政府權(quán)利
本發(fā)明在國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)的國家過敏和傳染病研究所(nationalinstitutesofallergyandinfectiousdisease)授予的小型企業(yè)創(chuàng)新研究基金1r43-ai-106188-01的政府資助下完成。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及供于吸入的、脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的藥物組合物，用以預(yù)防或治療由多種微生物或胞內(nèi)病原體，尤其是非結(jié)核分枝桿菌(ntm)所致的呼吸道感染。
發(fā)明背景
呼吸道感染可由多種微生物所致。對(duì)于衛(wèi)生保健團(tuán)體而言，頑固的感染會(huì)產(chǎn)生大量后果，包括增加的治療負(fù)擔(dān)和成本，而對(duì)于患者而言則為更具侵襲性的治療模式，以及嚴(yán)重疾病甚至死亡的可能性。如果存在一種改善的治療模式，其能夠提供預(yù)防性治療來預(yù)防易感患者患上呼吸道感染，并且對(duì)于已被微生物感染的患者而言，增加根除的速率和有效性，那么將會(huì)是有益的。
眾所周知，非結(jié)核分枝桿菌(ntm)的肺部感染難以治療。它們以多種形式存在于肺中，包括巨噬細(xì)胞內(nèi)和生物膜內(nèi)。抗生素特別難以觸及這些位置。此外，ntm還可以處于靜止(稱為固著)或復(fù)制期，從而，有效的抗生素治療將要靶向這兩個(gè)時(shí)期。我們吃驚地發(fā)現(xiàn)，包含脂質(zhì)體中包封的環(huán)丙沙星的某些環(huán)丙沙星組合物針對(duì)巨噬細(xì)胞中聚留的ntm和靜止存在于生物膜中的ntm的抗細(xì)菌活性是有效的。
鳥分枝桿菌(mycobacteriumavium)候米瑟氏(hominissuis)亞種(后文稱作鳥分枝桿菌(m.avium))和膿腫分枝桿菌(mycobacteriumabscessus)(后文稱膿腫分枝桿菌)的肺部感染是嚴(yán)重的醫(yī)療衛(wèi)生問題，并且在目前的療法中存在很大的限制。由ntm造成的肺部感染的發(fā)生率正在增長(zhǎng)(adjemian等，2012；prevots等，2010)，尤其是因鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌所致(inderlied等，1993)。美國有約80％的ntm與鳥分枝桿菌相關(guān)聯(lián)(adjemian等，2012；prevots等，2010)。膿腫分枝桿菌，其在最具毒力的類型之中發(fā)病率排列第二(prevots等，2010)。由這兩種分枝桿菌所致的疾病在具有慢性肺部病癥，例如，肺氣腫、囊性纖維化和支氣管擴(kuò)張的患者中常見(yeager和raleigh，1973)。它們還可引起嚴(yán)重呼吸疾病，例如，支氣管擴(kuò)張(fowler等，2006)。所述感染來自環(huán)境來源，并且對(duì)肺造成漸進(jìn)性損害?，F(xiàn)有治療通常在功效上不理想，或與顯著的副作用相關(guān)聯(lián)。鳥分枝桿菌感染通常采用大環(huán)內(nèi)酯(克拉霉素)或氮雜紅霉素(阿奇霉素)聯(lián)合乙胺丁醇和阿米卡星的全身療法來治療。口服或靜脈(iv)喹諾酮，例如環(huán)丙沙星和莫西沙星，可與其它化合物聯(lián)用(yeager和raleigh，1973)，但需要較高的胞內(nèi)藥物水平來實(shí)現(xiàn)最大功效?？诜h(huán)丙沙星僅在與大環(huán)內(nèi)酯或氨基糖苷聯(lián)合給予時(shí)具有針對(duì)鳥分枝桿菌的臨床功效(shafran等1996；delalla等，1992；chiu等，1990)。體外和小鼠內(nèi)研究表明，僅口服環(huán)丙沙星的受限活性與環(huán)丙沙星無法在感染位置處達(dá)到殺細(xì)菌濃度相關(guān)(inderlied等，1989)；5μg/ml的最小抑制濃度(mic)對(duì)比4μg/ml的臨床血清c最大解釋了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腿祟愔杏邢薜墓π?inderlied等，1989)。膿腫分枝桿菌常對(duì)克拉霉素具有抗性。需要施用靜脈氨基糖甙類或亞胺培南，其通常是唯一可用的治療可選方式，并且這些攜載著嚴(yán)重副作用的可能，以及與靜脈給予相關(guān)聯(lián)的創(chuàng)傷和成本。有時(shí)也規(guī)定氯法齊明、利奈唑胺和頭孢西丁，但用于靜脈給予的毒性和/或需求限制了這些化合物的應(yīng)用。因此，可用的療法具有顯著的缺陷，從而需要改良的方案。
近期研究也顯示，鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌感染均與顯著的生物膜形成相關(guān)聯(lián)(bermudez等，2008；carter等，2003)：在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，鳥分枝桿菌中與生物膜相關(guān)聯(lián)的基因的刪除對(duì)于細(xì)菌形成生物膜和造成肺部感染的能力具有影響(yamazaki等，2006)。
環(huán)丙沙星是廣譜氟喹諾酮抗生素，其針對(duì)若干其它類型的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌具有活性，從而指示用于下呼吸道感染的口服和靜脈治療。其通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶ii(dna旋轉(zhuǎn)酶)和拓?fù)洚悩?gòu)酶iv來發(fā)揮作用，上述酶是細(xì)菌的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和重組所需的酶。該作用機(jī)理與青霉素、頭孢菌素、氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素不同，因此，對(duì)于這些類別的藥物具有抗性的細(xì)菌可能對(duì)環(huán)丙沙星易感。目前在喹諾酮(環(huán)丙沙星所屬的抗微生物劑類別)和其它類別的抗微生物劑之間還沒有已知的交叉抗性。
盡管它有吸引人的抗微生物性質(zhì)，環(huán)丙沙星確實(shí)會(huì)產(chǎn)生麻煩的副作用，例如gi不耐癥(嘔吐、腹瀉、腹部不適)，以及頭暈、失眠、應(yīng)激和增加的焦慮水平。明確需要可長(zhǎng)期使用而不會(huì)導(dǎo)致這些使人衰弱的副作用的改良的治療方案。
以吸入氣溶膠形式遞送環(huán)丙沙星，通過劃分所述藥物在呼吸道(感染的主要位置)中的遞送和作用，而具有解決這些擔(dān)憂中的一些的潛力。目前，還沒有經(jīng)監(jiān)督管理批準(zhǔn)的用于人類應(yīng)用的氣溶膠化形式的環(huán)丙沙星能夠?qū)⒖股刂苯影邢蜻f送至主要感染區(qū)域。這部分是因?yàn)樵撍幬锏妮^差溶解性和苦味抑制了適于吸入的制劑的開發(fā)；患有氣道疾病的許多患者在吸入未經(jīng)脂質(zhì)體包封的抗生素時(shí)可能會(huì)咳嗽或支氣管狹窄(barker等，2000)。此外，環(huán)丙沙星的組織分布極為快速，致使肺中的藥物停留時(shí)間過短，以無法提供口服或靜脈途徑給予藥物以外的附加治療益處(bergogne-bérézine，1993)。
通過納入脂質(zhì)體，許多藥物的治療性質(zhì)得到了改善。作為藥物遞送系統(tǒng)，在1965年重新發(fā)現(xiàn)磷脂載劑作為“脂質(zhì)體”(bangham等，1965)。通用術(shù)語“脂質(zhì)體”涵蓋了多種結(jié)構(gòu)，但其均由一種或多種脂質(zhì)雙層組成，封閉出一水性空間，其中親水性藥物，例如環(huán)丙沙星，可被包封。脂質(zhì)體包封通過多種機(jī)理改善了生物藥學(xué)特性，包括改變的藥物藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布、從該運(yùn)載體的持續(xù)藥物釋放、對(duì)于疾病位置增強(qiáng)的遞送，和，保護(hù)活性藥物物質(zhì)不被降解。如下物質(zhì)的的脂質(zhì)體制劑：抗癌劑阿霉素
因此，相比現(xiàn)有的環(huán)丙沙星制劑，脂質(zhì)體環(huán)丙沙星氣溶膠制劑應(yīng)具有如下數(shù)項(xiàng)益處：1)較高的藥物濃度，2)通過感染位置處的持續(xù)釋放實(shí)現(xiàn)的增長(zhǎng)的藥物停留時(shí)間，3)減少的副作用，4)增加的適口性，5)進(jìn)入細(xì)菌生物膜的較好透過性，和6)進(jìn)入被細(xì)菌感染的細(xì)胞的較好透過性。
在本發(fā)明的一個(gè)示例中，包封環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體是單層載劑(平均粒徑75-120nm)。環(huán)丙沙星以約10小時(shí)的半衰期在肺中從這些脂質(zhì)體緩慢釋放(bruinenberg等，2010b)，這允許一天一次的給藥。此外，在體外和鼠類感染模型中進(jìn)行的，采用多種脂質(zhì)體組合物的研究顯示，脂質(zhì)體環(huán)丙沙星有效抵抗數(shù)種胞內(nèi)病原體，包括鳥分枝桿菌。吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星也有效治療患者中的銅綠假單胞菌(pa)肺部感染(bilton等，2009a、b，2010，2011；bruinenberg等，2008，2009，2010a、b、c、d，2011；serisier等，2013)。
