胞外機制通常是弱的并且易于破裂。纖維帽的破裂最終在腔內(nèi)誘導(dǎo)血栓形成，并且這種血栓可阻塞動脈或脫離，移到循環(huán)中并且最終阻塞較小的下游血管造成血栓栓塞。慢性膨脹的斑塊通常無癥狀直至血管閉塞(狹窄)足夠嚴重使得向下游組織供應(yīng)的血液不足。動脈粥樣硬化數(shù)十年無癥狀，因為動脈在所有斑塊位置擴大并且血流不會立即受到影響。事實上，斑塊破裂也無癥狀，除非它們導(dǎo)致足夠動脈變窄或者封閉，阻斷通向不同器官的血流以誘導(dǎo)癥狀。一般而言，該疾病僅在患者經(jīng)歷其他心血管疾病如中風(fēng)或心臟病時被診斷出。有癥狀的動脈粥樣硬化一般與40歲的男性和50-60歲的女性相關(guān)。亞臨床上，該疾病在兒童期開始出現(xiàn)，并且可注意到的跡象在青春期開始發(fā)展。雖然冠狀動脈疾病在男性中比女性更普遍，大腦動脈的動脈粥樣硬化和中風(fēng)對兩種性別有同等影響。

動脈粥樣硬化可能導(dǎo)致負責(zé)向心臟輸送含氧血液的冠狀動脈中的狹窄，并且這可能產(chǎn)生癥狀，如心絞痛、呼吸淺短、出汗、惡心、頭暈或暈眩、呼吸暫?；蛐募?。心臟心律失常也可由心臟缺血引發(fā)。導(dǎo)致向腦和頸供應(yīng)血液的頸動脈中狹窄的動脈粥樣硬化可產(chǎn)生癥狀如感覺虛弱、無法直接思考、說話困難、變得頭暈并且難以行走或直立、視力模糊、臉部、手臂和腿部麻木、嚴重頭痛和喪失知覺。這些癥狀也可能存在于中風(fēng)中，其由通向大腦的動脈的明顯狹窄或閉塞引起，導(dǎo)致腦缺血和腦細胞死亡。向腿、手臂和骨盆供應(yīng)血液的外周動脈也可能受到影響。癥狀可包括受影響的肢體麻木，以及疼痛。斑塊形成也可能出現(xiàn)在腎動脈中，其向腎臟提供血液。斑塊出現(xiàn)和累積導(dǎo)致減少的腎臟血流和慢性腎病，其向所有其他區(qū)域一樣，一般是無癥狀的直至晚期。

炎癥在動脈粥樣硬化中起到關(guān)鍵作用(rossr(1999).動脈粥樣硬化-一種炎性疾病(atherosclerosis-aninflammatorydisease).nengljmed340(2)：115-26；和majoras和harrisondg(2011).何物煽風(fēng)點火：對動脈粥樣硬化和糖尿病中炎癥機制的理解(whatfansthefire：insightsintomechanismsofinflammationinatherosclerosisanddiabetesmellitus).circulation124(25)：2809-11)并且可在早期精確檢測血管炎癥的形式將能夠進行更好的心血管風(fēng)險分層和實施合適治療介入。依賴于全身血漿生物標記物(例如，c-反應(yīng)蛋白、促炎性細胞因子)評價血管炎癥的現(xiàn)有工具不與動脈粥樣硬化的過程直接相關(guān)(weintraubws，andharrisondg(2000).c-反應(yīng)蛋白，炎癥和動脈粥樣硬化：我們是否真的理解它？(c-reactiveprotein，inflammationandatherosclerosis：dowereallyunderstandityet？)eurheartj21(12)：958-60)，并且提供了與局部血管生物過程非常弱的相關(guān)性(leer，margaritism，channonkm，andantoniadesc(2012).評價人心血管疾病中的氧化應(yīng)激：方法方面和考慮(evaluatingoxidativestressinhumancardiovasculardisease：methodologicalaspectsandconsiderations).currentmedicinalchemistry19(16)：2504-20；和margaritism，antonopoulosas，digbyj，leer，reillys，coutinhop，shirodariac，sayeedr，petroum，desilvar等(2013).血管壁和血管周圍脂肪組織之間的相互作用揭示了脂連蛋白在調(diào)節(jié)人血管中內(nèi)皮一氧化氮合成功能中的作用(interactionsbetweenvascularwallandperivascularadiposetissuerevealnovelrolesforadiponectinintheregulationofendothelialnitricoxidesynthasefunctioninhumanvessels).circulation127(22)：2209-21)。此外，現(xiàn)有的成像工具(侵入性的如血管內(nèi)超聲/光學(xué)相干斷層攝像或者非侵入性的如計算機斷層掃描(ct)血管造影/氟脫氧葡萄糖(18f)-正電子發(fā)射斷層掃描)無法提供對人冠狀動脈中血管炎癥的可靠信息(fiferkm，qadirs，subramanians，vijayakumarj，figueroaal，truongqa，hoffmannu，bradytj，和tawakola(2011).正電子發(fā)射斷層掃描測量周圍18f-氟脫氧葡萄糖攝取與組織學(xué)上確定的頸動脈斑塊炎癥相關(guān)(positronemissiontomographymeasurementofperiodontal18f-fluorodeoxyglucoseuptakeisassociatedwithhistologicallydeterminedcarotidplaqueinflammation).journaloftheamericancollegeofcardiology57(8)：971-6)。冠狀動脈鈣評分(ccs)是僅有的非侵入性成像標記物，其在初步預(yù)防上有預(yù)測價值(greenlandp，labreel，azensp，dohertytm和detranorc(2004).冠狀動脈鈣評分與framingham評分組合用于無癥狀個體的風(fēng)險預(yù)測(coronaryarterycalciumscorecombinedwithframinghamscoreforriskpredictioninasymptomaticindividuals).jama291(2)：210-5)，但其描述了血管壁的不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)構(gòu)變化，并且其不是由降低心血管風(fēng)險的介入改變(例如，他汀類)(alexopoulosn，melekbh，arepallicd，hartlagegr，chenz，kims，stillmanae和raggip(2013).在高脂血癥絕經(jīng)后婦女中繁重對比中等脂質(zhì)降低治療對心外膜脂肪組織的影響：belles試驗的亞研究(超過核準的用ebt掃描的脂質(zhì)降低)(effectofintensiveversusmoderatelipid-loweringtherapyonepicardialadiposetissueinhyperlipidemicpost-menopausalwomen：asubstudyofthebellestrial(beyondendorsedlipidloweringwithebtscanning)).journaloftheamericancollegeofcardiology61(19)：1956-61)?？赡芸朔@些限制并且非侵入性檢測血管炎癥的新成像生物標記物將在對冠狀動脈疾病的臨床研究和風(fēng)險分層中有無法衡量的價值(hoeferie，steffenss，ala-korpelam，backm，badimonl，bochaton-piallatml，boulangercm，caligiurig，dimmelers，egidoj等(2015).用于動脈粥樣硬化中生物標記物發(fā)現(xiàn)的新方法(novelmethodologiesforbiomarkerdiscoveryinatherosclerosis).eurheartj2015年6月5日.pii：ehv236[電子出版先于印刷出版])。

最近已經(jīng)顯而易見的是，血管炎癥和氧化應(yīng)激具有影響pvat的生物學(xué)的能力，由于血管壁釋放能夠?qū)ο噜弍vat施加旁分泌影響的介質(zhì)(參見，例如，margaritis等，circulation2013；127(22)：2209-21)。這種觀察與經(jīng)典理論相反，按照經(jīng)典理論，pvat向血管壁遞送旁分泌信號?，F(xiàn)在理解pvat的生物學(xué)通過從其周圍的血管中接收的信號成形，并且pvat的表征可提供關(guān)于血管的生物學(xué)和健康的有用信息。

脂肪組織釋放向血管壁施加內(nèi)分泌或旁分泌的廣泛生物活性分子(antoniadesc，antonopoulosas，tousoulisd和stefanadisc(2009).脂連蛋白：從肥胖到心血管疾病(adiponectin：fromobesitytocardiovasculardisease).obesityreviews：anofficialjournaloftheinternationalassociationforthestudyofobesity10(3)：269-79)，但是我們最近提出脂肪組織和血管壁之間的交流是雙向的(margaritism，antonopoulosas，digbyj，leer，reillys，coutinhop，shirodariac，sayeedr，petroum，desilvar等(2013).circulation127(22)：2209-21；和antonopoulosas，margaritism，coutinhop，shirodariac，psarrosc，herdmanl，sannaf，desilvar，petroum，sayeedr等(2015).脂連蛋白作為2型糖尿病和人動脈壁中血管nadph氧化酶活性之間的連接：血管周圍脂肪組織的調(diào)節(jié)作用(adiponectinasalinkbetweentype2diabetesandvascularnadphoxidaseactivityinthehumanarterialwall：theregulatoryroleofperivascularadiposetissue).diabetes64(6)：2207-19)。脂肪組織的生物學(xué)性質(zhì)很大程度上受到小的不成熟前-脂肪細胞向大的充分分化的脂肪細胞的分化程度的驅(qū)動，其在胞內(nèi)脂質(zhì)液滴中富集(ntambijm和young-cheulk(2000).脂肪細胞分化和基因表達(adipocytedifferentiationandgeneexpression).thejournalofnutrition130(12)：3122s-6s)。前-脂肪細胞的分化由ppar-γ活化協(xié)調(diào)，這是一種由外源性炎癥抑制的轉(zhuǎn)錄因子(bassolsj，ortegafj，moreno-navarretejm，peralb，ricartw和fernandez-realjm(2009).人分化的網(wǎng)膜脂肪細胞的促炎性作用研究(studyoftheproinflammatoryroleofhumandifferentiatedomentaladipocytes).journalofcellularbiochemistry107(6)：1107-17)。沒有已建立的非侵入性方法來監(jiān)測人脂肪組織中的脂肪細胞尺寸。

