根據(jù)35USC 119(e)，本申請要求2014年2月28提交的美國臨時(shí)專利申請第61/946,677號(hào)(出于所有目的其通過引用整體并入本文)的權(quán)益。

背景技術(shù)：

人C1抑制劑(C1INH)，也稱為C1酯酶抑制劑，是絲氨酸蛋白酶抑制劑超級(jí)家族的一種物質(zhì)。美國專利號(hào)7,067,713公開了在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的奶中制備重組C1抑制劑(rhC1INH)。該專利還指出，C1抑制劑(或其重組制劑)可用于治療患有HAE的患者或需要免疫抑制的患者。

HAE是罕見的潛在威脅生命的疾病，被認(rèn)為是常染色體顯性遺傳疾病。C1酯酶抑制劑缺乏的遺傳性血管性水腫的特征在于組織腫脹反復(fù)發(fā)作。例如，HAE發(fā)作可以表現(xiàn)為面部、外周、咽/喉、胃腸(GI)道/腹部或泌尿生殖系統(tǒng)腫脹的反復(fù)發(fā)作。患有HAE發(fā)作的患者也患有嚴(yán)重的疼痛、殘疾、腹脹、惡心等，可能需要住院或經(jīng)歷學(xué)校、工作和社交以及睡眠中斷。急性發(fā)作不可預(yù)料，經(jīng)常在沒有明顯觸發(fā)時(shí)發(fā)生。本領(lǐng)域需要緩解患有急性HAE發(fā)作的患者的癥狀的方法。

發(fā)明簡述

本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)用于治療人類患者的HAE急性發(fā)作的新方法。本文所述的方法和給藥方案對(duì)于患有HAE的患者的存活是有利的，在一些情況下是關(guān)鍵的?？梢詮脑摻o藥方案受益的患者群包括但不限于：患有威脅生命的HAE癥狀的個(gè)體、重組C1抑制劑第一劑量后4小時(shí)HAE發(fā)作癥狀沒有緩解的患者、和重組C1抑制劑第一劑量后僅經(jīng)歷有限緩解(VAS得分降低少于20mm)的患者。

本文所述的一個(gè)方面是用于治療患者中遺傳性血管性水腫(HAE)的急性發(fā)作的方法。該方法包括以50IU/kg患者體重向患者靜脈施用第一劑量的重組C1酯酶抑制劑，然后在施用第一劑量后，以50IU/kg患者體重向患者靜脈施用第二劑量的重組C1酯酶抑制劑，從而治療患者的HAE的急性發(fā)作。

在一些實(shí)施方案中，第一劑量在患者的HAE發(fā)作開始后5小時(shí)內(nèi)施用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二劑量在第一劑量后至少4小時(shí)施用。還在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第一劑量和第二劑量在24小時(shí)期間內(nèi)施用。還在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，24小時(shí)期間內(nèi)施用不超過兩次劑量。

在一些實(shí)施方案中，在具有多個(gè)HAE發(fā)作部位的患者中施行該方法。發(fā)作部位可以是外周、腹部、面部、咽部和/或喉部。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，HAE發(fā)作在患者中表現(xiàn)為威脅生命的癥狀的形式。還在進(jìn)一步實(shí)施方案中，發(fā)作的嚴(yán)重度在100mm的視覺模擬量表(VAS)上為至少50mm。

在一些實(shí)施方案中，在從第一劑量起4小時(shí)內(nèi)癥狀開始緩解，且在第二劑量前的緩解程度為VAS得分的降低少于20mm的患者中施行該方法。在一些情況下，VAS得分的降低可以基于兩個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)測量。

在一些實(shí)施方案中，在第一劑量后且在施用第二劑量前HAE發(fā)作癥狀持續(xù)的患者中施行該方法。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的重組C1抑制劑的氨基酸序列與源自人血漿的C1酯酶抑制劑的氨基酸序列相同，且具有與源自人血漿的C1酯酶抑制劑相比修飾的碳水化合物結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，重組C1抑制劑從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶純化。還在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，重組C1抑制劑是rhC1INH。