相比批準(zhǔn)的口服和靜脈環(huán)丙沙星劑量，通過吸入進(jìn)入氣道遞送的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑達(dá)到了呼吸道粘膜中和巨噬細(xì)胞中的高得多的濃度，并伴隨獲得如下臨床功效的改善：在患者中，吸入我們的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的治療劑量之后2小時(shí)，痰液中的環(huán)丙沙星濃度超過200μg/ml，并且，甚至在20小時(shí)后(下一次給藥之前2小時(shí))，其濃度>20μg/ml，遠(yuǎn)高于上述用于抵抗分枝桿菌(約4μg/ml的斷點(diǎn)(bruinenberg2010b))的最小抑制濃度。因?yàn)榘h(huán)丙沙星的脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞竭力吞噬，使得環(huán)丙沙星得以達(dá)到胞內(nèi)病原體的緊密附近，所以進(jìn)一步增加了抗分枝桿菌濃度，因此該吸入型脂質(zhì)體制劑相對(duì)于環(huán)丙沙星的其它形式而言應(yīng)能獲得改善的功效。因此，我們認(rèn)為，采用我們的吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星甚至能抑制高抗性ntm。這極具意義，因?yàn)樵谶@些患者長(zhǎng)期應(yīng)用全身抗生素，已常見鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌對(duì)于抗生素的抗性。我們采用綠膿假單胞菌(p.aeruginosa(pa))的臨床實(shí)踐也顯示，在吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星治療之后，沒有明顯的抗性產(chǎn)生：事實(shí)上，甚至在初始時(shí)已經(jīng)具有抗性菌株的那些患者均對(duì)治療有良好響應(yīng)(serisier等，2013)。這可能歸因于持續(xù)的壓倒性濃度的環(huán)丙沙星的存在。此外，在患有囊性纖維化的患者中采用其它抗假單胞菌性藥物妥布霉素和多粘菌素的實(shí)踐顯示，甚至具有pa抗性菌株的患者也對(duì)所述吸入形式的藥物臨床響應(yīng)良好(fiel，2008)。
數(shù)項(xiàng)體外研究已顯示，脂質(zhì)體環(huán)丙沙星有效抵抗胞內(nèi)病原體：1)在人類外周血單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，測(cè)試的濃度為0.1-5μg/ml的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星，相比相同濃度的游離藥物，造成了胞內(nèi)鳥分枝桿菌-細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合物(mac)集落形成單位(cfu)的濃度相關(guān)減少(majumdar等，1992)；2)在鼠類巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系j774中，脂質(zhì)體環(huán)丙沙星使細(xì)胞相關(guān)的鳥分枝桿菌的水平減少高達(dá)43倍，并且這些減少大于游離環(huán)丙沙星的結(jié)果(oh等，1995)。
一旦鳥分枝桿菌或膿腫分枝桿菌感染單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，該感染可隨后擴(kuò)散至肺、肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓和血液。對(duì)于動(dòng)物模型中脂質(zhì)體環(huán)丙沙星抵抗鳥分枝桿菌或膿腫分枝桿菌的功效還沒有公開的研究。
少數(shù)體內(nèi)研究已顯示，脂質(zhì)體環(huán)丙沙星有效抵抗胞內(nèi)病原體土拉弗朗西斯菌：采用少至單一劑量的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星，在小鼠中證明了通過吸入或鼻內(nèi)滴注遞送至肺的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星抵抗吸入性兔熱病(土拉弗朗西斯菌活疫苗菌株(lvs)和schus4)的功效，其提供100％的接觸后保護(hù)，并且甚至對(duì)于已經(jīng)具有顯著的全身感染的動(dòng)物具有有效的接觸后治療(blanchard等，2006；dininno等，1993；conley等，1997；hamblin等，2011；hamblin等，2014；wong等，2003)。這些研究還發(fā)現(xiàn)，吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星優(yōu)于吸入和口服的未包封的環(huán)丙沙星。
不同的是，a)在分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞模型中，游離環(huán)丙沙星不如脂質(zhì)體環(huán)丙沙星(majumdar等，1992；oh等，1995)；b)在土拉弗朗西斯菌感染的鼠模型中測(cè)試時(shí)，遞送至肺的單獨(dú)的游離環(huán)丙沙星的功效不如游離環(huán)丙沙星(conley等，1997；wong等，2003)，因?yàn)槠浔谎杆傥者M(jìn)入血流。由游離環(huán)丙沙星和脂質(zhì)體環(huán)丙沙星兩者制成的制劑結(jié)合了游離環(huán)丙沙星的初始瞬時(shí)高濃度的潛在優(yōu)勢(shì)，以增加肺中的c最大，隨后是環(huán)丙沙星從脂質(zhì)體組分的緩釋，這由阿拉迪姆公司(aradigm)在非cf支氣管擴(kuò)張患者中得到證實(shí)(cipolla等，2011；serisier等，2013)。游離環(huán)丙沙星組分還具有希望的免疫調(diào)節(jié)作用(美國專利號(hào)8,071,127、8,119,156、8,268,347和8,414,915)。
此外，胃腸外注射的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星能活化巨噬細(xì)胞，甚至在低于抑制水平的濃度下也能導(dǎo)致增加的吞噬作用、一氧化氮產(chǎn)量，和胞內(nèi)微生物殺滅作用，這可能是通過免疫刺激作用所致(wong等，2000)。載有環(huán)丙沙星的巨噬細(xì)胞可能會(huì)從肺遷移進(jìn)入淋巴，以治療肝、脾和骨髓中的感染–由肺部-遞送的cfi在兔熱病中的全身作用所表明(dininno等，1993；conley等，1997；hamblin等，2011；hamblin等，2014；wong等，2003)。已知脂質(zhì)體-包封的抗生素能夠較好地透過由銅綠假單胞菌在肺中形成的細(xì)菌膜(meers等，2008)。然而，之前從未顯示一般載有抗生素的脂質(zhì)體，或脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星，能夠透過由肺中的分枝桿菌(尤其是ntm)形成的生物膜。因此，遞送至肺的新型制劑的抗分枝桿菌和免疫調(diào)節(jié)作用可提供用于被鳥分枝桿菌或膿腫分枝桿菌感染的患者的現(xiàn)有治療的更好替代方式，或者，如果該抗生素制劑有效抵抗，浮游型以及處于生物膜和巨噬細(xì)胞中的這些生物體，則提供對(duì)于增進(jìn)改善的附加作用。還要求抗生素治療在通過吸入給予時(shí)具有良好耐受性和安全性。鑒于現(xiàn)有的抗生素治療選項(xiàng)常常造成嚴(yán)重的全身副作用，希望獲得新的療法，以采用較低毒性的抗生素，并使其在循環(huán)中的濃度最小化以避免全身副作用。
一項(xiàng)關(guān)于脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的研究證實(shí)了動(dòng)物中通過肺泡巨噬細(xì)胞的高攝取，這大概也是小鼠中吸入性兔熱病的高度有效的接觸后預(yù)防和治療的原因。盡管在呼吸道給予我們的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星之后，環(huán)丙沙星的血漿水平較低，觀察到肝、脾、氣管支氣管淋巴結(jié)以及肺中的兔熱病感染的減少，表明載有脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的肺泡巨噬細(xì)胞通過淋巴從肺遷移進(jìn)入肝、脾和淋巴結(jié)(未檢測(cè)骨髓和血液中的土拉弗朗西斯菌cfu水平)(conley等，1997)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
現(xiàn)有的臨床模式是采用口服或通過靜脈給予的聯(lián)合療法來治療患有鳥分枝桿菌或膿腫分枝桿菌肺部感染的患者。但是，如上所述，現(xiàn)有的治療方法具有許多問題，并且功效不佳。本發(fā)明的制劑是吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑，其對(duì)于ntm患者具有改善的功效，并且允許每天一次吸入，其可與其它療法相聯(lián)合。本發(fā)明的吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星提供針對(duì)鳥分枝桿菌散播性感染的全身治療，其與其它抗生素協(xié)同作用，并在肺中達(dá)到高濃度?？砂l(fā)生巨噬細(xì)胞攝取的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星通過淋巴向脾和肝的運(yùn)輸，如在土拉弗朗西斯菌鼠模型中觀察到的那樣。
治療非結(jié)核分枝桿菌感染的方法包括：
使一劑量的制劑氣溶膠化，以產(chǎn)生氣溶膠化的顆粒，該顆粒的氣動(dòng)學(xué)直徑在1微米-12微米，或2微米-10微米，或4微米-8微米范圍內(nèi)；和
將該氣溶膠化的顆粒吸入患者的肺，大約一天一次，持續(xù)約7到56天或直至感染被根除。
該制劑包含抗感染藥物，其可以是環(huán)丙沙星。該制劑可包括液體運(yùn)載體，其可以是液體藥物或惰性液體例如水或乙醇。所述運(yùn)載體可具有溶解或分散于其中的藥物。
所述運(yùn)載體將具有分散于其中的脂質(zhì)體，并且所述脂質(zhì)體包封具有抗感染藥學(xué)活性的藥物的納米晶體，所述藥物可以是環(huán)丙沙星。所述脂質(zhì)體包含脂質(zhì)雙層，其初始包封運(yùn)載體和藥物的溶液，隨后冷凍至-20℃～-80℃，然后融化，從而藥物納米晶體保留在脂質(zhì)體雙層的內(nèi)部。
所述脂質(zhì)體可包含冷凍保護(hù)劑和表面活性劑。冷凍保護(hù)劑可以是多元醇，例如蔗糖或海藻糖。表面活性劑是非離子去污劑，其可以是聚山梨醇酯20和/或brij20。
本發(fā)明還包括用于治療非結(jié)核分枝桿菌的制劑的應(yīng)用，其中，所述制劑通過特定方法產(chǎn)生，由此藥物(例如環(huán)丙沙星)以25mg/ml或更高、50mg/ml或更高、100mg/ml或更高、200mg/ml或更高的范圍內(nèi)的濃度溶解于水性溶液中，并且被包封進(jìn)入脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層。然后，可將所述脂質(zhì)體納入溶液中，該溶液可包括抗感染劑，該抗感染劑可與包封在該脂質(zhì)體內(nèi)的抗感染化合物(且例如可以是環(huán)丙沙星)相同或不同。該制劑經(jīng)冷凍，例如，在-20℃～-80℃范圍內(nèi)的極低溫度下被冷凍。該冷凍制劑可長(zhǎng)期維持冷凍狀態(tài)以供儲(chǔ)存，例如一周或更久，一個(gè)月或更久，一年或更久，或者可以立即再融化以供使用。脂質(zhì)體內(nèi)的藥物再融化之后形成納米晶體。在給予溶解于溶劑中的藥物之后，脂質(zhì)體周圍的運(yùn)載體提供藥物即釋，隨后，當(dāng)脂質(zhì)體溶解于肺中時(shí)，藥物被釋放，隨后，當(dāng)納米晶體溶解時(shí)，藥物進(jìn)一步被釋放。該制劑提供抗感染藥物(例如環(huán)丙沙星)在肺中的長(zhǎng)時(shí)間控釋，由此使其能夠有效地根除以生物膜形式出現(xiàn)的感染。