之前通過計算機斷層掃描分析人脂肪組織儲庫的量的努力僅在通過成像評價pvat質(zhì)量上產(chǎn)生有限的數(shù)據(jù)。已經(jīng)報告了一種這類評價冠狀動脈周圍脂肪組織的“質(zhì)量”的嘗試(konishi等，atherosclerosis2011)。在該研究中，在2dct圖像中任意選擇的10mm²面積中對“脂肪組織密度”進行定量，并且使用由任意定義為落入冠狀動脈壁5mm以內(nèi)的pvat，任意定義為落入冠狀動脈壁超過10mm的非血管周圍脂肪組織(非-pvat)確定的放射密度值來限定冠狀動脈周圍ct梯度(pdg)。這種方法保留了易于出現(xiàn)對象偏差的定量，由于其依賴于分析ct圖像數(shù)據(jù)以選擇用于分析的合適區(qū)域的個體的判斷。盡管這種血管疾病有高發(fā)生率和無癥狀性質(zhì)，仍然迫切需要允許對pvat進行客觀非侵入性表征的工具。可用的技術(shù)提供關(guān)于血管周圍pvat的量的信息，但是該數(shù)據(jù)并不表征測量的pvat并且其無法在病變之間區(qū)分。因此，需要用于精確表征血管周圍pvat的特異且靈敏的工具。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于發(fā)明人的以下驚人發(fā)現(xiàn)，血管炎癥和氧化應(yīng)激能夠影響pvat的生物學(xué)，因為血管壁釋放能夠?qū)ο噜弍vat施加旁分泌影響的介質(zhì)。本發(fā)明提供了使用從計算機斷層掃描收集的數(shù)據(jù)對血管周圍組織進行體積表征的方法，并且也提供了這類方法在鑒定和診斷血管疾病中的用途。本發(fā)明提供的方法不依賴于pvat的體積，并且因此較不易于受到的與脂肪組織膨脹相關(guān)的干擾因素的影響，并且通過考慮血管直徑，它們使得能夠監(jiān)測可能在發(fā)生血管疾病之前出現(xiàn)的pvat的早期變化。

根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了使用從沿血管長度的計算機斷層(ct)掃描收集的數(shù)據(jù)對血管周圍組織進行體積表征的方法，該方法包括：對血管周圍組織的一個或多個同心層各自的放射密度進行定量；并且確定定量放射密度值中的一個或多個是否高于或低于基線放射密度值。

根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了使用從沿血管長度的ct掃描收集的數(shù)據(jù)對血管周圍組織進行體積表征的方法，該方法包括：確定血管周圍組織的一個或多個同心層各自的定量放射密度相較基線放射密度的倍數(shù)變化相對于離血管的外壁直至終點距離的距離的曲線；確定由定量放射密度的倍數(shù)變化曲線和基線放射密度曲線相對于離血管的外壁直至終點距離的距離所限定的區(qū)域的面積；并且將所述面積除以在離血管外壁一定距離處測量的定量放射密度，其中該距離小于血管的半徑并且是離血管外表面的距離，脂肪組織的定量放射密度在其上與相同類型的無疾病血管中的脂肪組織的基線放射密度相比降低超過5％，其中脂肪組織的基線放射密度是從外血管壁周圍的前1mm厚的層確定的值。根據(jù)其他方面，本發(fā)明提供了使用從沿血管長度的ct掃描收集的數(shù)據(jù)對血管周圍組織進行體積表征的方法在心血管診斷中的用途，該方法包括：對血管周圍組織的一個或多個同心層各自的放射密度進行定量；并且確定定量放射密度值中的一個或多個是否高于或低于基線放射密度值。

附圖說明

參考以下表格和附圖描述本發(fā)明，其中：

圖1顯示了右冠狀動脈的體積表征。在來自70個對象的冠狀動脈ct血管造影術(shù)中，在右冠狀動脈的近端部分(rca，距離右口1cm)中，在40mm距離上掃描血管壁：沒有冠狀動脈疾病的對象(無cad，n＝10)，有右冠狀動脈疾病(rca)疾病的cad患者(cadrca，n＝10)，沒有rca疾病的cad患者(cad無rca，n＝8)，冠狀動脈旁路移植(cabg)后的rca疾病的患者(cabgrca，n＝29)和沒有rca疾病的cabg后患者(cabg無rca，n＝13)。血管周圍組織被分割成1mm厚的連續(xù)同心層，其從動脈的外壁向外延伸20mm距離。計算各單個層的放射密度值并且針對各組離rca外壁的距離進行作圖。放射密度在所有組中隨著與rca壁的距離增加而降低，但是放射密度降低的模式在組間明顯不同。從重復(fù)測量anova來計算p-值。

圖2顯示了各種疾病狀態(tài)的右冠狀動脈周圍的血管周圍脂肪組織的放射密度模式變化。針對右冠狀動脈的外壁周圍的各同心的1-mm厚層計算脂肪組織的放射密度值并且以相對于離血管外壁的距離的倍數(shù)變化作圖。a)無cad＝?jīng)]有冠狀動脈疾病的對象(n＝10)，b)rca-cad＝有rca疾病的患者(n＝10)，c)無-rcacad＝患有cad但沒有rca疾病的患者(n＝8)，d)cabgrcacad＝冠狀動脈旁路移植(cabg)后的患有rca疾病的cad患者(n＝29)，和e)cabg無-rcacad＝cabg后沒有rca疾病的cad患者(n＝13)。

圖3顯示了體積血管周圍表征指數(shù)(vpci-i)預(yù)測存在冠狀動脈疾病。通過使用通過y＝1作為基線的水平線，使用右冠狀動脈周圍的血管周圍脂肪組織的放射密度變化相對于離血管外壁的距離的曲線(圖2)來計算曲線下面積(auc)(放射密度表示為倍數(shù)變化)?；€下的auc給定為正值，而基線上的auv給定為負值，繪制成各組患者(a-e)的陰影面積。使用auc的代數(shù)和除以pvat的放射密度的絕對值來計算各組的vpci-i(脂肪組織位于外周血管壁周圍等于血管半徑的距離上)。vpci-i20(a)和vpci-i10(b)在患者組間顯著不同。用通過用于在5組間比較的邦弗朗尼校正之后使用針對[距離]x[組]交互作用的雙因素anova來進行vpci-i20和vpci-i10的統(tǒng)計學(xué)比較。*p＜0.05對比無cad組。

圖4顯示了體積血管周圍表征分數(shù)(vpcs)和冠狀動脈鈣化之間的結(jié)合。具有較高vpcs的冠狀動脈血管與增加的冠狀動脈壁鈣化體積相關(guān)。鈣定義為hu值＞600的血管壁的所有體素。用于在3組間比較的邦弗朗尼校正之后單因素anova的p-值。(i＜2，ii：2-8，iii＞8)。

圖5顯示了作為連續(xù)變量的vpci和作為類別變量的vpsc(i＜2，ii：2-8，iii＞8)與潛在冠狀動脈中的纖維斑塊的總體積顯著相關(guān)。纖維斑塊定義為具有65-260hu的定量放射密度值的血管壁的那些體素。

圖6顯示了冠狀動脈疾病患者中血管周圍脂肪組織和斑塊特征之間的相關(guān)性。42個冠狀動脈疾病患者通過冠狀動脈ct血管造影術(shù)掃描作為adiporedox研究的部分。在纖維斑塊的體積與pvat(a)而不是非-pvat(b)的密度之間有非常明顯的正相關(guān)，表明更靠近人動脈的pvat變化與更高體積的纖維斑塊相關(guān)。pvat和非-pvat的密度上的差(vpci)是冠狀動脈纖維斑塊體積的預(yù)測物(c)。壞死核心定義為具有-1至64hu的放射密度值的血管壁的體素，纖維斑塊定義為具有65至260hu的放射密度值的血管壁的體素，并且鈣定義為具有超過600hu的放射密度值的血管壁的全部體素。p-值衍生自用于在3組間比較的邦弗朗尼校正之后的anova。

圖7顯示了冠狀動脈疾病患者中體積血管周圍組織表征分數(shù)值和斑塊特征之間的相關(guān)性。在42個冠狀動脈疾病患者上進行冠狀動脈ct血管造影術(shù)作為adiporedox研究的部分。在造影增強ct圖像中計算右冠狀動脈的體積血管周圍表征分數(shù)(vpcs)與壞死核心體積和動脈壁鈣化體積。在vpcs和冠狀動脈壁鈣化延伸之間存在正相關(guān)(a)。也存在隨著更高體積的vpcs有更高體積的壞死核心的趨勢，雖然這并沒有達到統(tǒng)計學(xué)顯著(b)。壞死核心被定義為具有-1至64hu的放射密度值的血管壁的那些體素，并且鈣定義為具有超過600hu的放射密度值的血管壁的全部體素。p-值衍生自用于在3組間比較的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗。

圖8顯示了在右冠狀動脈的40mm段周圍的血管周圍組織表征(分析起點，離右口1cm)。顯示了對應(yīng)于血管周圍脂肪組織pvat，-190hu至-30hu)，對應(yīng)于水(-15hu至+15hu)和對應(yīng)于非脂肪組織(+15至+120hu)的體素。血管周圍組織被分割成1mm厚的連續(xù)同心層，其從動脈的外壁向外延伸至20mm距離。各同心層中pvat的定量放射密度繪制成針對離外血管壁的距離的與基線放射密度相比的倍數(shù)變化(b)?；谘艿陌霃?，pvat與非-pvat(npvat)區(qū)分并且計算體積血管周圍表征指數(shù)。曲線下面積(auc，灰色陰影區(qū)域)除以pvat的定量放射密度得到vpci-ia指數(shù)，而pvat的定量放射密度和npvat的定量放射密度之間的差是vpsc指數(shù)。血管周圍組織的含水量曲線(標識為各同心層c中pvat體積的體積％)也可用于評價血管周圍組織的含水量，作為血管周圍組織炎癥的次級指數(shù)。

圖9顯示了左前降支動脈的40mm段周圍的血管周圍組織表征的示例，分析的起點離左主干的分支1cm。顯示了對應(yīng)于pvat(-190hu至-30hu)，對應(yīng)于水(-15hu至+15hu)和對應(yīng)于非脂肪組織(+15至+120hu)的體素(a)。血管周圍組織被分割成1mm厚的連續(xù)同心層，其從動脈的外壁向外延伸至20mm距離。pvat定義為位于等于血管半徑的距離內(nèi)的脂肪組織，并且各同心層中pvat的定量放射密度繪制成針對離血管外壁的距離與基線放射密度相比的倍數(shù)變化(b)。