在本文所述的任何實(shí)施方案中，重組C1酯酶抑制劑的第一和第二劑量可以由患者自己施用。

本文提供的另一個(gè)方面是用于治療HAE的方法，其中所述方法涉及施用含有C1抑制劑的組合物，其中在4小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)癥狀的明顯緩解。本文所述的另一個(gè)方面是用于治療患有急性HAE發(fā)作的患者的方法，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中在12小時(shí)內(nèi)，或優(yōu)選24小時(shí)內(nèi)，或更優(yōu)選48小時(shí)內(nèi)，或進(jìn)一步優(yōu)選72小時(shí)內(nèi)，該治療明顯緩解患者的急性HAE發(fā)作的癥狀并且癥狀沒有復(fù)發(fā)。此外，優(yōu)選在12小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選24小時(shí)內(nèi)，或更優(yōu)選48小時(shí)內(nèi)，或進(jìn)一步優(yōu)選72小時(shí)內(nèi)沒有新的急性HAE發(fā)作。

本文所述的另一個(gè)方面是用于治療患有HAE的患者的方法，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中該治療提供HAE癥狀的明顯緩解，但患者的D-二聚體水平?jīng)]有明顯升高。更優(yōu)選地，D-二聚體水平從施用C1抑制劑組合物起至少7天的時(shí)期內(nèi)沒有明顯升高。

進(jìn)一步的實(shí)施方案是用于治療患有HAE的患者的方法，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中該治療提供HAE癥狀的明顯緩解，但血栓栓塞事件的風(fēng)險(xiǎn)沒有明顯增加。該治療優(yōu)選不明顯增加深靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于以上各實(shí)施方案，可以在一個(gè)或多個(gè)粘膜下或皮下的發(fā)作部位向患者施用C1抑制劑組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，C1抑制劑是重組C1抑制劑，例如rhC1INH。在以上各方面，組合物以單次劑量或多次劑量，優(yōu)選以單次劑量施用。組合物以25-100IU/kg，更優(yōu)選以約50IU/kg，且最優(yōu)選以約50IU/kg的劑量施用。

在以上實(shí)施方案中，優(yōu)選施用C1抑制劑組合物以提供HAE癥狀的緩解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，那些癥狀之一是由HAE引起的組織腫脹。可以向患有HAE或急性HAE發(fā)作的患者施用C1抑制劑組合物。以下描述其他方面和實(shí)施方案。

附圖描述

圖1是餅圖，顯示根據(jù)向?qū)嵤├?研究募集的患者施用的rhC1INH劑量次數(shù)(單次劑量vs兩次劑量)的HAE發(fā)作的分解。向93％的發(fā)作施用rhC1INH單次劑量，向7％的發(fā)作施用rhC1INH兩次劑量。

圖2是描述實(shí)施例1所述的研究中用rhC1INH治療的患者的反應(yīng)和再發(fā)率的圖表。對(duì)于這些研究，反應(yīng)定義為4小時(shí)內(nèi)持續(xù)的癥狀開始緩解。持續(xù)是指緩解程度，其中獲得VAS得分的降低大于或等于20mm。

圖3是描述實(shí)施例1所述的rhC1INH治療后3天內(nèi)發(fā)作癥狀復(fù)發(fā)或出現(xiàn)新的發(fā)作癥狀的數(shù)量的圖表。