直接遞送該制劑至肺的脂質(zhì)體中環(huán)丙沙星的包封的組合使這些治療在生物分布、藥物動(dòng)力學(xué)以及改善的安全性和功效方面本質(zhì)上不同于環(huán)丙沙星和其它抗生素的口服和胃腸外產(chǎn)品。該脂質(zhì)體-包封的環(huán)丙沙星以極高濃度直接遞送至呼吸道，其在彼處停留一段延長(zhǎng)的時(shí)間，在此期間，環(huán)丙沙星從脂質(zhì)體緩慢釋放至肺中的感染位置，并且相較于口服或靜脈環(huán)丙沙星而言具有較低的全身暴露度。
設(shè)計(jì)脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑的大小和組成，以促進(jìn)在肺中被巨噬細(xì)胞攝取。最重要的特征是，該制劑應(yīng)對(duì)霧化工藝穩(wěn)健，從而脂質(zhì)體能夠保留其大小和包封特點(diǎn)。如果脂質(zhì)體對(duì)氣溶膠化不穩(wěn)健，那么可能會(huì)出現(xiàn)包封的藥物的損失，或者脂質(zhì)體大小或表面特點(diǎn)的變化。這些變化或尚未述及的其它因素可能會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的較低攝取。在霧化或氣溶膠化過程中損失其包封的藥物的部分的脂質(zhì)體，即便它們以與未受影響的脂質(zhì)體相同的效率被脂質(zhì)體攝取，也會(huì)因?yàn)榫哂休^少的包封藥物，以至于處理巨噬細(xì)胞和生物膜中的感染性物質(zhì)的負(fù)載量較低，由此降低治療功效。
本發(fā)明涵蓋的一種脂質(zhì)體具體組成相對(duì)不受霧化加工影響，并且已描述于美國專利號(hào)8,071,127、8,119,156、8,268,347和8,414,915。那些專利描述了吸入型液滴或顆粒的可氣溶膠化的、雙相氣溶膠。所述液滴或顆粒包含游離藥物(例如，抗感染化合物)，其中，藥物不被包封，并且其可以是環(huán)丙沙星。所述顆粒還包含脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體包封藥物(例如，抗感染化合物，其也可以是環(huán)丙沙星)。游離藥物和脂質(zhì)體包封的藥物被包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑之內(nèi)，該賦形劑經(jīng)配制用于氣溶膠化的遞送。所述顆粒還可包括其它治療劑，其可以是游離的和/或處于脂質(zhì)體中，并且，其可以是不同于第一藥物的任何具有藥學(xué)活性的藥物。
其它脂質(zhì)體組合物包括通過霧化改性的那些，這導(dǎo)致囊泡大小變化，或藥物包封，或兩者。這些包括含有藥物(例如阿米卡星)的脂質(zhì)體，其已描述于美國專利號(hào)8,226,975、8,642,075、8.673.348、8,673,349，和美國專利申請(qǐng)：2007196461、20130028960、20130052260、20130064883、20130071469、20130087480、20130330400、20140072620。美國專利申請(qǐng)20130330400特別描述了阿米卡星的脂質(zhì)體制劑，其受霧化影響，從而僅58-73％的藥物在接觸霧化之后仍被包封。在該申請(qǐng)，美國專利申請(qǐng)20130330400中，平均囊泡大小也受霧化加工的影響，其從霧化前的平均285nm減小至霧化后的265nm(范圍：249-289nm)。美國專利申請(qǐng)20140072620也描述了脂質(zhì)體阿米卡星制劑，其在霧化后被降級(jí)成60％包封藥物和40％的游離藥物。
與本發(fā)明聯(lián)用的脂質(zhì)體，相對(duì)于在霧化之前包封的情況，在霧化之后保留80％或更多，且優(yōu)選90％或更多，且最優(yōu)選95％或更多的包封的藥物。如果在霧化過程中從脂質(zhì)體損失了顯著量的藥物，例如，大于20％的包封的藥物，那么在脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞攝取的過程中，假設(shè)其被設(shè)計(jì)進(jìn)入脂質(zhì)體的特征集，那么將會(huì)有較少的包封的藥物被釋放進(jìn)入巨噬細(xì)胞，由此影響體內(nèi)功效。這在將對(duì)胞內(nèi)感染產(chǎn)生活性的脂質(zhì)體制劑的能力中是一項(xiàng)關(guān)鍵要素。即便是經(jīng)過體外或體內(nèi)研究且能夠在那些模型中展現(xiàn)功效的制劑，在實(shí)踐情況中，該制劑首先要被霧化或氣溶膠化，因此，除非該制劑以氣溶膠形式(這并不典型)使用，或者已經(jīng)進(jìn)行了其它研究以驗(yàn)證在氣溶膠化之后保留的脂質(zhì)體的完整性，否則無法確保在該模型中的結(jié)果的有效性。
肺泡巨噬細(xì)胞是鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌(jordao等，2008)以及其它分枝桿菌物種的靶標(biāo)。巨噬細(xì)胞竭力攝入脂質(zhì)體環(huán)丙沙星和分枝桿菌，在吞噬體中使兩者緊密鄰近。這種在感染的靶標(biāo)(肺中的肺泡巨噬細(xì)胞)處的生物可及性上的增加，提供了對(duì)比全身遞送的環(huán)丙沙星或其它抗分枝桿菌劑而言的，改善的功效。環(huán)丙沙星從脂質(zhì)體的持續(xù)釋放還能，具體地，增加肺和巨噬細(xì)胞中的曲線下面積與mic之比(auc/mic)，并且允許每天一次給藥。這些制劑的給予提供了較低的復(fù)發(fā)率和減小的負(fù)面全身作用。
本發(fā)明的方面是吸入的液滴或顆粒的氣溶膠。所述液滴或顆粒包含游離藥物(例如，抗感染化合物)，其中藥物不被包封，并且所述藥物可以是環(huán)丙沙星。所述顆粒還包含脂質(zhì)體，其包封藥物，例如，抗感染化合物，所述藥物也可以是環(huán)丙沙星。游離藥物和脂質(zhì)體包封的藥物被包括在藥學(xué)上可接受的賦形劑中，其經(jīng)配制用于氣溶膠化遞送。所述顆粒還可包括其它治療劑，其可以是游離的和/或處于脂質(zhì)體中，并且，其可以是不同于第一藥物的任何具有藥學(xué)活性的藥物。
本發(fā)明的另一方面是包含脂質(zhì)體的制劑，其通過氣溶膠遞送至患有ntm感染的人類患者的肺，或用以預(yù)防ntm感染，所述脂質(zhì)體包含游離的和包封的環(huán)丙沙星。所述脂質(zhì)體可以是單層的或多層的。所述氣溶膠化可通過霧化，包括射流霧化或網(wǎng)霧化來實(shí)現(xiàn)。包封的環(huán)丙沙星處于脂質(zhì)體中，其對(duì)霧化工藝穩(wěn)健，并在霧化之后保持其包封狀態(tài)至大于90％，且優(yōu)選在霧化之后保持其包封狀態(tài)大于95％。
本發(fā)明的第三方面是用于治療患者中的胞內(nèi)感染的方法，所述方法包括：給予所述患者包含所述抗感染劑(例如，包封在脂質(zhì)體中的環(huán)丙沙星)的制劑。該制劑優(yōu)選通過吸入法給予所述患者，且更優(yōu)選通過霧化。胞內(nèi)感染可表示ntm感染，包括膿腫分枝桿菌(m.abscessus)，鳥分枝桿菌(m.avium)，鳥分枝桿菌復(fù)合群(m.aviumcomplex)，(mac)(鳥分枝桿菌和細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌(m.avium和m.intracellulare))，博氏分枝桿菌(m.bolletii)，龜分枝桿菌(m.chelonae)，潰瘍分枝桿菌(m.ulcerans)，蟾分枝桿菌(m.xenopi)，堪薩斯分枝桿菌(m.kansasii)，偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群(m.fortuitumcomplex)(偶發(fā)分枝桿菌和龜分枝桿菌(m.fortuitum和m.chelonae))或海魚分枝桿菌(m.marinum)感染。
本發(fā)明的第四方面是，所述脂質(zhì)體抗感染制劑，優(yōu)選脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑，在氣溶膠化且遞送至氣道和肺部深處后，可被巨噬細(xì)胞攝取的能力，且，具有殺滅復(fù)制性和非復(fù)制性(固著的)分枝桿菌的能力。就ntm的成功治療而言，所需的是所述治療既殺滅復(fù)制性分枝桿菌又殺滅靜止(或固著的)分枝桿菌，應(yīng)為這兩種形成均見于分枝桿菌感染。
本發(fā)明的第五方面是，對(duì)于最大有效性的治療而言，所述抗生素制劑還需能夠透過分枝桿菌形成的生物膜。
本發(fā)明的第六方面是，合適載劑中的抗生素不僅能夠透過所述生物膜，而且針對(duì)固著的(靜止的)和復(fù)制性分枝桿菌均具有功效。
本發(fā)明的另一方面是，所述抗生素不增強(qiáng)分枝桿菌生物膜在肺中的形成。具體地，鳥分枝桿菌形成生物膜，這是與通過氣溶膠形成肺部感染的小鼠中的狀況。將鳥分枝桿菌與環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的兩種抗生素，鏈霉素和四環(huán)素孵育，導(dǎo)致生物模形成的增加而非減少。其它抗生素，包括氨芐青霉素、莫西沙星、利福平和tmp/smx，對(duì)于生物膜無作用；即，它們無法殺滅鳥分枝桿菌。莫西沙星是一種氟喹諾酮，類似環(huán)丙沙星。因此，令人吃驚的是，本發(fā)明的特定脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑有效殺滅生物膜中的分枝桿菌。注意到，即便抗生素能夠殺滅分枝桿菌的所有浮游生物表型，浮游的細(xì)菌和固著的細(xì)菌均能夠等同地建立感染，確保剩余的固著細(xì)菌再次感染宿主?；加新苑尾坎“Y的許多患者采用抗生素(例如氨基糖甙類或四環(huán)素)治療由多種病原體所致的感染。因此，在鳥分枝桿菌定殖于接受抗生素(不論預(yù)防抑或治療)的個(gè)體的情況中，其可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生增加量的生物膜，并且進(jìn)一步建立感染。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，同時(shí)包含游離抗感染劑和包封的抗感染劑的制劑在肺中提供初始高治療水平的抗感染劑，同時(shí)維持抗感染劑隨時(shí)間的持續(xù)釋放，以攻破所述屏障，從而根除治療生物膜細(xì)菌方面的困難。因此，即刻-釋放抗感染劑(例如，環(huán)丙沙星)的目的是使肺部難以根除的生物膜細(xì)菌周圍的抗生素濃度快速增加至治療水平，以克服抗生素向生物膜和在生物膜中擴(kuò)散速率較低的問題。緩釋抗感染劑(例如，環(huán)丙沙星)的作用是，在肺部保持治療水平的抗生素，由此提供較長(zhǎng)時(shí)間范圍內(nèi)的持續(xù)的治療，增加功效、降低給予頻率，并減小形成耐藥集落的可能性?？垢腥緞谋景l(fā)明脂質(zhì)體的持續(xù)釋放能夠確保該抗感染劑從不減少到低于抑制水平(sub-inhibitory)的濃度之下，從而減小形成針對(duì)該抗感染劑的抗性的可能性。