圖10顯示了左回旋支動脈的40mm段周圍的血管周圍組織表征的示例，分析的起點離左主干的分支1cm。顯示了對應(yīng)于pvat(-190hu至-30hu)，對應(yīng)于水(-15hu至+15hu)和對應(yīng)于非脂肪組織(+15至+120hu)的體素(a)。血管周圍組織被分割成1mm厚的連續(xù)同心層，其從動脈的外壁向外延伸20mm距離。pvat定義為位于等于血管半徑的距離內(nèi)的脂肪組織，并且各同心層中pvat的定量放射密度繪制成針對離血管外壁的距離與基線放射密度相比的倍數(shù)變化(b)。

圖11顯示了腹主動脈段周圍的主動脈旁脂肪組織的體積表征。血管周圍組織被分割成1mm厚的連續(xù)同心層，其從主動脈的外壁向外延伸20mm距離(a)。計算各單個層的放射密度值并且針對離健康主動脈(空心圓圈)和主動脈瘤(實心圓圈)的外壁的距離進行作圖。與健康主動脈相比，在主動脈瘤存在下在主動脈旁脂肪組織中看到放射密度的不同變化模式(表示為倍數(shù)變化)。

圖12顯示了右股動脈周圍的血管周圍組織的體積表征。顯示了對應(yīng)于pvat(-190hu至-30hu)，對應(yīng)于水(-15hu至15hu)和對應(yīng)于非脂肪組織(+15至+120hu)的體素(a)。血管周圍組織被分割成1mm厚的連續(xù)同心層，其從動脈的外壁向外延伸20mm距離。pvat定義為位于等于血管半徑的距離內(nèi)的脂肪組織，并且各同心層中pvat的定量放射密度繪制成針對離外血管的距離與基線放射密度相比的倍數(shù)變化(b)。

圖13顯示了研究分組1中心外膜(epat)、胸(that)和皮下(scat)脂肪組織活檢的組織學(xué)分析。圖13a-d證明epat和that含有與scat相比明顯較小的脂肪細胞(n＝7個患者)。圖13e-g顯示在來自研究分組1(n＝453)中完整組的組織中的基因表達研究，與epat或that相比，在scat中測量到過氧化物酶體增殖活化受體-γ(ppar-γ，一種早期脂肪細胞分化的標記物，圖13e)、cebpa(晚期脂肪細胞分化的標記物，圖13f)和fabp4(末期脂肪細胞分化的標記物，圖13g)的較高基因表達。

圖14a顯示了研究分組2中共培養(yǎng)實驗的實驗設(shè)計，其中收獲來自經(jīng)過冠狀動脈旁路移植的15個患者的人主動脈組織(ao)并在+/-血管緊張素ii(angii)100nm下培養(yǎng)7天。從rca周圍的血管周圍脂肪組織(pvat)中分離的前-脂肪細胞也培養(yǎng)這段時間。一周后，洗滌ao以去除血管緊張素ii(angii)并且與前-脂肪細胞共培養(yǎng)。然后，誘導(dǎo)分化時間-過程。圖14b顯示angii誘導(dǎo)ao中炎性細胞因子的表達(例如，白介素6(ol-6)、腫瘤壞死因子α(tnf-α)和干擾素γ(ifn-γ))。圖14c-f顯示前-脂肪細胞與angii預(yù)刺激的ao的共培養(yǎng)防止前-脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞，如與沒有ao下分化的前-脂肪細胞相比分化第9天之前這些脂肪細胞中缺少脂質(zhì)液滴所證明。*p＜0.05對比對照。

圖15顯示了在心外膜脂肪組織(epat)中造影和非造影計算機斷層掃描(ct)圖像中平均脂肪組織放射密度(定量放射密度，qr)之間的相關(guān)性。圖15a顯示了在造影對比非造影ct圖像中qr之間的強相關(guān)性。圖15b顯示了在造影和非造影ct圖像之間qr的絕對值中沒有顯著差異。

圖16顯示了細胞因子對從右冠狀動脈周圍的血管周圍脂肪組織(pvat)分離并在炎性因子(tnf-α(4ng/ml)，il-6(25ng/ml)和ifn-γ(20ng/ml))存在或缺失下分化的人前-脂肪細胞的分化的影響。圖16a-d顯示促炎性細胞因子抑制前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞，如它們的形態(tài)變化和由油紅o染色證明它們?nèi)鄙僦|(zhì)液滴積累所確定。圖16e顯示了油紅o染色測量的分光光度定量。圖16f-i顯示在這些細胞中細胞因子觸發(fā)前-脂肪細胞分化(f)并且抑制分化標記物過氧化物酶體增殖子激活受體γ(ppar-γ；g)、ccaat/增強子結(jié)合蛋白α(cebpa；h)和脂肪酸結(jié)合蛋白-4(fabp4；i)的基因表達。*p＜0.05，**p＜0.01對比對照組。

圖17顯示了在來自經(jīng)過冠狀動脈旁路移植的453個患者的心外膜(epat)，胸(that)和皮下(scat)脂肪組織的外植體中的基因表達分析和平均脂肪組織放射密度(定量放射密度，qr)測量(研究分組1)。通過計算機斷層掃描(ct)來掃描脂肪組織樣品并且各樣品的qr計算為脂肪的平均放射密度(-190至-30豪恩斯弗爾德單位)?；跍y量的qr值，各外植體被分入分位。各分位中qr的范圍是：對于epat(低：-120至-84.3hu，中等：-84.1至-73.0hu，高：-72.9至-52.7hu)，對于that(低：-125至-77.7hu中等：-77.6至-68.7hu，高：-68.6至-49.8hu)并且對于scat(低：-128.0至-84.4hu，中等：-84.3至-74.2hu，高：-74.1至-56.1hu)。圖17a-f顯示了在所有脂肪組織儲庫中相同外植體中qr值與cebpa(晚期脂肪組織分化的標記物)和fabp4(末期脂肪組織分化的標記物)的表達水平之間的強負相關(guān)。圖17g顯示了脂肪組織外植體中脂肪細胞尺寸和測量的體內(nèi)qr值之間的負相關(guān)。圖17h-i顯示了在epat和scat中脂肪組織的體內(nèi)qr與脂肪脂質(zhì)外植體的qr強相關(guān)，其收集自手術(shù)期間的同一患者。

圖18顯示了在來自研究分組1的105個患者的心外膜(epat)和皮下(scat)脂肪組織的外植體中的基因表達分析和平均脂肪組織放射密度(定量放射密度，qr)測量。脂肪組織經(jīng)過計算機斷層血管造影掃描(ct)，同時收集手術(shù)期間心外膜(epat)和皮下(scat)脂肪組織樣品用于基因表達研究以確定脂肪細胞分化狀態(tài)。各脂肪組織儲庫的體內(nèi)qr計算為脂肪的平均放射密度(-190至-30豪恩斯弗爾德單位)。各外植體基于測量的qr值被分入分位。各分位的qr的范圍是：對于epat(低：-81.6至-74.7hu，中等：-74.8至-70.7hu，高：-70.9至-61.0hu)并且對于scat(低：-108至-101hu，中等：-101至-97hu，高：-97至-89hu)。圖18a-d顯示了在所有脂肪組織儲庫中相同外植體中qr值與cebpa(晚期脂肪組織分化的標記物)和fabp4(末期脂肪組織分化的標記物)的表達水平之間的強負相關(guān)。

圖19顯示了促炎性細胞因子對脂肪細胞分化的體外影響。從經(jīng)過冠狀動脈旁路移植手術(shù)的患者收獲的冠狀動脈周圍的脂肪組織分離人前-脂肪細胞，并且在促炎性細胞因子存在或缺失下分化成脂肪細胞：白介素-6(2ng/ml)，腫瘤壞死因子-α(4ng/ml)和干擾素-γ(20ng/ml)。抑制前脂肪細胞分化從實驗過程期間脂質(zhì)液滴的累積中是顯而易見的。

圖20顯示了在15個經(jīng)過冠狀動脈旁路移植的患者中，在右冠狀動脈(rca)近端和距離其2cm處冠狀動脈周圍脂肪組織樣品的分析(研究分組2)。使用脂肪組織樣品用于基因表達研究以確定脂肪細胞分化狀態(tài)并用于組織學(xué)以確定脂肪細胞尺寸。圖20a-c顯示靠近rca的冠狀動脈周圍脂肪組織表達明顯較低水平的ppar-γ、cebpa和fabp4(分別是早期、晚期和末期脂肪細胞分化的標記物)。圖20d顯示了組織學(xué)數(shù)據(jù)，證明靠近rca的冠狀動脈周圍脂肪組織的脂肪細胞明顯小于更遠離rca的那些。圖20e-h顯示了在研究分組3中經(jīng)過臨床ct血管造影術(shù)的患者的rca周圍的平均脂肪組織放射密度(定量放射密度，qr)的確定(n＝273)。qr計算為對于rca周圍的冠狀動脈周圍組織的各圓柱形1mm厚層，對于距離rca壁1mm至20mm的徑向距離的脂肪的平均放射密度(-190至-30豪恩斯弗爾德單位)。圖20i顯示隨著掃描從靠近血管移向遠離它的組織，測量的qr值降低，反映了脂肪細胞分化狀態(tài)和尺寸的變化。當qr值針對離冠狀動脈疾病患者(n＝156)和健康冠狀動脈患者(n＝117)的rca外壁的距離作圖時有顯著差異。*p＜0.05對比1mm。