圖4是描述基線中值D-二聚體濃度(其對(duì)于實(shí)施例2所述的HAE患者從正常水平升高)的圖表。

圖5是描述與正常D-二聚體濃度水平相比，安慰劑vs rhC1INH的患者(實(shí)施例2)隨時(shí)間的中值D-二聚體濃度變化的圖表。

圖6是描述與正常D-二聚體濃度水平相比，具有粘膜下或皮下發(fā)作部位的安慰劑患者(實(shí)施例2)的中值D-二聚體濃度的圖表。

圖7是描述與正常D-二聚體濃度水平相比，具有粘膜下或皮下發(fā)作部位的rhC1INH患者(實(shí)施例2)的中值D-二聚體濃度的圖表。

圖8是描述與正常D-二聚體濃度水平相比，具有多個(gè)vs單個(gè)發(fā)作部位(實(shí)施例2)的患者的D-二聚體濃度的圖表。

圖9是描述施用了rhC1INH vs安慰劑的患者(實(shí)施例2)的D-二聚體濃度的圖表。

發(fā)明詳述

C1酯酶抑制劑(C1INH)缺乏的遺傳性血管性水腫的特征在于組織腫脹反復(fù)發(fā)作。重組人C1INH(rhC1INH)能有效改善HAE患者的血管性水腫癥狀。該治療在至少12小時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)、48小時(shí)內(nèi)或72小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致高反應(yīng)率且無再發(fā)。該治療在4小時(shí)內(nèi)提供明顯緩解或開始緩解。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，單次劑量的rhC1INH在治療急性HAE發(fā)作中提供持續(xù)和持久的反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括向患者施用第一劑量，且在第一劑量后施用第二劑量的重組C1抑制劑，每次劑量為50IU/kg患者體重。在本文所述的方法中，用本文所述的重組C1抑制劑治療不會(huì)造成副作用或出現(xiàn)副作用的風(fēng)險(xiǎn)，例如升高的D-二聚體水平、血栓栓塞事件或深靜脈血栓形成。

本文所述的一個(gè)方面是用于治療患有遺傳性血管性水腫(HAE)的患者，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中在4小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)癥狀的明顯緩解。本文所述的另一個(gè)方面是用于治療患有急性HAE發(fā)作的患者的方法，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中在12小時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)、48小時(shí)內(nèi)或72小時(shí)內(nèi)，該治療明顯緩解患者的急性HAE發(fā)作的癥狀并且癥狀基本上沒有復(fù)發(fā)。此外，優(yōu)選在24小時(shí)內(nèi)、24小時(shí)內(nèi)、48小時(shí)內(nèi)或72小時(shí)內(nèi)沒有新的急性HAE發(fā)作。

本文所述的另一個(gè)方面是用于治療患有HAE的患者的方法，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中該治療提供HAE癥狀的明顯緩解，但患者的D-二聚體水平?jīng)]有明顯升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，D-二聚體水平從施用C1抑制劑組合物起至少7天的時(shí)期內(nèi)沒有明顯升高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者的D-二聚體水平從治療時(shí)間開始至治療后至少7天保持低于4000ug/L、低于3000ug/L、低于2500ug/L。

本文所述的進(jìn)一步方面是用于治療患有HAE的患者的方法，包括向患者施用含有C1抑制劑的組合物，其中該治療提供HAE癥狀的明顯緩解，但血栓栓塞事件的風(fēng)險(xiǎn)沒有明顯增加。該治療進(jìn)一步不明顯增加深靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于以上各實(shí)施方案，可以在一個(gè)或多個(gè)粘膜下或皮下的發(fā)作部位向患者施用C1抑制劑組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，C1抑制劑是rhC1INH。在本文所述的以上各方面，組合物以單次劑量或多次劑量，優(yōu)選以單次劑量施用。組合物以25-100IU/kg，更優(yōu)選以約50IU/kg，或以50IU/kg的劑量施用。劑量優(yōu)選靜脈施用。