盡管環(huán)丙沙星是具體用于本發(fā)明的抗感染劑，并不希望將本發(fā)明限制于環(huán)丙沙星。可采用其它抗生素或抗感染劑，例如，選自下組的那些：氨基糖苷、四環(huán)素、磺胺，對(duì)氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、喹諾酮、β-內(nèi)酰胺、β-內(nèi)酰胺和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯、青霉素、頭孢菌素、潔霉素、克林霉素、壯觀霉素、多粘菌素b、粘菌素、萬古霉素、桿菌肽、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齊明、薩力多胺、多烯抗真菌劑、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黃霉素、特康唑、布康唑環(huán)吡司、環(huán)吡酮胺、鹵普羅近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬，或其任意組合。
優(yōu)選同時(shí)針對(duì)靜止(固著的)和復(fù)制性跟細(xì)菌有效的抗生素。
本發(fā)明的一方面是應(yīng)用于治療非結(jié)核分枝桿菌感染的制劑，或治療非結(jié)核分枝桿菌感染的方法，其包括：
使一劑量的制劑氣溶膠化，以產(chǎn)生氣動(dòng)學(xué)直徑在1微米-12微米范圍內(nèi)的氣溶膠化顆粒；
將所述氣溶膠化顆粒吸入患者的肺，
其中，所述氣溶膠化制劑包含液體運(yùn)載體，所述液體運(yùn)載體包含：溶液中濃度為20mg/ml-80mg/ml的環(huán)丙沙星的游離環(huán)丙沙星液體運(yùn)載體、溶液中的未經(jīng)脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星，和包封在脂質(zhì)體內(nèi)的納米晶體形式的環(huán)丙沙星；
其中，所述氣溶膠化顆粒的氣動(dòng)學(xué)直徑是2微米-8微米，所述脂質(zhì)體的直徑是20納米-1微米，并且所述納米晶體的尺寸是10納米或更?。?/p>
其中，所述環(huán)丙沙星以30mg/ml-70mg/ml的濃度存在于溶液中；或者
其中，所述環(huán)丙沙星以40mg/ml-60mg/ml的濃度存在于溶液中；
其中，所述脂質(zhì)體是單層的，并且在氣溶膠化之后，以90％或更高的水平保持結(jié)構(gòu)完整性；并且
在至少七天的時(shí)程內(nèi)重復(fù)所述氣溶膠化和吸入，每天一次；或者
其中，所述重復(fù)每天進(jìn)行，在7天-56天的時(shí)程中每天一次，并且其中，所述感染是生物膜形式。
本發(fā)明的另一方面是如上所述的應(yīng)用或方法，其還包括：
檢測(cè)所述患者的感染；
當(dāng)患者測(cè)試為陽性時(shí)，繼續(xù)所述重復(fù)的氣溶膠給予，而當(dāng)該患者測(cè)試為陰性時(shí)，不繼續(xù)上述給予；
其中，所述脂質(zhì)體包含冷凍保護(hù)劑和表面活性劑；
其中，95％或更多的所述脂質(zhì)體保持結(jié)構(gòu)完整性，并且在所述制劑的氣溶膠化之后繼續(xù)包封環(huán)丙沙星的納米晶體；或者
其中，98％或更多的所述脂質(zhì)體保持結(jié)構(gòu)完整性，并且在所述制劑的氣溶膠化之后繼續(xù)包封環(huán)丙沙星的納米晶體。
本發(fā)明的另一方面是，制劑在治療非結(jié)核分枝桿菌感染中的應(yīng)用，其中，所述制劑包含：
脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含：
脂質(zhì)雙層；
冷凍保護(hù)劑；
和
被所述脂質(zhì)雙層圍繞的具有藥學(xué)活性的抗感染藥物的納米晶體，其中，所述納米晶體的尺寸是100nm或更小；
其中，所述冷凍保護(hù)劑是多元醇；
其中，所述多元醇是蔗糖或海藻糖；
其中，所述脂質(zhì)體還包含表面活性劑。
如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用還包括：
藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體；或
溶解于所述運(yùn)載體中的具有藥學(xué)活性的抗感染藥物；或
液體抗感染藥物，所述脂質(zhì)體分散于其中。
如上所述的應(yīng)用還包括如下應(yīng)用，其中，所述抗感染藥物選自下組：喹諾酮、磺胺、氨基糖苷、四環(huán)素、對(duì)氨基苯甲酸、二氨基嘧啶、β-內(nèi)酰胺、β-內(nèi)酰胺和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯、潔霉素、克林霉素、壯觀霉素、多粘菌素b、粘菌素、萬古霉素、桿菌肽、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、卷曲霉素、砜、氯法齊明，薩力多胺、多烯抗真菌劑、氟胞嘧啶、咪唑、三唑、灰黃霉素、特康唑、布康唑環(huán)吡司、環(huán)吡酮胺、鹵普羅近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬及其組合；和
其中，所述脂質(zhì)雙層包含選自下組的脂質(zhì)：脂肪酸；溶血脂質(zhì)；鞘脂類；鞘磷脂；糖脂(glycolipid)；糖脂(glucolipid)；鞘糖脂；棕櫚酸；硬脂酸；花生四烯酸；油酸；載有磺化的單糖、二糖、寡糖或多糖的脂質(zhì)；具有醚和酯聯(lián)脂肪酸的脂質(zhì)、聚合的脂質(zhì)、二乙酰磷酸酯、硬脂胺、心磷脂、磷脂、具有不對(duì)稱?；湹暮铣傻牧字?；和具有共價(jià)結(jié)合的聚合物的脂質(zhì)；和
其中，所述脂質(zhì)體包含選自下組的磷脂：磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丙三醇、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸，及其混合物；其中，所述磷脂以與改性劑的共混物形式提供，所述改性劑選自下組：膽固醇、十八胺、硬脂酸、生育酚，及其混合物；并且其中，所述脂質(zhì)體是單層的或多層的；并且
其中，所述脂質(zhì)體包含hspc和膽固醇；并且
其中，所述脂質(zhì)雙層包含hspc和膽固醇；
凍干保護(hù)劑選自下組：蔗糖和海藻糖；
所述表面活性劑選自下組：聚山梨醇酯20和brij20；且
所述藥物是環(huán)丙沙星。
本發(fā)明還包括本文所述的任何應(yīng)用或制劑，其中，脂質(zhì)體包含以1:10-10:1(w/w)的比例存在的多元醇和磷脂酰膽堿富含型磷脂；和/或
其中，脂質(zhì)體包含以1:1-5:1(w/w)的比例存在的多元醇和磷脂酰膽堿富含型磷脂；和/或
其中，所述表面活性劑存在的量是0.01％-1％；和/或
其中，所述表面活性劑存在的量是0.05％-0.4％；和/或
其中，所述感染是所述患者肺部中的生物膜上的感染，并且，所述脂質(zhì)體在一段時(shí)間內(nèi)且以有效治療生物膜感染的速率釋放藥物。
本發(fā)明還包括治療患者中的抗生素抗性感染的任何應(yīng)用或方法，包括：
使制劑氣溶膠化，所述制劑包含游離環(huán)丙沙星和包封在脂質(zhì)體中的環(huán)丙沙星；和
將該氣溶膠吸入所述患者的肺，由此，90％或更多的所述脂質(zhì)體在經(jīng)過氣溶膠化之后保持結(jié)構(gòu)完整性，
其中，所述抗生素抗性感染包括生物膜中的微生物或吞噬在巨噬細(xì)胞中的微生物；
其中，所述感染是生物膜中的微生物感染；和/或
其中，所述感染是吞噬在巨噬細(xì)胞中的浮游態(tài)的微生物感染；和/或
其中，所述感染是選自下組的微生物的感染：分枝桿菌、銅綠假單胞菌和土拉弗朗西斯菌；和/或
所述脂質(zhì)體包含冷凍保護(hù)劑和表面活性劑，且平均粒徑為約75nm-約120nm，并且是單層的；和/或
所述脂質(zhì)體以約30比70(加或減10％)的比例包含膽固醇和氫化大豆磷脂酰-膽堿(hspc)-一種半合成的完全氫化的天然大豆卵磷脂衍生物；和/或
所述制劑還包含適于肺部遞送的賦形劑，該賦形劑包含乙酸鈉，和，等張緩沖劑；和/或
90％或更多的所述脂質(zhì)體在氣溶膠化時(shí)保持完整性，并且在接觸肺部組織之后提供0.5％-10％/小時(shí)的環(huán)丙沙星釋放速率；和/或
95％或更多的所述脂質(zhì)體在氣溶膠化時(shí)保持完整性，并且在接觸肺部組織之后，提供1％-8％/小時(shí)的環(huán)丙沙星釋放速率；和/或
所述脂質(zhì)體以29.4比70.6的比例包含膽固醇和氫化大豆磷脂酰-膽堿(hspc)，并且是單層的，并且其中，98％或更多的所述脂質(zhì)體在氣溶膠化時(shí)保持完整性，并且提供2％-6％/小時(shí)的環(huán)丙沙星釋放速率。
本發(fā)明包括本文所述的制劑應(yīng)用或方法，其中：
所述脂質(zhì)體還包含0.1-0.3％的聚山梨醇酯20，和200-400mg/ml的蔗糖；和/或
所述氣溶膠化和吸入在七天或更長(zhǎng)的時(shí)程內(nèi)每天重復(fù)一次；和/或
所述氣溶膠化和吸入在7天-56天的時(shí)程內(nèi)每天重復(fù)一次；和/或
所述制劑包含50mg-500mg的環(huán)丙沙星；和/或
所述制劑包含75mg-300mg的環(huán)丙沙星；和/或
所述制劑是霧化的，且包含150mg的環(huán)丙沙星。
閱讀以下更完整描述的制劑和方法細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的這些和其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征。
附圖的簡(jiǎn)要說明