圖21顯示了對來自研究分組3的患者的pvat平均放射密度(pvat的定量放射密度-qrrvat)和vpci％值的分析?？偤陀夜跔顒用}(rca)鈣分數(shù)從ct血管造影計算，并且追蹤近端rca的40mm段(在其開口起點后10mm)用于對周圍血管周圍脂肪組織(pvat)和潛在血管切片的進一步分析。qrpvat計算為平均脂肪組織放射密度(-190至-30hu，位于離外血管壁的距離等于平均血管直徑的徑向距離上)并且相應(yīng)vpci％值計算為各單獨qrpvat值和離rca距離2cm的心外膜脂肪組織的qr之間的百分數(shù)差異。圖21a-b顯示在rca周圍具有高qrpvat和vpci％值的患者具有較高的總鈣分數(shù)，但是在qrpvat或vpci％與潛在rca中的鈣化體積之間沒有相關(guān)性。鈣體積定義為由衰減＞465hu的體素占據(jù)的血管壁體積。圖21c-d顯示在rca周圍較高的qrpvat和vpci％值與沒有cad的患者中較高的動脈粥樣硬化斑塊負荷相關(guān)(定義為頂部分位中的動脈粥樣硬化斑塊負荷)并且在cad患者中進一步增加。圖21e-f顯示在潛在rca段中存在動脈粥樣硬化斑塊的cad患者(在前2個分位內(nèi)的接近rca中的動脈粥樣硬化斑塊負荷)中，vpci％(但不是qripvat)與混合或鈣化斑塊相比明顯存在更多的軟斑塊(鈣化體積＝0)。

圖22顯示血管炎癥導(dǎo)致從動脈壁的促炎性介質(zhì)的較高表達和釋放。這種促炎性刺激通過觸發(fā)增殖并抑制前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞作用于周圍的血管周圍脂肪組織(pvat)，使得與更遠離血管的脂肪細胞相比，更靠近發(fā)炎血管壁的脂肪細胞尺寸更小并且分化較低?！鞍l(fā)炎”血管對其周圍脂肪組織的這些生物學(xué)效果改變了pvat親水/親脂含量并且可被計算機斷層掃描成像檢測為較高的pvat放射密度(定量放射密度或qrpvat)。從pvat到非pvat(離血管壁20mm)的qr梯度由體積血管周圍表征指數(shù)(vpci)描述，其也在發(fā)炎和非發(fā)炎血管之間不同。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，pvat的放射密度在距離外血管壁的特定距離上的“模式”變化提供了關(guān)于血管的有價值信息。本發(fā)明提供了體積表征血管周圍組織的方法和診斷血管疾病的方法，其不依賴于pvat的體積并且因此更不易于受到與脂肪組織膨脹相關(guān)的混淆因素的影響。提供了方法是有利的，因為它們向臨床醫(yī)師提供了對患者血管健康的客觀評價而不需要任何侵入性測試過程。使用本發(fā)明的方法，可定量評價各患者的血管健康以允許任何進一步測試所需要的診斷并鑒定。因此，血管疾病可在無癥狀患者中鑒定并更高卻更有效地治療，可更有效地跟蹤治療，可更恰當?shù)刂笇?dǎo)進一步研究和治療性介入，并且可更好地控制健康護理系統(tǒng)中的資源。此外，本發(fā)明使得能夠?qū)颊叩难芙】颠M行分層，使得能夠進行靶向治療性介入，在降低的成本下導(dǎo)致改善的患者結(jié)果。

對血管周圍組織進行體積進行表征的方法涉及使用從沿血管長度的計算機斷層掃描收集的數(shù)據(jù)，并包括2個步驟：對血管周圍組織的一個或多個同心層各自的放射密度進行定量；并且確定這些放射密度值中的一個或多個是否高于或低于基線放射密度值。

使用圖像分析軟件在對特定長度的血管的計算機斷層(ct)掃描中檢測血管周圍組織。血管周圍組織然后經(jīng)過體積分割成多個與血管同軸的同心層，并且計算各同心層內(nèi)的pvat的放射密度。通過施加特定放射密度閾值(從-190到-30hu)來鑒定含有pvat的體素，其從分析中排除了非脂肪組織，并且確定各同心層中含pvat的體素的放射密度。針對一個或多個單個同心層各自確定的放射密度值然后與從相同ct掃描數(shù)據(jù)組確定的基線pvat放射密度值比較。通過這種方式，可進行對位于血管周圍的脂肪組織的全面完全體積表征而不依賴于“血管周圍”的空間定義和使用豪恩斯弗爾德單位的放射密度客觀測量。針對超過一個同心層的pvat的確定放射密度與基線pvat放射密度的比較提供了相對于離血管壁的距離對pvat沉積狀態(tài)的更清晰指示。本發(fā)明的術(shù)語“血管周圍組織”理解為血管周圍的組織。血管周圍組織可包括血管周圍脂肪組織。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，“計算機斷層掃描”理解為使用計算機處理的x-射線以產(chǎn)生掃描血管周圍區(qū)域的特定區(qū)域的斷層掃描圖像。術(shù)語“計算機斷層掃描”與術(shù)語ct掃描和cat掃描同義。

以豪恩斯弗爾德單位(hu)測量的放射密度是相對無法通過材料的x-射線的量度。測量放射密度值使得基于它們的不同放射不透明度在ct中區(qū)分組織類型。脂肪不是非常放射致密的，并且其通常測量為-190至-30hu，而肌肉、血液和骨骼測量分別為+10至+40hu、+30至+45hu、和+700至+3000hu。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“基線放射密度”理解為從外血管壁周圍前1mm厚層確定的放射密度值。該值可從1mm厚層內(nèi)的相應(yīng)體素或體素群確定，例如，這些體素含有脂肪組織或水?？蓮姆治龅难苤車M織的一個或多個同心層中任一個確定基線。優(yōu)選地，基線放射密度值是從該層中體素群計算的“平均”放射密度值?；€放射密度值理解為可使用用于確定血管周圍組織的一個或多個同心層各自中的放射密度的相同ct數(shù)據(jù)來計算，但基線放射密度也理解為可基于從ct掃描數(shù)據(jù)組群收集的數(shù)據(jù)來計算。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，“平均”值理解為表示中心或一般值，并且其可使用本領(lǐng)域廣泛知道并理解的公式從測量值的樣品計算。優(yōu)選地，平均計算為放射密度值的樣品的算術(shù)平均，但是其也可計算為一組收集的放射密度值的幾何平均、調(diào)和平均、中值或模式?？赏ㄟ^參考從同心組織層內(nèi)所有體素收集的數(shù)據(jù)或參考同心組織層內(nèi)體素的選擇群來計算平均值，例如，含水或含脂肪組織的體素。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“血管周圍組織的同心層”理解為表示血管周圍的血管周圍組織的同軸層，各同心層是同心的并且位于離血管外壁的恒定距離處。

優(yōu)選地，使用常規(guī)方法和市售儀器進行對血管截面的ct掃描。

在第一方面，本發(fā)明提供了使用從沿血管長度的計算機斷層掃描收集的數(shù)據(jù)對血管周圍組織進行體積表征的方法，包括：對血管周圍組織的一個或多個同心層各自的放射密度進行定量并且確定定量放射密度值中的一個或多個是否高于或低于基線放射密度值?？纱_定血管周圍組織的一個或多個同心層各自內(nèi)的各體素的放射密度，并且通過選擇具體放射密度范圍，可能提供對這些層內(nèi)不同材料和組織類型的體積表征。選擇具有-190至-30豪恩斯弗爾德單位(hu)的放射密度值的那些體素限定代表層內(nèi)脂肪組織的那些體素的定量。選擇具有-15hu至+15hu的放射密度值的那些體素限定代表層內(nèi)的水的那些體素的定量。通過應(yīng)用這些具體閾值，可分析所有對應(yīng)于脂肪組織或水的體素并且可表征血管段周圍的脂肪組織。對應(yīng)于脂肪組織的選擇的體積數(shù)據(jù)組的放射密度提供了具有較高放射密度的脂肪組織的組成信息，表明存在較小脂肪細胞，同時更多的水表明組織內(nèi)增加的炎癥水平。

在一個具體實施方式中，本發(fā)明提供了使用從沿血管長度的計算機斷層掃描收集的數(shù)據(jù)用于通過選擇具有-190hu至-30hu的放射密度值的那些體素來定量與基線值相比的放射密度值對血管周圍脂肪組織的體積表征的方法。

在另一個具體實施方式中，本發(fā)明提供了使用從沿血管長度的計算機斷層掃描收集的數(shù)據(jù)用于通過選擇具有-15hu至+15hu的放射密度值的那些體素來定量與基線值相比的放射密度值對血管周圍組織的含水量表征的方法。

定量放射密度值可以平均值提供以允許比較來自具有不同體積的組織層的值。平均值一般計算為從各層內(nèi)的單個體素測量的放射密度值的樣品的簡單算術(shù)平均。

本發(fā)明的方法可用于使用從ct掃描收集的數(shù)據(jù)提供對任何血管周圍的血管周圍組織的體積表征。在具體實施方式中，該方法用于表征右冠狀動脈周圍的血管周圍組織和主動脈周圍的血管周圍組織。任何合適厚度的層可選擇用于根據(jù)本發(fā)明的方法的分析。然而，非常需要提供對血管周圍組織的高分辨表征，并且這通過使較薄的組織同心層經(jīng)過本發(fā)明的方法來實現(xiàn)。在一個具體實施方式中，層厚度為1mm。

一種使用本發(fā)明的方法對血管周圍組織進行體積表征的方面總結(jié)方式是將其表示為一個或多個單個值。因此，發(fā)明人定義體積血管周圍組織表征指數(shù)-整體(vpci-ia)和vpci(％)以定義離血管壁特定徑向距離上血管周圍組織的變化模式。血管周圍組織的一個或多個同心層中各自的相對于基線放射密度的定量放射密度的倍數(shù)變化針對離血管壁的一個或多個同心層各自的距離繪圖。在任何合適層中測量的定量放射密度可用作基線。最方便的是選擇在位于與血管直接接觸的組織層中測量的定量放射密度值作為基線放射密度值。計算由定量放射密度的倍數(shù)變化的曲線和基線放射密度的曲線相對于離血管外壁的距離限定的區(qū)域的面積，并且該值除以在離血管壁的特定距離(y)處測量的定量放射密度值。vpci-ia/vpci(％)的計算可在數(shù)學(xué)上如下表示：