結(jié)合附圖，本發(fā)明的方面和實(shí)施方式將通過如下詳細(xì)描述來得到最好的理解。需要強(qiáng)調(diào)，按照慣例，附圖的各個(gè)特征不成比例。相反，各種特征的尺寸被任意放大或者縮小以清楚顯示。附圖部分包括如下的附圖：
圖1是供于吸入的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的制造流程圖(hspc/chol-10l批式)。
發(fā)明詳述
在描述本發(fā)明的配制環(huán)丙沙星包封的脂質(zhì)體和遞送所述脂質(zhì)體來預(yù)防和/或治療ntm感染和其它醫(yī)學(xué)病癥的方法，和與所述方法聯(lián)用的裝置和制劑之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述的具體方法、裝置和制劑，因?yàn)?，顯見地，所述方法、裝置和制劑可以變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語的目的僅是描述具體實(shí)施方式，不應(yīng)用來限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
提供數(shù)值范圍時(shí)，也應(yīng)視作具體公開了該范圍的上限和下限之間以下限單位十分之一為間隔的各中間數(shù)值，除非上下文另有明確說明。本發(fā)明還包括設(shè)定范圍內(nèi)任何設(shè)定數(shù)值或中間數(shù)值和該設(shè)定范圍內(nèi)任何其它設(shè)定數(shù)值或中間數(shù)值之間的各較小范圍。所述范圍可獨(dú)立地包含或排除這些較小范圍的上限、下限，本發(fā)明也包括這些較小范圍不包含限值、包含任一或兩個(gè)限值的各范圍，以設(shè)定范圍內(nèi)任何限值的明確排除為準(zhǔn)。設(shè)定范圍包含一個(gè)或兩個(gè)限值時(shí)，本發(fā)明也包括排除所述限值之一個(gè)或兩個(gè)的范圍。
除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。雖然可采用與本文所述類似或等同的任何方法和材料實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用納入本文，與所引用出版物相關(guān)聯(lián)來公開和描述這些方法和/或材料。
應(yīng)注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)含義，除非另有明確說明。因此，例如，提到“一種制劑”則包括多種這樣的制劑，且提到“所述方法”則包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種方法及其等同物等等。
提供本文討論的出版物僅針對(duì)其在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗墓_。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能憑借在先發(fā)明而先于這些出版物。此外，所提供的出版日期可能與實(shí)際公開日期不同，這可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
本文中所用的抗感染劑指：具有抵抗感染，例如細(xì)菌、病毒、真菌、分枝桿菌，或原生動(dòng)物感染的作用的物質(zhì)。
本發(fā)明涵蓋的抗感染劑包括但不限于：喹諾酮(例如萘啶酸、西諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星等)、磺胺類(例如，磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、硫代異噁唑、磺乙酰胺等)、氨基糖甙類(例如，鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、卡那霉素等)、四環(huán)素(例如氯四環(huán)素、氧四環(huán)素、甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素、二甲胺四環(huán)素等)、對(duì)氨基苯甲酸、二氨基嘧啶(例如，甲氧芐氨嘧啶，常與磺胺甲惡唑聯(lián)用、吡嗪酰胺等)、青霉素(例如，青霉素g、青霉素v、氨芐青霉素、阿莫西林、巴氨西林、羧芐青霉素、卡茚西林、羥基噻吩青霉素、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林等)、青霉素酶抗性青霉素(例如，甲氧西林、苯甲異噁唑青霉素、氯灑西林、雙氯青霉素、萘夫西林等)，第一代頭孢菌素(例如，頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢拉啶、先鋒霉素、頭孢匹林、頭孢唑啉等)、第二代頭孢菌素(例如，頭孢克洛、頭孢羥唑、頭孢尼西、頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢呋辛、頭孢呋辛酯、頭孢美唑、頭孢羅齊、氯碳頭孢、頭孢雷特等)、第三代頭孢菌素(例如，頭孢吡肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢克肟、頭孢泊肟、頭孢布坦等)、其它β-內(nèi)酰胺類(例如，亞胺培南、美羅培南、氨曲南、克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(例如，克拉維酸)、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(例如，紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素等)、潔霉素、克林霉素、壯觀霉素、多粘菌素b、多粘菌素(例如，多粘菌素a、b、c、d、e.亞類.1(粘菌素a)，或e.亞類.2、粘菌素b或c等)粘菌素、萬古霉素、桿菌肽、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、卷曲霉素、砜(例如，氨苯砜、阿地砜鈉等)、氯法齊明、薩力多胺，或可被脂質(zhì)包封的任何其它抗細(xì)菌劑?？垢腥緞┛砂拐婢鷦ǘ嘞┛拐婢鷦?例如，兩性霉素b、制真菌素、游霉素等)、氟胞嘧啶、咪唑類(例如，咪康唑、克霉唑、益康唑、酮康唑等)、三唑類(例如，依曲康唑、氟康唑等)、灰黃霉素、特康唑、布康唑環(huán)吡司、環(huán)吡酮胺、鹵普羅近、托萘酯、萘替芳、特比萘芬，或可被脂質(zhì)包封或復(fù)合的任何其它抗真菌劑，及其藥學(xué)上可接受的鹽，及其組合。討論和實(shí)施例主要涉及環(huán)丙沙星，但不意在將本發(fā)明的范圍限于該抗感染劑?？梢允褂盟幬锏慕M合。
生物膜是任何微生物的組，其中，細(xì)胞在某一表面上彼此粘連。這些貼壁細(xì)胞常常包埋在胞外聚合物質(zhì)(eps)的自產(chǎn)基質(zhì)中。生物膜胞外聚合物質(zhì)，其也稱作粘菌(slime)(盡管并不是被稱為粘菌的所有物質(zhì)都是生物膜)，是一種聚合聚集物，其一般包含胞外dna、蛋白質(zhì)和多糖。生物膜可在活體(living)或非活體(non-living)表面上形成，并且可普遍出現(xiàn)于自然環(huán)境、工業(yè)或醫(yī)院設(shè)施上。在生物膜中生長(zhǎng)的微生物細(xì)胞與相同生物體的浮游細(xì)胞(planktoniccell)存在生理學(xué)差異，與之相對(duì)，浮游細(xì)胞是可以在液體介質(zhì)中飄浮或游動(dòng)的單個(gè)細(xì)胞。
已發(fā)現(xiàn)，身體中的許多微生物感染均涉及生物膜，估計(jì)占全部感染的80％。其中可能牽涉生物膜的感染性過程包括一些常見問題，例如尿道感染、導(dǎo)尿管感染、中耳感染、牙菌斑形成、齒齦炎、被覆隱形眼鏡，和較不常見但更致命的過程，例如，心內(nèi)膜炎、囊性纖維化中的感染，和永久留置裝置(例如人工關(guān)節(jié)和心臟瓣膜)中的感染。更近期地，注意到，細(xì)菌的生物膜可能會(huì)損害皮膚創(chuàng)傷的愈合，并且降低感染皮膚創(chuàng)傷的愈合或治療中的局部抗細(xì)菌功效。
本文中所用的“制劑”指：干粉形式或懸浮或溶解于液體中的形式的，脂質(zhì)體-包封的抗感染劑，其中，伴隨任何賦形劑或其它活性成分。
術(shù)語“對(duì)象”、“個(gè)體”、“患者”和“宿主”在本文中可互換使用，并且指任何脊椎動(dòng)物，具體地是任何哺乳動(dòng)物，且最具體地，包括人類對(duì)象、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，和哺乳動(dòng)物寵物。所述對(duì)象可以但不必處于醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，醫(yī)生)的護(hù)理之下。
“穩(wěn)定的”制劑是，在儲(chǔ)存和暴露至相對(duì)高的溫度之后，其中的蛋白質(zhì)或酶基本保持它們的物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性的制劑。用于檢測(cè)肽穩(wěn)定性的多種分析技術(shù)是本領(lǐng)域可獲得的，并且在如下文獻(xiàn)中有綜述：《肽與蛋白質(zhì)藥物遞送》(peptideandproteindrugdelivery)，247-301，vincentlee編，紐約州紐約的馬塞爾·德克爾公司(marceldekker,inc.)出版(1991)，和jones,a.(1993)adv.drugdeliveryrev.10:29-90?？梢栽谒x溫度下儲(chǔ)存所選時(shí)間，以測(cè)定穩(wěn)定性。
可被治療的“哺乳動(dòng)物”是指可被分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，其中包括人、家畜、以及動(dòng)物園動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物或?qū)櫸?，如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。
“紊亂”是，能夠從采用本文所述的方法和組合物的治療受益的狀況。
發(fā)明通述
環(huán)丙沙星是成熟建立且廣泛使用的廣譜氟喹諾酮抗生素，其指示用于治療下呼吸道感染，例如，歸因于銅綠假單胞菌的下呼吸道感染，其在患有囊性纖維化的患者中常見。吸入的抗微生物劑的主要益處在于，它們將抗生素遞送靶向至主要感染區(qū)域，并且避免gi相關(guān)的副作用；然而，藥物的較差溶解性和苦味限制了適用于吸入的制劑的開發(fā)。此外，環(huán)丙沙星的快速組織分布意味著肺部中的較短藥物停留時(shí)間，因此限制了口服或靜脈藥物給予的治療益處。本文所述的脂質(zhì)體-包封的環(huán)丙沙星制劑通過改良的生物藥學(xué)特性和機(jī)理減小了上述限制，并且促進(jìn)了對(duì)于因ntm所致的肺部感染的控制，所述改良的生物藥學(xué)特性和機(jī)理例如，霧化后囊泡大小和包封的保留、改變的藥物pk和生物分布、從運(yùn)載體的持續(xù)藥物釋放、向疾病位置包括胞內(nèi)感染的增強(qiáng)的遞送，由此，提高了胞內(nèi)空間中的藥物濃度。