式中

vpci-iα是積分至離外血管壁“a”mm的徑向距離的體積血管周圍組織表征指數(shù)

vpci(％)α是離外血管壁“a”mm徑向距離的定量放射密度的百分比變化

x是離外血管壁的徑向距離(mm)

h(x)是在“x”mm徑向距離處的定量放射密度

h(b)是基線放射密度

b是離開定義“基線”的血管的外壁的距離(mm)

|h(y)|是離血管壁特定距離y處測量的定量放射密度的絕對值

從中計算血管周圍組織放射密度的變化模式的徑向距離(a)可以是離健康血管壁的外表面的距離，其中pvat放射密度達到掃描的解剖區(qū)域的最小值或在基線放射密度值下降低超過10％，其中基線放射密度是從外血管壁周圍的前1mm厚同心層確定的脂肪組織的放射密度值。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)計算vpci-i10和vpci-i20值提供了關(guān)于血管健康的特別有用的信息。vpci-i10和vpci-i20值預(yù)測冠狀動脈疾病(cad)的存在并且與沒有cad的高風(fēng)險對象相比在患有cad的對象中明顯較低(參見圖1和2)。vpci-i10對于鑒定具有動脈粥樣硬化的血管更敏感，而vpci-i20一般在鑒定冠狀動脈粥樣硬化中更優(yōu)，即使在潛在血管中沒有明顯的疾病。vpci-i指數(shù)可用于表征包括右冠狀動脈、左冠狀動脈系統(tǒng)、和其他血管床(包括主動脈和股動脈)的任何血管周圍的組織。

區(qū)分血管周圍脂肪組織(pvat)和非血管周圍脂肪組織(非-pvat)之間是有用的。這區(qū)分了位于血管附近的脂肪組織和遠離血管并因此不能被認為在血管周圍的脂肪組織。本領(lǐng)域迄今面臨的主要問題是缺少對pvat的有意義定義。通過使用對血管周圍組織的體積分割，本發(fā)明提供了這種將pvat定義為位于離外壁等于血管半徑的距離內(nèi)或等于脂肪組織的放射密度與相同類型的無疾病血管中脂肪組織的基線放射密度相比降低超過5％的點的脂肪組織，其中脂肪組織的基線放射密度是從外血管壁周圍的前1mm厚層確定的值。兩種脂肪組織類型之間的區(qū)別能夠確定另一種有用的血管健康指數(shù)，體積血管周圍表征指數(shù)(vpci)，其可通過從非血管周圍組織層中的定量放射密度減去血管周圍組織層的定量放射密度來計算。在一個具體實施方式中，在血管外壁周圍等于血管半徑的距離處測量血管周圍組織層中的定量放射密度。在另一個具體實施方式中，在位于血管外壁周圍等于2-3被血管平均半徑尺寸的距離處的層處測量非血管周圍組織層中的定量放射密度。vpci的計算可在數(shù)學(xué)上如下表示：

vpci＝[qrpvat-qrnpvat]

其中

vpci是體積血管周圍表征指數(shù)

qrpvat是血管周圍組織層中的定量放射密度

qrnpvat是非血管周圍組織層中的定量放射密度

或者，vpci可使用下式表示成qrpvat相對qrnpvat的變化％：

vpci＝[qrpvat-qrnpvat]

發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)vpci值在具有低閾值和高閾值的尺度上的分層能夠?qū)Ⅲw積血管周圍組織表征分數(shù)(vpcs)分配至各血管。在vpci值等于或低于低閾值的情況下分配i的vpcs，在vpci值高于低閾值但低于高閾值的情況下分配ii的vpcs，并且在vpci值等于或高于高閾值的情況下分配iii的vpcs。在一個具體實施方式中，本發(fā)明提供了vpcs尺度，其中低閾值為2.0并且高閾值為8.0。

用于表征血管周圍組織的vpci-i指數(shù)(vpci-ia和vpcs)可應(yīng)用于血管以評價其健康狀態(tài)。

具有較高vpcs、vpci(％)和較低vpci-ia分數(shù)的冠狀動脈血管可被診斷為“患病”并且因此與沒有疾病的健康冠狀動脈血管區(qū)分。這些指數(shù)也可用于預(yù)測冠狀動脈粥樣硬化的進展速率。此外，未患有已知冠狀動脈疾病的對象的冠狀動脈脂肪組織的表征可提供關(guān)于發(fā)生冠狀動脈疾病的風(fēng)險的有價值的預(yù)后信息，甚至在早期，超過并高于目前作為提供這種預(yù)后信息的唯一已建立的ct成像生物標記物的冠狀動脈鈣分數(shù)。

qrpvat、vpci(％)和vpci-i指數(shù)的另一種有用的應(yīng)用涉及亞臨床動脈粥樣硬化及其進展速率。目前，臨床醫(yī)師評價頸動脈(頸部動脈)的內(nèi)膜-中膜厚度作為亞臨床動脈粥樣硬化的指數(shù)，因為其是未來心血管事件的強效預(yù)測物?？捎嬎泐i動脈的血管周圍組織的qrpvat、vpcs、vpci(％)和vpci-ia并且它們可提供關(guān)于亞臨床動脈粥樣硬化的進展速率的有價值信息。這將幫助臨床醫(yī)師在任何臨床癥狀發(fā)生前在非常早期收集關(guān)于動脈粥樣硬化發(fā)展風(fēng)險的其他預(yù)后信息。類似地，可評價外周動脈(例如，股動脈，圖11)的血管周圍組織以收集關(guān)于分別沒有或有已建立的外周動脈疾病的對象中發(fā)生外周動脈疾病或其進展速率的預(yù)后信息。

qrpvat、vpcs、vpci(％)和vpci-ia也可提供關(guān)于主動脈疾病的信息(圖10)。胸和腹主動脈都被血管周圍脂肪組織層包圍，該組織層可能涉及主動脈疾病的發(fā)病。通過使用qrpvat、vpcs、vpci(％)和vpci-ia指數(shù)檢測主動脈周圍脂肪組織的早期變化可有助于鑒定處于發(fā)生主動脈粥樣硬化或者甚至更嚴重的主動脈瘤的風(fēng)險的患者。此外，在具有診斷的穩(wěn)定主動脈瘤的患者中，較高的qrpvat、vpcs、vpci(％)和較低的vpci-ia分別可提供關(guān)于動脈瘤的炎性狀態(tài)和破裂風(fēng)險的有價值預(yù)后信息。

相同的分析可應(yīng)用于人體的各血管床，并且可計算各單獨血管的qrpvat、vpcs、vpci(％)和vpci-ia。圖7-11證明了這種對右冠狀動脈、左前降支動脈、左回旋支動脈、主動脈和股動脈的分析。

下面參照以下非限制性實施例進一步描述本發(fā)明：

實施例1

來自64切片掃描儀(generalelectric，lightspeedultra，美國威斯康星州密爾沃基的通用電器公司(generalelectric，milwaukee，wi，usa))的可用計算機斷層掃描(ct)圖像可用于分析血管周圍組織和血管疾病表型。根據(jù)局部臨床方案調(diào)整采集環(huán)境以實現(xiàn)最優(yōu)圖像質(zhì)量。重構(gòu)的造影增強圖像被傳輸至來自terarecon公司(terarecon，inc.)(加利福尼亞州圣馬特奧(sanmateo，ca)v.4.4.11)的aquarius用于進行體積重建分析。使用3d彎曲多平面重構(gòu)來定義感興趣的血管段并分析血管周圍組織。讀者需要手動追蹤感興趣的區(qū)域并且血管周圍組織然后被以半自動方式分割成外血管壁周圍的同心層。分析血管周圍組織特征以確定對應(yīng)于外血管壁周圍前20mm的各同心血管周圍層內(nèi)脂肪組織或水的體素的放射密度值。血管周圍脂肪組織和水的平均放射密度曲線針對離外血管壁的距離作圖以計算體積血管周圍表征指數(shù)(vpci)和vpci-整體(vpci-ia)，如說明書中所述。對于血管斑塊形態(tài)的分析，采用之前提出的定義(obaid等，circcardiovascimaging.2013；6∶655-664)：壞死核心定義為-1至+64hu，纖維斑塊定義為+65至+260hu并且血管鈣化定義為＞600hu。

實施例2

研究群體

由453個在牛津大學(xué)醫(yī)院nhs信托基金經(jīng)過心臟手術(shù)的患者組成研究分組1(參見表1)。排除標準是任何炎性、感染性、肝/腎病或惡性腫瘤。也排除接受非甾族抗炎藥物的患者。在手術(shù)期間，收獲脂肪組織的樣品，即皮下(scat，來自胸部切口部位)、胸(that，來自中央胸區(qū)，連接至于心包膜)和心外膜脂肪組織(epat，來自右房室溝部位，遠離可見血管)。脂肪組織樣品經(jīng)速凍用于基因表達研究、組織學(xué)和ct成像，作為外植體，如下所述。這些患者中105個的亞組也經(jīng)過ct血管造影術(shù)(cta)，如下所述，目標在于關(guān)聯(lián)脂肪組織活檢的組織學(xué)和生物特征與體內(nèi)和體外相同脂肪組織儲庫的圖像特征。

研究分組2包括37個經(jīng)過冠狀動脈旁路移植手術(shù)(cabg)的患者，其在與研究分組1相同的包括/排除標準下招募(參見表1)。收回pvat(與近端rca相鄰)和非-pvatepat(從離rca2cm遠的區(qū)域，在右心室上且不靠近任何其他冠狀動脈分支)的成對樣品用于基因表達研究。另外，主動脈組織的樣品(收集為來自升主動脈上旁路移植的接合位點的“按鈕”)被收集并用于與初級脂肪細胞的離體共培養(yǎng)實驗，如本手冊下述。

研究分組3，包括273個在ouhnhs信托基金處經(jīng)過診斷冠狀動脈cta的患者的臨床組(156個具有并且117個沒有明顯冠狀動脈疾病，參見表2)。該組用于驗證從研究分組1和2生成的發(fā)現(xiàn)并將它們應(yīng)用于臨床環(huán)境中。

取血和循環(huán)生物標記物的測量

在禁食后8小時，在其手術(shù)前的早上，從研究分組1的患者獲得靜脈血樣品。通過化學(xué)發(fā)光微顆粒免疫試驗測量血清胰島素并且通過使用市售試劑盒(德國威斯巴登的雅培公司(abbott，wiesbadengermany))的己糖激酶方法測量血清葡萄糖。胰島素抗性由homa-ir定義，其使用公式(葡萄糖x胰島素)/405計算，葡萄糖以mg/dl測量并且胰島素以mu/l測量(matthewsdr，hoskerjp，rudenskias，naylorba，treacherdf和turnerrc(1985).內(nèi)穩(wěn)態(tài)模式評估：來自人中禁食血漿葡萄糖和胰島素濃度的胰島素抗性和β-細胞功能(homeostasismodelassessment：insulinresistanceandbeta-cellfunctionfromfastingplasmaglucoseandinsulinconcentrationsinman).diabetologia28：412-9)。