本發(fā)明不限于治療患有ntm感染的患者。事實(shí)上，許多患者和適應(yīng)癥均可受益于該治療，包括胞內(nèi)感染，且尤其是肺泡巨噬細(xì)胞和/或氣道中的生物膜中的那些感染。然而，其特別有用于抵抗分枝桿菌感染，因?yàn)槠溆行绱嬖谟谏锬ぶ械膹?fù)制性和非復(fù)制性細(xì)菌。如mcnabe等(2012)所述，鳥分枝桿菌在抗生素(例如，鏈霉素和四環(huán)素)的存在下形成越來越多的量的生物膜，這刺激了該細(xì)菌中生物膜相關(guān)的基因表達(dá)。一旦形成，生物膜由2種不同細(xì)菌群組成，固著型(更具抗性的表型)，和浮游型(易感表型)。著實(shí)令人吃驚的是，吸入型脂質(zhì)體環(huán)丙沙星同時(shí)有效殺滅兩種細(xì)菌群，包括更具抗性的固著型。這與未包封的環(huán)丙沙星不同，未包封的環(huán)丙沙星的功效弱得多。脂質(zhì)體和包封的環(huán)丙沙星針對(duì)ntm的活性的差異可能在體內(nèi)更為顯著，因?yàn)樵跉獾篮头尾恐校窗獾沫h(huán)丙沙星比包封的環(huán)丙沙星消失得快得多。
本發(fā)明的制劑可采用一次性包裝和便攜式、手持式、電池供電裝置，例如aerx裝置(美國專利號(hào)5,823,178，加利福尼亞州海沃德阿拉迪姆)給予患者?；蛘?，本發(fā)明的制劑可采用機(jī)械(非電子)裝置施用?？捎糜谶f送所述制劑的其它吸入裝置包括傳統(tǒng)噴射式噴霧器、超聲噴霧器、柔霧吸入器、干粉吸入器(dpi)、定量霧化吸入器(mdi)、壓縮氣溶膠生成器，等系統(tǒng)。顯示游離環(huán)丙沙星與包封的環(huán)丙沙星的比例在霧化后保持恒定；即，在可能會(huì)導(dǎo)致包封的抗生素的一部分的過早釋放的霧化過程中沒有造成對(duì)脂質(zhì)體的損壞。該發(fā)現(xiàn)基于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道(nivenrw和schreierh，1990)而言是預(yù)料之外的，但確保吸入該氣溶膠的動(dòng)物或人類將會(huì)獲得整個(gè)肺中沉積的、游離藥物與包封藥物的可再生比例。
氣溶膠可通過施加壓力使藥物通過膜上的孔來產(chǎn)生，所述孔的大小在約0.25-6微米范圍內(nèi)(美國專利5,823,178)。當(dāng)孔具有該大小時(shí)，通過這些孔逸出以產(chǎn)生氣溶膠的顆粒將具有0.5-12微米范圍內(nèi)的直徑。藥物顆?？梢噪S著意在將所述顆粒保持在該大小范圍內(nèi)的氣流中釋放?？梢酝ㄟ^利用振動(dòng)裝置來促進(jìn)小顆粒的產(chǎn)生，所述振動(dòng)裝置提供約800-約4000千赫范圍內(nèi)的振動(dòng)頻率。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對(duì)參數(shù)進(jìn)行一些調(diào)節(jié)，例如通過其釋放的孔的大小、振動(dòng)頻率、壓強(qiáng)，和基于所述制劑的密度和粘度的其它參數(shù)，但應(yīng)注意，一些實(shí)施方式的目標(biāo)是提供具有約0.5-12微米范圍內(nèi)的直徑的氣溶膠化的顆粒。
所述脂質(zhì)體制劑可以是低粘度液體制劑。所述藥物單獨(dú)或聯(lián)合運(yùn)載體的粘度應(yīng)足夠低，從而該制劑可受壓從開口擠出，以形成氣溶膠，例如，采用20-200psi以形成氣溶膠，其優(yōu)選具有約0.5-12微米范圍內(nèi)的顆粒大小。
在一個(gè)實(shí)施方式中，將低沸點(diǎn)、高揮發(fā)性的推進(jìn)劑與本發(fā)明的脂質(zhì)體和藥學(xué)上可接受的賦形劑相聯(lián)合。所述脂質(zhì)體可以推進(jìn)劑中的干粉形式或懸液形式提供，或者，在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體溶解于推進(jìn)劑中的溶液中。這些制劑均可以容易地包括在容器中，其具有閥作為其唯一開口。因?yàn)樗鐾七M(jìn)劑是高度揮發(fā)性的，即，具有低沸點(diǎn)，該容器的內(nèi)容物將處于壓力之下。
在另一制劑中，包含環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體以其單獨(dú)的干粉形式提供，并且在另一制劑中，包含環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體以溶液制劑形式提供。對(duì)于每次遞送，通過僅允許以相同的吸氣流速和吸氣體積吸入，來直接吸入所述干粉。所述粉末可以在水性溶劑中溶解，以產(chǎn)生溶液，該溶液移動(dòng)通過多孔膜，以產(chǎn)生供于吸入的氣溶膠。允許產(chǎn)生包含環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體的氣溶膠化形式的、可通過肺內(nèi)途徑被吸入或遞送至患者的任何制劑，均可與本發(fā)明聯(lián)用。關(guān)于可與氣溶膠化的遞送裝置聯(lián)用的制劑的具體信息描述于《雷明頓藥物科學(xué)》(remington’spharmaceuticalsciences)，a.r.gennaro編(最新版本)麥克出版公司(mackpublishingcompany)。關(guān)于胰島素制劑，sciarra等(1976)的發(fā)現(xiàn)也有利于參考。當(dāng)采用低沸點(diǎn)推進(jìn)劑時(shí)，該推進(jìn)劑裝在裝置的加壓罐中，并保持在液體狀態(tài)。當(dāng)開動(dòng)閥門時(shí)，推進(jìn)劑被釋放，并且將活性成分連同推進(jìn)劑一起從所述罐推出。推進(jìn)劑在接觸周圍環(huán)境時(shí)將會(huì)“突溢(flash)”，即，所述推進(jìn)劑立即蒸發(fā)。該突溢極快速地發(fā)生，以至于實(shí)際遞送至患者的肺的活性成分是基本純的。
基于上文內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可采用多種不同的治療和給予手段來治療單一患者。因此，已接受所述藥物(例如，靜脈內(nèi)環(huán)丙沙星或抗生素等形式的藥物)的患者可通過吸入本發(fā)明的制劑而受益。一些患者可通過吸入僅接受包含環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體制劑。所述患者可被診斷為患有ntm肺部感染，或具有一些身體狀況的癥狀，該癥狀可通過給予所述患者抗生素(例如，環(huán)丙沙星)而受益。本發(fā)明的制劑還可用于診斷。
患者通常將接受約0.01-10mg的環(huán)丙沙星/kg/天，±20％或±10％的劑量。該劑量通常將通過至少一次，優(yōu)選數(shù)次“氣鼓(puff)”從該氣溶膠裝置給予。每天的總劑量?jī)?yōu)選以每天至少一次給予，但可分成每天2個(gè)或更多個(gè)劑量。一些患者可通過如下方式受益：使所述患者在數(shù)天或數(shù)周的時(shí)程中“攜載”更高劑量的環(huán)丙沙星或者更高給予頻率，隨后給予減小的或維持的劑量。因?yàn)閚tm是難以治療的病癥，希望患者在一段延長(zhǎng)的時(shí)間中接受所述治療。
本發(fā)明包括治療非結(jié)核分枝桿菌的方法，其中，本發(fā)明的制劑通過任何已知給藥途徑(例如，注射、吸入、鼻部給予、口服和靜脈輸注)來給予。盡管優(yōu)選的給予方法是通過吸入，其中，本發(fā)明特別適合用于治療肺中的生物膜形式的感染。本發(fā)明的制劑特別適于根除因多種原因以生物膜形式在肺中形成的感染。首先，本發(fā)明的脂質(zhì)體特別耐受氣溶膠化之后的破裂，其中，90％或更多、95％或更多、98％或更多的脂質(zhì)體保持其結(jié)構(gòu)完整性，由此，在通過噴霧器或移動(dòng)通過多孔膜的孔而經(jīng)氣溶膠化之后，藥物制劑保持裝載于脂質(zhì)體中。在所述制劑到達(dá)肺部組織之后，于相對(duì)較低的ph(例如，6.5或更小、6.0或更小、5.5或更小、5.0或更小)溶解于溶劑運(yùn)載體(其可以是水性運(yùn)載體)中的藥物提供立即釋放且與細(xì)菌接觸。之后，脂質(zhì)體溶解或變得更具透過性，并且提供包封在脂質(zhì)體內(nèi)的制劑的釋放。之后，當(dāng)存在于脂質(zhì)體內(nèi)部時(shí)，納米晶體緩慢溶解。因此，本發(fā)明的制劑可以一天一次為基礎(chǔ)進(jìn)行遞送，并且提供用于藥物(例如，環(huán)丙沙星)在一段較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的控釋。
歸因于多種因素，生物膜難以通過抗生素根除。首先，它們通常被密集的表多糖基質(zhì)環(huán)繞，該基質(zhì)抑制了一些抗生素(包括氨基糖甙類)擴(kuò)散進(jìn)入生物膜。第二，較快速生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞的外層也“保護(hù)”生物膜內(nèi)部的細(xì)胞不接觸抗生素。第三，生物膜內(nèi)部的細(xì)胞缺乏氧氣，從而是生長(zhǎng)緩慢或靜止的，因此本質(zhì)上對(duì)抗生素接觸較不敏感。最后，有證據(jù)顯示，存在頑固得難以殺滅的“持留(persister)”細(xì)胞，并且也可能存在其它未知的抗性機(jī)理。
實(shí)驗(yàn)部分
提供以下實(shí)施例的目的是向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完整地公開和描述如何制備和使用本發(fā)明，這些實(shí)施例不意在限制發(fā)明人認(rèn)為的發(fā)明范圍，也不表示下述實(shí)驗(yàn)是所實(shí)施的僅有的實(shí)驗(yàn)。努力保證所用數(shù)值(如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重量平均分子量，溫度是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例1
包封的環(huán)丙沙星的制備：