脂肪細胞尺寸測量

將在-80°下在最佳切片溫度(oct)介質(zhì)中儲存的at切片切成15微米切片并固定在載玻片上。使用無血清蛋白質(zhì)封閉物封閉非特異性抗原結(jié)合持續(xù)1-2小時(#x0909，美國加利福尼亞州卡皮特亞的大科細胞公司(dakocytomation，carpinteria，california，usa))。使用針對過氧化物酶的dab底物試劑盒對染色進行顯色(#sk-4100，美國加利福尼亞州伯林蓋姆的維克多實驗室公司(vectorlaboratories，burlingame，california，usa))。用neo-mount(#109016，德國達姆施塔特的默克公司(merckkgaa，darmstadt，germany))固定載玻片。在亮場顯微鏡下對細胞尺寸進行定量。對于各患者，使用imagej軟件(v1.48)對每個儲庫定量3個不同場。

rna分離和定量實時-聚合酶鏈反應(yīng)(qrt-pcr)

脂肪和主動脈組織的樣品在qiazol(加利福尼亞州斯坦福的凱杰公司(qiagen，stanford，ca))中速凍并且在-80℃下尺寸直至加工。使用rneasymicro或mini試劑盒(凱杰公司)提取rna并且將核糖核酸轉(zhuǎn)化成互補dna(quantitect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒-凱杰公司)。脂肪組織cdna然后經(jīng)過使用針對ppar-γ(試驗id：hs01115513_ml)，和作為管家基因的親環(huán)蛋白(試驗idhs04194521_s1)的taqman探針(加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，fostercity，ca))的qpcr。類似地，衍生自主動脈組織的cdna經(jīng)過使用針對tnfα(試驗idhs01113624_g1)，il6(試驗idhs00985639_m1)和ifnγ(試驗idhs00989291_m1)，以及作為管家基因的gapdh(試驗idhs02758991_g1)的taqman探針(加利福尼亞州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)的qpcr。反應(yīng)一式三份在384-孔板中進行，每個反應(yīng)使用5ng的cdna，在abi7900ht快速實時pcr系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上。基于標準曲線的斜率確定各板中的反應(yīng)效率；使用pfaffl方法計算各感興趣基因相對于其管家基因的表達(pfafflmw(2001).用于實時rt-pcr中相對定量的新數(shù)學(xué)模型(anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timert-pcr).nucleicacidsres29：e45)。

炎癥對冠狀動脈周圍原代前脂肪細胞分化的影響(研究分組2)

為了測試具有晚期動脈粥樣硬化的患者的人動脈壁是否分泌能夠防止前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞的炎性介質(zhì)(從血管壁上附連的pvat分離)，從經(jīng)過cabg的患者中收獲主動脈組織并在補充1％青霉素/鏈霉素，20％fbs的dmem中培養(yǎng)。使用組織外植體方法來(waltonlj，franklinij，baystont，brownlc，greenhalghrm，taylorgw和powelljt(1999).在腹主動脈瘤中抑制前列腺素e2合成：平滑肌細胞活力、炎性過程、和腹主動脈瘤擴張的應(yīng)用(inhibitionofprostaglandine2synthesisinabdominalaorticaneurysms：implicationsforsmoothmusclecellviability，inflammatoryprocesses，andtheexpansionofabdominalaorticaneurysms).circulation100：48-54)，在100nm血管緊張素ii存在/缺失下孵育1周以誘導(dǎo)額外血管炎癥。同時，通過在膠原酶h的溶液(pbs中1mg/ml)中在37℃下消化pvat持續(xù)45分鐘從附連在這些患者的rca上的pvat分離前脂肪細胞。消化的組織然后在1200rpm下離心5分鐘并且在補充10％fbs和0.25ng/ml人fgf的dmem/f-12中重懸。前脂肪細胞和主動脈組織(+/-血管緊張素ii)分開培養(yǎng)1周。在這周結(jié)束時，洗滌主動脈組織以去除血管緊張素ii并與分離的原代前脂肪細胞共培養(yǎng)。當前脂肪細胞在主動脈組織周圍融合時，它們在補充0.5mm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx)、100nm胰島素、100nm地塞米松、2nm三碘-l-甲腺原氨酸(t3)、10pg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1μm羅格列酮、33μm生物素和17μm泛酸、3％fbs的dmem/f12中分化7天，之后在補充10nm胰島素、10nm地塞米松的dmem/f12的脂肪細胞維持培養(yǎng)基中2天(leemj，wuy和friedsk(2012).最大化人前脂肪細胞分化并改善代謝表型的修飾方法(amodifiedprotocoltomaximizedifferentiationofhumanpreadipocytesandimprovemetabolicphenotypes).obesity(silverspring)20：2334-40)。在第9天，在視覺上并通過用油紅o染色，之后通過使用imagej(版本1.48)定量來檢測脂肪細胞的細胞尺寸和直至累積。在平行實驗中，在用/不用血管緊張素ii100nm的7天培養(yǎng)之后，通過使用rtpcr在主動脈組織活檢中對這些細胞因子進行定量來測試主動脈組織表達炎性細胞因子(例如，il6、tnf-a或ifn-γ，其然后可對pvat施加旁分泌作用)的能力。

炎癥對冠狀動脈周圍前脂肪細胞分化的影響(研究分組2)

通過下述過程來測試血管炎癥對血管周圍脂肪細胞分化能力的直接影響：孵育從經(jīng)過cabg的患者的pvat分離的原代前脂肪細胞與重組tnf-α(4ng/ml)、il-6(25ng/ml)和ifn-γ(20ng/ml)，在由誘導(dǎo)的含0.5mmibmx、100nm胰島素、100nm地塞米松、2nmt3、10pg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、1μm羅格列酮、33μm生物素和17μm泛酸、3％fbs的dmem/f12分化時程期間孵育持續(xù)7天，之后在含有含10nm胰島素，10nm地塞米松的dmem/f12的脂肪細胞維持培養(yǎng)基中持續(xù)2天。對于分化時程，每3天拍攝圖像并分離rna。通過以下估計前脂肪細胞的分化程度：a)脂肪細胞形態(tài)和尺寸變化，b)脂質(zhì)液滴的累積(使用油紅o染色)，c)脂肪細胞分化基因的表達，即ppar-γ，一種早期分化標記物，cebpaccaat/增強結(jié)合蛋白(c/ebp)α(cebpa)，一種晚期分化標記物，和脂肪酸結(jié)合蛋白-4(fabp4)，一種末期分化/成熟脂肪分子的標記物。

炎癥對冠狀動脈周圍前脂肪細胞增殖的影響(研究分組2)

從pvat(冠狀動脈周圍at)分離的人前脂肪細胞在96孔板中培養(yǎng)(5x10³個細胞/孔)24小時。然后配對的孔用/不用tnf-α(4ng/ml)、il-6(25ng/ml)、和ifn-y(20ng/ml)處理24小時和48小時。向各孔添加20μlcelltiter96aqueousone溶液試劑(普洛麥格公司(promega))并且板在37℃下孵育2小時。隨后，使用96-孔板酶標儀測量490nm處的吸光度。

油紅o染色

簡言之，已用100ml異丙醇溶液0.3g油紅o(西格瑪奧德里奇公司(sigmaaldrich))制備油紅o儲液。在分化時程的第9天，用pbs洗滌脂肪細胞2次并用4％多聚甲醛在室溫下固定10分鐘。細胞用蒸餾水洗滌，之后用60％異丙醇洗滌5分鐘。細胞然后用油紅o溶液(3份油紅o儲液/2份水)染色10分鐘并最后用自來水洗滌。核用蘇木精溶液復(fù)染。通過相差顯微術(shù)觀察脂質(zhì)液滴形成。為了對成熟脂肪細胞中累積的脂質(zhì)液滴的量進行定量，用60％異丙醇的溶液洗滌用油紅o染色的細胞以提取油紅o。染料在500nm處的吸光度經(jīng)分光光度定量。對于脂肪細胞和主動脈組織的共培養(yǎng)實驗，使用imagej(版本1.48)而不是通過分光光度對固定的載玻片的圖像分析進行油紅o的定量，以避免從以下事實衍生的定量偏差：脂肪細胞不再主動脈組織樣品下生長，導(dǎo)致每個孔的生長脂肪細胞的可變表面積。

計算機斷層掃描研究(研究分組1和3)

研究分組1和3中的參與者經(jīng)過在64切片掃描儀上的心臟ct掃描(generalelectric，lightspeedultra，美國威斯康星州密爾沃基的通用電器公司)。用21-號針頭插入醫(yī)學(xué)肘前靜脈。通過靜脈注射β-阻斷劑將心律降低至低于60bpm(40mg美托洛爾iv的平均劑量)。也給予舌下三硝酸甘油酯(800μg)以剛好在掃面前實現(xiàn)最大冠狀動脈血管舒張。參與者首先經(jīng)過非造影ct掃描(0.35秒旋轉(zhuǎn)時間，2.5mm軸切片厚度，20mm檢測器覆蓋率，20mm間隔，120kvp的管功率和200ma)。隆突用作顱標志，而隔膜用作尾標志。肺視場延伸以覆蓋整個胸軟組織(用于皮下脂肪組織分析)。通過使用標志，冠狀動脈ct血管造影掃描之后以高速率(5ml/秒)靜脈注射95ml的碘基造影介質(zhì)(niopam370，博萊科英國公司(braccoukltd))，并且有50ml的0.9％生理鹽水沖洗。ct掃描在造影介質(zhì)填充升主動脈之時開始。在所有參與者中使用120kvp的管功率(軸切片厚度0.625mm，旋轉(zhuǎn)時間0.35秒，檢測器覆蓋40mm，40％劑量降低方案針對ma，和針對身體尺寸調(diào)整的參考ma)。通過在70％的心臟循環(huán)處的ecg-門選使用預(yù)測圖像獲取(如果需要，用100msec填充用于對右冠狀動脈的最優(yōu)成像)。從任何分析中排除在獲取上有步移偽影(stepartefacts)或次優(yōu)rca成像的參與者。

通過ct的脂肪組織表征：重構(gòu)圖像被轉(zhuǎn)化成aquariusv.4.4.11(美國加利福尼亞州福斯特城的terarecon公司)用于體積重建分析。at定義為所有體素在-190至-30hu窗口內(nèi)。體素放射密度組圖經(jīng)印跡并且定量放射密度指數(shù)(qr)在3個維度上被定義為感興趣at體積的平均體素放射密度(-190至-30hu的前特異化窗口內(nèi))。有效假設(shè)(workinghypothesis)是脂肪細胞尺寸是qr的主要驅(qū)動(較高的脂質(zhì)相(脂肪細胞)對水相(胞外空間)的比例)，并且更大的脂肪細胞將趨向更負的qr。通過以半自動方式對心包膜外形修復(fù)(contouring)來追蹤epat(從最顱點的肺動脈的分歧開始脂質(zhì)最尾點的心臟頂點)。通過在胸骨末端的高度上并向頭端延伸總共25mm對所有胸皮下at取樣來追蹤scat。使用在現(xiàn)有研究程序的內(nèi)容上開發(fā)的aquarius軟件的研究版本(terarecon公司，v.4.4.11)從3d重構(gòu)圖像計算epat和scat中的qr。同時用和不用造影劑對研究分組1中的患者進行掃描以評價造影劑對測量的qr絕對值的影響。

冠狀動脈周圍脂肪組織表征：使用3d彎曲多平面重構(gòu)來定義感興趣的血管段并分析血管周圍組織。使用右冠狀動脈(rca)來進行冠狀動脈周圍脂肪組織成像，因為這種冠狀動脈沒有主要分支并且可容易地確定pvat/非pvat。從分析中略去近端rca的前1cm以從分析中排除位于靠近冠狀動脈開口/主動脈根的脂肪組織。然后，以自動化方式追蹤rca的4cm長的段(從右冠狀動脈開口的第10mm至第50mm)。分析的內(nèi)和外層經(jīng)手動調(diào)整以分別追蹤腔和外壁邊界。然后，血管周圍組織被半自動方式分割成外血管壁周圍的20個同心圓柱形1mm厚層。計算20個組織層各自的qr。at的平均放射密度曲線針對離外血管壁的徑向距離作圖。

pvat中的qr：對pvat沒有清楚的生物學(xué)定義，因為對于圖像研究，pvat被定義為組織層中在離冠狀動脈壁等于追蹤的rca段的平均直徑的徑向距離內(nèi)的脂肪組織放射密度。在離rca壁最遠的at的同心層處定義非pvat放射密度。體積血管周圍表征指數(shù)(vpci)然后計算為pvat中的qr與非pvat(離rca外壁2cm)中的qr的差，如上定義。

冠狀動脈鈣分數(shù)：通過計算agatston分數(shù)分別針對所有冠狀動脈和針對rca在aquarius上測量冠狀動脈鈣分數(shù)(ccs)(agatstonas，janowitzwr，hildnerfj，zusmernr，viamontem，jr.和detranor(1990).使用超快計算機斷層掃描對冠狀動脈鈣進行定量(quantificationofcoronaryarterycalciumusingultrafastcomputedtomography).jamcollcardiol15：827-32)。

使用cta的冠狀動脈斑塊分析：對于血管斑塊形態(tài)的分析，采用之前提出的hu閾值(obaiddr，calvertpa，gopaland，parkerra，hoolesp，westne，goddardm，ruddjh和bennettmr(2013).通過冠狀動脈計算機斷層掃描鑒定的動脈粥樣硬化斑塊組成和分類：與虛擬組織學(xué)血管內(nèi)超聲和組織學(xué)相比對計算機斷層掃描生成的斑塊圖的評價(atheroscleroticplaquecompositionandclassificationidentifiedbycoronarycomputedtomography：assessmentofcomputedtomography-generatedplaquemapscomparedwithvirtualhistologyintravascularultrasoundandhistology).circcardiovascimaging6∶655-64)。使用對右冠狀動脈壁的hu映射來對纖維斑塊體積進行定量(65至265hu)。纖維斑塊指數(shù)計算為纖維斑塊體積與總血管體積之比。

脂肪組織外植體的ct掃描

來自研究分組1的所有患者的scat、that和epat組織的冷凍樣品在干冰上冷凍時經(jīng)掃描，以評價qr描述脂肪組織生物學(xué)的能力。在toshibaaquilionone320-切片ct掃描儀上掃描脂肪組織外植體，使用135kev和80kev的雙功率螺旋獲取，50ma，0.5秒旋轉(zhuǎn)時間，0.5mm切片厚度，和120kev下的圖像重構(gòu)用于qr分析。在這些患者的105個中，進行配對ct掃描(體內(nèi)掃描以及對來自相同解剖位點/儲庫的組織外植體的掃描)以針對體內(nèi)成像驗證體外ct成像模型，并能夠使用該模型來理解qr在人at研究中的生物學(xué)價值。

統(tǒng)計學(xué)分析

使用柯莫果夫-斯米爾諾夫(kolmogorov-smirnov)檢驗來檢驗連續(xù)變量的正態(tài)分布。非正太分布的變量經(jīng)log-轉(zhuǎn)化用于分析并且表示為中值(第25至第75百分位)。正態(tài)分布的變量表示為平均±sem。

使用針對2個組的未配對t-檢驗或針對3個組的單因素anova來進行不同組患者之間的特征比較。對于圖4中配對的pvat和非pvat中的特異性基因的表達和脂肪細胞尺寸的差異比較，使用威爾科克森配對秩檢驗。針對重復(fù)測量，使用雙因素anova來研究在距離rca的距離上qr變化中的組間差異，使用(離rca外壁的距離)x(組)交互作用。對于脂肪細胞分化時程的組間差異，我們針對重復(fù)測量使用雙因素anova，使用(時間)x(組)交互作用。

酌情通過使用卡方檢驗來比較類別變量。通過使用二變量分析來評價連續(xù)變量之間的相關(guān)性，并且酌情估計泊松(pearson′s)r或斯皮爾曼(spearman′s)rho系數(shù)。使用spssv20.0來進行所有的統(tǒng)計學(xué)檢驗并且p＜0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

表1：研究參與者的人口統(tǒng)計特征

ccta：冠狀動脈計算機斷層掃描血管造影術(shù)；cad：冠狀動脈疾?。籥cei：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；arb：血管緊張素受體阻斷劑；ccb：鈣通道阻斷劑。homa-ir：胰島素抗性的內(nèi)穩(wěn)態(tài)模型；hdl：高密度脂蛋白；bmi：體重指數(shù)。

表2：研究分組3中研究參與者的人口統(tǒng)計特征

cad：冠狀動脈疾?。籥cei：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；arb：血管緊張素受體阻斷劑；ccb：鈣通道阻斷劑。bmi：體重指數(shù)；**p＜0.01對比無cad

結(jié)果

表征不同脂肪組織儲庫中脂肪細胞分化狀態(tài)和細胞尺寸

我們首先研究了從453個經(jīng)過心臟手術(shù)的患者中獲得的epat、that和scat之間的表型差異(研究分組1，表1)。epat和that與scat相比有明顯較小的脂肪細胞，反映了前脂肪細胞到大成熟脂肪細胞的弱分化(圖13a-d)。事實上，與scat相比epat/that中弱的脂肪細胞分化狀態(tài)由明顯較低的ppar-γ(表征早期脂肪細胞分化(ntambijm和young-cheulk(2000).細胞脂肪分化和基因表達(adipocytedifferentiationandgeneexpression).jnutr130：3122s-3126s)，圖13e)、cebpa(表征晚期脂肪細胞分化(ntambijm和young-cheulk(2000).脂肪細胞分化和基因表達(adipocytedifferentiationandgeneexpression).jnutr130：3122s-3126s)，圖13f)和fabp4(僅在大成熟脂肪細胞中表達(ntambijm和young-cheulk(2000).脂肪細胞分化和基因表達(adipocytedifferentiationandgeneexpression).jnutr130：3122s-3126s)，圖13g)表達證明。因此脂肪組織中的這些脂肪細胞分化標記物的表達可用作平均脂肪細胞尺寸的標記物。