將環(huán)丙沙星(50mg/ml)包封進(jìn)入脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體由氫化大豆磷脂酰-膽堿(hspc)(70.6mg/ml)(一種半合成的完全氫化的天然大豆卵磷脂衍生物(spc))，和膽固醇(29.4mg/ml)組成。所述脂質(zhì)組織成脂雙層，其平均粒徑為75-120nm。該無菌懸液懸浮于等張緩沖劑(25mm組氨酸，145mmnacl，ph6.0，300mosm/kg)中，并通過吸入給予。這些脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑包含約1％的未包封的環(huán)丙沙星。
該制造方法包括以下步驟：
1.制備緩沖液。
2.對(duì)脂質(zhì)組分稱重。
3.將脂質(zhì)溶解于溶劑(tbuoh:etoh:dh2o/49:49:2)中。
4.將脂質(zhì)的溶劑溶液與甲胺硫酸鹽緩沖液(10％v/v溶劑)混合，以形成具有30mg/ml脂質(zhì)的包封的甲胺硫酸鹽緩沖液的多層囊泡(mlv)。
5.通過四疊80nm孔大小的聚碳酸酯濾器擠出，以產(chǎn)生大單層囊泡(luv)。進(jìn)行第二擠壓通過以產(chǎn)生平均直徑為約100nm的脂質(zhì)體。
6.超濾，以將脂質(zhì)體濃縮至約55mg/ml總脂質(zhì)。
7.對(duì)10體積的緩沖液(145mmnacl，5mm組氨酸，ph6.0)進(jìn)行滲濾，以去除乙醇，并產(chǎn)生跨膜ph梯度。
8.通過hplc確定脂質(zhì)濃度。
9.使脂質(zhì)體懸液升溫至50℃，并在攪拌下緩慢添加粉末狀環(huán)丙沙星(總脂質(zhì)質(zhì)量的60％)。遞增地添加環(huán)丙沙星(在40分鐘期間，每4分鐘10％的質(zhì)量)，并使產(chǎn)物在50℃孵育20分鐘，然后添加最后的等分以允許載藥過程完成。
10.載有環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體對(duì)3體積的145mmnacl、5mm乙酸鹽，ph4.0進(jìn)行滲濾，以在其中游離環(huán)丙沙星可溶的條件下去除未包封的環(huán)丙沙星。
11.載有環(huán)丙沙星的脂質(zhì)體對(duì)5體積的145mmnacl、25mm組氨酸，ph6.0進(jìn)行滲濾，以去除任何剩余的未包封的環(huán)丙沙星，進(jìn)一步降低殘留的溶劑水平，并用希望的最終產(chǎn)物緩沖液交換外部緩沖液。
12.將制劑超濾至50mg/ml(需要進(jìn)程內(nèi)的檢測(cè))的環(huán)丙沙星濃度。
13.將脂質(zhì)體預(yù)過濾通過0.45/0.2μm濾板，以去除可能會(huì)阻塞無菌級(jí)濾器的微粒。所用的濾器實(shí)際是無菌級(jí)濾器；然而，它們?cè)谂c其用于無菌過濾的應(yīng)用不相容的升高壓強(qiáng)下使用。
14.冗余過濾通過0.2μm的無菌級(jí)濾器。
15.樣品裝瓶與包裝。
整個(gè)制造方案如圖1所示。
實(shí)施例2：
脂質(zhì)體環(huán)丙沙星針對(duì)生物膜中鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌的活性。
脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離環(huán)丙沙星的制備：制備10mm乙酸鈉中濃度為20mg/ml的未包封的或“游離的”環(huán)丙沙星溶液(ph3.2)。根據(jù)實(shí)施例1，以25mm組氨酸、145mmnacl，ph6.0中50mg/ml環(huán)丙沙星制備脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星制劑。
感染模型描述：96孔板上持續(xù)4天，在鳥分枝桿菌和膿腫分枝桿菌生物膜模型中評(píng)價(jià)包含游離環(huán)丙沙星和脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星的制劑，以及空脂質(zhì)體對(duì)照和緩沖液對(duì)照。
劑量范圍研究的設(shè)計(jì)：在三種模型中評(píng)估一種濃度的游離的或脂質(zhì)體環(huán)丙沙星(50或100mcg/ml)、空脂質(zhì)體(作為對(duì)照)，或僅緩沖液(作為陰性對(duì)照)。報(bào)告初始時(shí)和之后的第4天的定殖。
結(jié)果：表1顯示各組的定殖。發(fā)現(xiàn)，采用脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的治療在這些模型中的每一種中均提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果，而單獨(dú)的環(huán)丙沙星不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果。
表1：生物膜定殖
結(jié)論：僅脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑顯示殺滅生物膜中的分枝桿菌。這是前所未有的，因?yàn)槠渌股兀ㄆ渌|(zhì)體抗生素制劑，均未顯示減少分枝桿菌感染的生物膜模型中的細(xì)菌數(shù)量(即，殺死)的能力。難以殺滅固著的細(xì)菌，例如，在生物膜中發(fā)現(xiàn)的那些，很可能歸因于多種因素，由于分枝桿菌生物膜基質(zhì)的物理保護(hù)，以及對(duì)于環(huán)境脅迫(包括抗生素(islam等))的表型耐受。因此，分枝桿菌生物膜感染的治療極難(islam等)。因此，表1所示的結(jié)果是令人吃驚的，因?yàn)檫@些脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑提供了顯著且有效的對(duì)于靜止或固著細(xì)菌的殺滅。這是用于治療ntm感染的必要元素，其通常包含復(fù)制性和非復(fù)制性(固著的)細(xì)菌。islam等還表示，多種分枝桿菌菌種，絕大多數(shù)是鳥分枝桿菌，已顯示在環(huán)境(即，生物膜)以及臨床設(shè)施中以多細(xì)胞群落存在。處于其自然生境中的這些分枝桿菌群落的普遍性可通過如下證據(jù)被進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到：在不含去污劑的體外培養(yǎng)物中常規(guī)地觀察到分枝桿菌的聚集物和菌膜，這表示遺傳學(xué)上程式化地發(fā)展出了有序的、藥物耐受的群落，即生物膜的關(guān)鍵特征。
實(shí)施例3
脂質(zhì)體環(huán)丙沙星針對(duì)巨噬細(xì)胞中鳥分枝桿菌的活性。
脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離環(huán)丙沙星的制備：制備10mm乙酸鈉中濃度為20mg/ml的未包封的或“游離的”環(huán)丙沙星溶液(ph3.2)。根據(jù)實(shí)施例1，以25mm組氨酸、145mmnacl，ph6.0中50mg/ml環(huán)丙沙星制備脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星制劑。將樣品在thp-1人類巨噬細(xì)胞模型中稀釋至合適濃度。
感染模型描述：在thp-1人類巨噬細(xì)胞中的鳥分枝桿菌細(xì)菌菌株中評(píng)價(jià)包含游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星、包含環(huán)丙沙星納米晶體的脂質(zhì)體，以及緩沖液對(duì)照的制劑，并且在4天后檢測(cè)巨噬細(xì)胞中的感染。
研究設(shè)計(jì)：在2種模型中評(píng)價(jià)一種濃度的游離環(huán)丙沙星或脂質(zhì)體環(huán)丙沙星(20mcg/ml)，或僅緩沖液(作為陰性對(duì)照)。報(bào)告初始時(shí)和隨后第4天的細(xì)菌定殖。
結(jié)果：表2顯示各組的定殖。發(fā)現(xiàn)，采用脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的治療在這些巨噬細(xì)胞感染模型中的每一種中均提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果，而單獨(dú)的環(huán)丙沙星不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果。
表2：巨噬細(xì)胞中鳥分枝桿菌的定殖
結(jié)論：兩種脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑針對(duì)鳥分枝桿菌巨噬細(xì)胞感染模型的活性均優(yōu)于游離環(huán)丙沙星。
實(shí)施例4
脂質(zhì)體環(huán)丙沙星針對(duì)巨噬細(xì)胞中的膿腫分枝桿菌的活性。
脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離環(huán)丙沙星的制備：制備10mm乙酸鈉中濃度為20mg/ml的未包封的或“游離的”環(huán)丙沙星溶液(ph3.2)。根據(jù)實(shí)施例1，以25mm組氨酸、145mmnacl，ph6.0中50mg/ml環(huán)丙沙星制備脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星制劑。將樣品在thp-1人類巨噬細(xì)胞模型中稀釋至合適濃度。
感染模型描述：在thp-1人類巨噬細(xì)胞中的膿腫分枝桿菌細(xì)菌菌株中評(píng)價(jià)包含游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星、空脂質(zhì)體，以及緩沖液對(duì)照的制劑，并且在4天后檢測(cè)巨噬細(xì)胞中的感染。
劑量范圍研究的設(shè)計(jì)：在2種膿腫分枝桿菌模型中評(píng)價(jià)一種濃度的游離環(huán)丙沙星或脂質(zhì)體環(huán)丙沙星(10或20mcg/ml)、空脂質(zhì)體，或僅緩沖液(作為陰性對(duì)照)。報(bào)告初始時(shí)和隨后第4天的細(xì)菌定殖。
結(jié)果：表3顯示各組的定殖。發(fā)現(xiàn)，采用脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的治療在這些巨噬細(xì)胞感染模型中的每一種中均提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果，而單獨(dú)的環(huán)丙沙星不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果。
表3：巨噬細(xì)胞中鳥分枝桿菌的定殖
結(jié)論：脂質(zhì)體環(huán)丙沙星制劑針對(duì)膿腫分枝桿菌巨噬細(xì)胞感染模型的活性優(yōu)于游離環(huán)丙沙星。
實(shí)施例5
脂質(zhì)體環(huán)丙沙星針對(duì)巨噬細(xì)胞中的膿腫分枝桿菌的活性。
脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離環(huán)丙沙星的制備：制備10mm乙酸鈉中濃度為20mg/ml的未包封的或“游離的”環(huán)丙沙星溶液(ph3.2)。根據(jù)實(shí)施例1，以25mm組氨酸、145mmnacl，ph6.0中50mg/ml環(huán)丙沙星制備脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星制劑。將樣品在thp-1人類巨噬細(xì)胞模型中稀釋至合適濃度。
感染模型描述：在thp-1人類巨噬細(xì)胞中的膿腫分枝桿菌細(xì)菌菌株中評(píng)價(jià)包含游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星、空脂質(zhì)體，以及緩沖液對(duì)照的制劑，并且在4天后檢測(cè)巨噬細(xì)胞中的感染。
研究設(shè)計(jì)：在2種膿腫分枝桿菌模型中評(píng)價(jià)一種濃度的游離環(huán)丙沙星或脂質(zhì)體環(huán)丙沙星(200mcg/ml)、空脂質(zhì)體，或僅緩沖液(作為陰性對(duì)照)。報(bào)告初始時(shí)和隨后第4天的細(xì)菌定殖。
結(jié)果：表4顯示各組的定殖。發(fā)現(xiàn)，采用脂質(zhì)體環(huán)丙沙星的治療在這些巨噬細(xì)胞感染模型中的每一種中均提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果，而單獨(dú)的未包封的環(huán)丙沙星不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果。
表4：鳥分枝桿菌或膿腫分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的定殖
結(jié)論：在膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌巨噬細(xì)胞感染模型中，高濃度的脂質(zhì)體環(huán)丙沙星比游離環(huán)丙沙星更有效。
實(shí)施例6
脂質(zhì)體環(huán)丙沙星針對(duì)c57bl/6小鼠中鳥分枝桿菌的活性。
脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離環(huán)丙沙星的制備：制備10mm乙酸鈉，ph3.2中的濃度為20mg/ml環(huán)丙沙星hcl(等同于18mg/ml環(huán)丙沙星)的未包封的或“游離的”環(huán)丙沙星的溶液。根據(jù)實(shí)施例1，以25mm組氨酸，145mmnacl，ph6.0中50mg/ml環(huán)丙沙星hcl(等同于45mg/ml環(huán)丙沙星)制備脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星。游離環(huán)丙沙星和脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星的1:1體積-體積混合物(其中環(huán)丙沙星hcl濃度為35mg/ml)的“pulmaquin”(用于吸入的雙重釋放環(huán)丙沙星，drcfi)的制劑。樣品稀釋至合適濃度用于對(duì)小鼠給藥。因此，pulmaquin包含約35mg/ml的環(huán)丙沙星hcl，其中25mg/ml是包封的形式，且10mg/ml是未包封的或游離形式。這等同于31.5mg/ml環(huán)丙沙星，其中22.5mg/ml是包封的環(huán)丙沙星且9mg/ml是未包封的或游離環(huán)丙沙星。pulmaquin的ph在4和5之間，介于未包封藥物的ph3.2和包封藥物的ph6.0之間。
感染模型描述：在通過鼻內(nèi)滴注鳥分枝桿菌候米瑟氏亞種(subsphominissuis)(mah)mac104菌株(劑量107)感染的c57bl/6小鼠中評(píng)價(jià)包含游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星、pulmaquin，以及空脂質(zhì)體和鹽水對(duì)照的制劑，并且允許感染發(fā)展1周。
研究設(shè)計(jì)：感染后一周，通過鼻內(nèi)滴注鹽水、空脂質(zhì)體對(duì)照、游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星，或pulmaquin來起始治療，每日環(huán)丙沙星劑量為0.33、0.66和1mg/kg，持續(xù)3周。對(duì)于空脂質(zhì)體對(duì)照，空脂質(zhì)體的劑量與1mg/kg劑量的脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星的脂質(zhì)含量相匹配。收獲小鼠，并將肺和脾置于7h10瓊脂上，用于對(duì)肺中的細(xì)菌載量進(jìn)行定量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中采用十只小鼠。
結(jié)果：表5顯示肺和脾的細(xì)菌載量(集落形成單位，cfu)。相較于鹽水對(duì)照，盡管空脂質(zhì)體和游離環(huán)丙沙星對(duì)于小鼠肺中mah的生長(zhǎng)沒有產(chǎn)生顯著效果，給予1mg/kg的脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或pulmaquin分別與從(1.06±0.5)×107到(2.25±0.4)×106(-79％)和(2.47±0.6)×106(-77％)的cfu的顯著減少相關(guān)聯(lián)(兩者對(duì)比鹽水或空脂質(zhì)體，p<0.05)。采用0.33mg/kg和0.67mg/kg脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或pulmaquin的治療也導(dǎo)致肺中的顯著cfu減少(-37～-67％)。
表5：mah感染的小鼠中的肺和脾中的細(xì)菌載量(cfu)
*相比鹽水/空，p<0.05
**相比游離環(huán)丙沙星，
p<0.05
結(jié)論：mah肺部感染的小鼠的采用脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或pulmaquin的三周鼻內(nèi)治療導(dǎo)致肺中mah載量的顯著減少。
實(shí)施例7
脂質(zhì)體環(huán)丙沙星針對(duì)小鼠中膿腫分枝桿菌的活性。
脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星和游離環(huán)丙沙星的制備：制備10mm乙酸鈉，ph3.2中的濃度為20mg/ml(等同于18mg/ml環(huán)丙沙星)的未包封的或“游離的”環(huán)丙沙星hcl的溶液。根據(jù)實(shí)施例1，以25mm組氨酸，145mmnacl，ph6.0中50mg/ml環(huán)丙沙星hcl(等同于45mg/ml環(huán)丙沙星)制備脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星。游離環(huán)丙沙星和脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星的1:1體積-體積混合物(其中環(huán)丙沙星hcl濃度為35mg/ml，等同于31.5mg/ml環(huán)丙沙星)的“pulmaquin”(用于吸入的雙重釋放環(huán)丙沙星，drcfi)的制劑。樣品稀釋至合適濃度用于對(duì)小鼠給藥。
感染模型描述：在通過鼻內(nèi)滴注膿腫分枝桿菌(mycobacteriumabscessus)菌株ma26(劑量為(5.4±0.3)×107，其為來自國立衛(wèi)生研究院的患者的臨床分離物，處于50μl緩沖液(漢克平衡鹽溶液)中)感染的c57bl/6j-lysbg-j/j小鼠中評(píng)價(jià)包含游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星、pulmaquin，以及空脂質(zhì)體和鹽水對(duì)照的制劑，并且允許感染發(fā)展一周。
研究設(shè)計(jì)：感染后一周，通過鼻內(nèi)滴注鹽水、空脂質(zhì)體對(duì)照、游離環(huán)丙沙星、脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星，或pulmaquin來起始治療，每日環(huán)丙沙星劑量為1mg/kg，持續(xù)3或6周。對(duì)于空脂質(zhì)體對(duì)照，空脂質(zhì)體的劑量與1mg/kg劑量的脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星的脂質(zhì)含量相匹配。收獲小鼠，并將肺和脾置于7h10瓊脂上，用于對(duì)肺中的細(xì)菌載量進(jìn)行定量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中采用十只小鼠。
結(jié)果：表6顯示肺和脾的細(xì)菌載量(集落形成單位，cfu)。相較于未治療的對(duì)照，盡管空脂質(zhì)體和游離環(huán)丙沙星對(duì)于小鼠肺中的膿腫分枝桿菌生長(zhǎng)無顯著作用，給予脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或pulmaquin持續(xù)6周分別與6周時(shí)從未治療(5.4±0.6)×105到(1.4±0.5)×103(-99.7％)和(3.0±0.4)×103(-99.4％)的cfu的顯著減少相關(guān)聯(lián)(兩者對(duì)比未治療的對(duì)照，p<0.05)。采用脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或pulmaquin治療3周也分別與6周時(shí)從未治療(5.4±0.6)×105到(2.6±0.6)×104(-95.2％)和(2.1±0.4)×104(-96.1％)的cfu的顯著減少相關(guān)聯(lián)(兩者對(duì)比未治療的對(duì)照p<0.05)。
表6：膿腫分枝桿菌感染的小鼠的肺和脾中的細(xì)菌載量(cfu)
(*)相比對(duì)照，p<0.05
結(jié)論：膿腫分枝桿菌肺部感染的小鼠的采用脂質(zhì)體包封的環(huán)丙沙星或pulmaquin的三或六周鼻內(nèi)治療導(dǎo)致肺中細(xì)菌載量的顯著減少。
參考文獻(xiàn)
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