血管炎癥對人冠狀動脈周圍脂肪組織中脂肪細胞分化狀態(tài)的影響

鑒于我們在人中的最近研究(margaritism，antonopoulosas，digbyj，leer，reillys，coutinhop，shirodariac，sayeedr，petroum，desilvar，jalilzadehs，demosthenousm，bakogiannisc，tousoulisd，stefanadisc，choudhuryrp，casadeib，channonkm和antoniadesc(2013).血管壁和血管周圍脂肪組織之間的相互作用揭示了脂連蛋白在調(diào)節(jié)人血管中內(nèi)皮一氧化碳合成功能中的新作用(interactionsbetweenvascularwallandperivascularadiposetissuerevealnovelrolesforadiponectinintheregulationofendothelialnitricoxidesynthasefunctioninhumanvessels).circulation127：2209-21，以及antonopoulosas，margaritism，coutinhop，shirodariac，psarrosc，herdmanl，，sannaf，desilvar，petroum，sayeedr，krasopoulosg，leer，digbyj，reillys，bakogiannisc，tousoulisd，kesslerb，casadeib，channonkm和antoniadesc(2014).脂連蛋白作為2型糖尿病和人動脈壁中血管nadph-氧化酶活性的連接：血管周圍脂肪組織的調(diào)節(jié)作用(adiponectinasalinkbetweentype2diabetesmellitusandvascularnadph-oxidaseactivityinthehumanarterialwall：theregulatoryroleofperivascularadiposetissue).diabetes64(6)：2207-19)和來自動物研究的其他證據(jù)(takaokam，suzukih，shiodas，sekikawak，saitoy，nagair和satam(2010).血管內(nèi)損傷誘導(dǎo)血管周圍脂肪組織中的快速表型變化(endovascularinjuryinducesrapidphenotypicchangesinperivascularadiposetissue).arteriosclerthrombvasebiol30：1576-82)表明pvat中的脂肪細胞“感受”在潛在血管壁中正發(fā)生的促動脈粥樣硬化過程修飾其生物學(xué)，我們確信來自人動脈壁的炎性信號可擴散到血管周圍脂肪組織影響局部脂肪組織分化狀態(tài)和尺寸。由于無法獲得人冠狀動脈的樣品用于研究，我們使用在cabg手術(shù)期間獲得的主動脈組織(獲自研究分組2中患者的升主動脈上移植接合位點的主動脈“按鈕”，表1)作為我們的模型系統(tǒng)，我們在血管緊張素ii(以誘導(dǎo)其他血管炎癥)存在或缺失下離體培養(yǎng)其一周(圖14a)(waltonlj，franklinij，baystont，brownlc，greenhalghrm，taylorgw和powelljt(1999).在腹主動脈瘤中抑制前列腺素e2合成：平滑肌細胞活力、炎性過程、和腹主動脈瘤擴張的應(yīng)用(inhibitionofprostaglandine2synthesisinabdominalaorticaneurysms：implicationsforsmoothmusclecellviability，inflammatoryprocesses.andtheexpansionofabdominalaorticaneurysms).circulation100：48-54)。在這一周結(jié)束時，用血管緊張素ii治療能夠上調(diào)主動脈組織中炎性細胞因子il-6、tnf-α和ifn-γ的表達(圖14b)。在培養(yǎng)中的第一周之后，我們洗滌主動脈組織以去除血管緊張素ii并將其與從相同患者收集的前脂肪細胞共培養(yǎng)，之后使用已建立的方法誘導(dǎo)脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞(adamsm，montaguect，prinsjb，holderjc，smithsa，sandersl，digbyje，sewtercp，lazarma，chatterjeevk和o′rahillys(1997).氧化物酶體增殖物活化的受體γ的活化劑對人前脂肪細胞分化有儲庫特異性影響(activatorsofperoxisomeproliferator-activatedreceptorgammahavedepot-specificeffectsonhumanpreadipocytedifferentiation).jclininvest100：3149-53)。我們觀察到與在沒有主動脈組織下培養(yǎng)的前脂肪細胞相比，用血管緊張素ii預(yù)處理的主動脈組織培養(yǎng)的脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化較慢，而用未刺激的主動脈組織共培養(yǎng)的前脂肪細胞有中等的分化狀態(tài)(圖14)，表明從“發(fā)炎”人血管壁釋放的介質(zhì)可引發(fā)針對相鄰pvat的旁分泌效果，防止前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞。

為了探索炎性介質(zhì)(在血管壁中產(chǎn)生)直接修飾pvat的前脂肪細胞分化的能力，我們?nèi)缓笫箯膒vat收集的人前脂肪細胞接觸il-6、tnf-α和ifnγ的組合并誘導(dǎo)其分化。我們觀察到這些細胞因子對前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞有明顯的抑制效果，如在分化時程期間視覺上觀察到的那樣(圖19)，并且由較低的使用分光光度試驗定量的脂質(zhì)液滴的胞內(nèi)累積證明(油紅o染色，圖16a-d)(圖16e)。然后通過對分化時程期間pparγ(圖16g)、cebpa(圖16h)和fabp4(圖16i)的表達進行定量來確認這些細胞因子對前脂肪細胞分化能力的影響。相同的細胞因子也明顯加速了使用mts試驗評價的人前脂肪細胞的增殖速率(圖16f)。這些發(fā)現(xiàn)支持了血管衍生的炎性細胞因子可以旁分泌方式誘導(dǎo)增殖并抑制相鄰血管周圍脂肪組織中人前脂肪細胞的分化。因此，如果我們開發(fā)非侵入性工具來監(jiān)測由血管炎癥驅(qū)動的這些pvat的表型變化，我們可以非侵入性地鑒定冠狀動脈中的炎癥。

使用計算機斷層掃描評價脂肪細胞分化狀態(tài)

脂肪組織的脂質(zhì)和水相之間的平衡反映在脂肪細胞尺寸中(digirolamom和owensjl(1976).與細胞尺寸相關(guān)的大鼠脂肪組織的含水量和分離的脂肪細胞(watercontentofratadiposetissueandisolatedadipocytesinrelationtocellsize).amjphysiol231：1568-72)。為了探索脂肪組織的平均ct放射密度(由上述qr指數(shù)表示)是否提供脂肪細胞分化狀態(tài)/尺寸的標記物，我們對從經(jīng)過心臟手術(shù)的453個患者獲得的epat、that和scat外植體中的qr進行定量。在qr和相同樣品中cebpa和fabp4的表達定義的脂肪細胞分化程度之間有明顯負相關(guān)(圖17a-f)。在脂肪組織外植體的qr和由組織學(xué)定量的脂肪細胞尺寸之間也存在強負相關(guān)(圖17g)。因此，我們確信qr可用作不同脂肪組織液滴中脂肪細胞分化和尺寸變化的標記物(即，脂肪細胞分化/尺寸越大，組織的內(nèi)容物越親脂，因此qr越負)。為了在體內(nèi)確定這種假設(shè)，我們在其脂肪組織外植體已經(jīng)離體成像的105個患者的組中進行ct掃描(來自研究分組1)。我們觀察到體內(nèi)獲得的qr和來自這些患者的相同組織的外植體中測量的相應(yīng)qr之間的強相關(guān)性(圖17h和i)。

為了進一步驗證qr估計體內(nèi)脂肪細胞分化狀態(tài)(此處為脂肪細胞尺寸)的能力，我們將來自105個患者的ct掃描的epat和scat的體內(nèi)qr值(如上所述)與脂肪細胞分化標記物的表達相關(guān)聯(lián)。我們觀察到，體內(nèi)qr與來自這些患者的相應(yīng)脂肪組織液滴中cebpa(圖18a和b)和fabp4(圖18c和d)的表達都強相關(guān)。體內(nèi)epatqr明顯高于體內(nèi)scatqr(圖18e)，確認在組織學(xué)上證明的脂肪組織液滴分化狀態(tài)的差異導(dǎo)致相應(yīng)的體內(nèi)qr差異。有趣的是，homa-ir與體內(nèi)scatqr正相關(guān)，但不與epatqr正相關(guān)(圖18f)，表明全身代謝狀態(tài)關(guān)聯(lián)至scat分化狀態(tài)/脂肪細胞尺寸，而epat的則受到局部而非全身刺激的高度調(diào)節(jié)。

技術(shù)考慮：鑒于常規(guī)使用造影劑來進行ct掃描，我們?nèi)缓筇剿髁嗽煊皠Λ@得的體內(nèi)qr圖像的可能影響，并且證明從圖像獲得的qr與有和沒有造影劑給予之間的強線性關(guān)系(圖15)。由于that的高區(qū)域性組織學(xué)異質(zhì)性，體內(nèi)ct圖像與相應(yīng)組織活檢的生物學(xué)特性的有意義匹配是不可能的。因此，所述的qr迄今僅在epat和scat中提供了體內(nèi)脂肪細胞分化狀態(tài)/尺寸的可靠標記物。

觀察體內(nèi)冠狀動脈周圍脂肪組織中脂肪細胞尺寸/分化狀態(tài)的變化

為了研究qr和人冠狀動脈周圍脂肪細胞尺寸/分化狀態(tài)之間的關(guān)系，我們比較了來自研究分組2中經(jīng)過cabg的患者的剛好與右冠狀動脈(rca)相鄰的脂肪組織和離rca2cm的脂肪，而不是與任何可見的心外膜冠狀動脈分支相鄰。我們首先觀察到ppar-γ、cebpa和fabp4的表達在更靠近rca處明顯下調(diào)(圖20a-c)。類似地，脂肪細胞尺寸在靠近右冠狀動脈時明顯小于離血管壁2cm遠的脂肪細胞尺寸(圖20d)。這些觀察確認了我們從離體和體外實驗中的發(fā)現(xiàn)，顯示來自增加的人冠狀動脈的炎性信號防止與其相鄰的pvat中前脂肪細胞的分化，在冠狀動脈樹周圍的脂肪組織中產(chǎn)生這種效果的梯度。為了檢驗我們是否能夠通過非侵入性ct成像追蹤響應(yīng)冠狀動脈炎癥的pvat的這些形態(tài)變化，我們使用我們新開發(fā)的成像分析工具來分析研究分組3中273個對象的額外臨床組的ct血管造影圖像(156個具有并且117個沒有明顯冠狀動脈粥樣硬化，研究分組3)。我們對右冠狀動脈的近段周圍的qr進行定量，在1mm厚度的3d圓柱層中，從剛好與血管壁相鄰移動到離血管壁20mm遠(圖20e-h)。我們在從靠近血管移動到遠離其的脂肪組織時觀察到qr逐漸降低至更小的負值(圖20i)，證明qr精確追蹤脂肪細胞尺寸和分化狀態(tài)的變化。重要的是，與健康個體相比，qr和離血管壁的距離之間的關(guān)系在冠狀動脈粥樣硬化患者中明顯不同，顯示接近與較大的更分化的脂肪細胞相容的健康個體血管壁的較低qr(圖20a-i)。這表明觀察到的qr變化實際上可表征人冠狀動脈內(nèi)側(cè)的血管炎癥，其是可使用新型非侵入性方法體內(nèi)檢測的。

用臨床預(yù)測值針對已建立的成像生物標記物驗證qr和vpci

為了用已知臨床預(yù)測值針對已建立的成像生物標記物驗證qr，我們對研究分組3中273個患者中的rca中的ccs(在rca中，并且在整個冠狀動脈樹中是全局性的)和纖維斑塊指數(shù)進行定量。在qr和鈣分數(shù)之間有明顯相關(guān)性(圖21a和b)，但是qr區(qū)分具有不可檢測的鈣的對象和具有可檢測但低的鈣的對象的能力是相當有限的。vpci(從pvat到非pvat的qr梯度)在鑒定具有中等冠狀動脈鈣分數(shù)(總體(圖21c)或在rca中特異(圖21d))的對象中作為生物標記物是更優(yōu)的。重要的是，qr和vpci都與潛在rca的纖維斑塊指數(shù)強相關(guān)(圖21e和f)。