在以上實(shí)施方案中，優(yōu)選施用C1抑制劑組合物以提供HAE發(fā)作癥狀的緩解，例如誘導(dǎo)由HAE造成的組織腫脹明顯減少。

C1抑制劑基因

表明C1抑制劑的cDNA序列編碼500個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其包括22個(gè)氨基酸信號(hào)序列(Bock等1986,Biochem.25:4292-4301)。C1抑制劑的整個(gè)人基因組序列是已知的，表明該基因包含7個(gè)內(nèi)含子(Carter P.等1988,Eur.J.Biochem.173:163)。本發(fā)明包括表達(dá)本文所述的任何原型序列的等位、同源和誘導(dǎo)變體的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。這種變體通常在氨基酸水平與已知的C1抑制劑基因顯示大量的序列同一性。這種變體通常在嚴(yán)格條件下與已知基因雜交，或與有已知基因之一編碼的抗體或多肽交叉反應(yīng)。基因組和cDNA序列的其他實(shí)例可從GenBank獲得。如果需要C1抑制劑基因的其他克隆序列，可以用已知的C1抑制劑序列從基因組或cDNA文庫(優(yōu)選人)獲得。

轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因以在攜帶該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳腺靶向表達(dá)重組C1抑制劑?；痉椒ㄐ枰獙⒕幋a蛋白的外源DNA片段與信號(hào)序列和有效促進(jìn)該外源DNA片段表達(dá)的調(diào)控序列可操作連接。通常，該調(diào)控序列包括啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。DNA片段可以是基因組、小基因(刪除一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的基因組)、cDNA、YAC片段、兩個(gè)不同C1抑制劑基因的嵌合、或任何這些的雜合體。包括基因組序列一般導(dǎo)致更高的表達(dá)水平。

在基因組構(gòu)建體中，不需要保留所有的內(nèi)含子序列。例如，可以去除一些內(nèi)含子序列以獲得更小的轉(zhuǎn)基因，促進(jìn)DNA操作和隨后的微注射。參見Archibald等,WO 90/05188(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。去除某些內(nèi)含子在一些情況下也有助于增強(qiáng)表達(dá)水平。去除一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子以降低表達(dá)水平從而確保翻譯后修飾基本上完整也是需要的。還可能刪除一些或全部非編碼的外顯子。在一些轉(zhuǎn)基因中，突變C1抑制劑編碼序列中的選擇核苷酸以去除蛋白水解的切割位點(diǎn)。因?yàn)橥ㄟ^轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的C1抑制劑通常意欲用于向人施用，獲得編碼C1抑制劑序列的DNA片段的物種優(yōu)選人類。類似的，如果意欲用途是獸醫(yī)治療(例如對(duì)馬、狗或貓)，優(yōu)選DNA片段來自相同物種。調(diào)控序列例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來自唯一或至少優(yōu)選在乳腺中表達(dá)的基因(即乳腺特異性基因)。作為啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來源的優(yōu)選基因包括β-酪蛋白、κ-酪蛋白、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸蛋白和α-乳清蛋白。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子一般但不總是來自相同的乳腺特異性基因。優(yōu)選該基因來自與待表達(dá)轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物相同的哺乳動(dòng)物物種。也可以使用來自其他物種的表達(dá)調(diào)控序列，例如來自人基因的那些。信號(hào)序列必須能夠?qū)駽1抑制劑從乳腺的分泌。合適的信號(hào)序列可以來自編碼分泌蛋白的哺乳動(dòng)物基因。C1抑制劑的天然信號(hào)序列是合適的。除這些信號(hào)序列之外，信號(hào)序列的優(yōu)選來源是來自與獲得啟動(dòng)子和增強(qiáng)子相同基因的信號(hào)序列。任選地，在轉(zhuǎn)基因中包括其他調(diào)控序列以優(yōu)化表達(dá)水平。這種序列包括5’側(cè)翼區(qū)、5’轉(zhuǎn)錄但非翻譯區(qū)、內(nèi)含子序列、3’轉(zhuǎn)錄但非翻譯區(qū)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)和3’側(cè)翼區(qū)。通常從獲得啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的乳腺特異性基因或從表達(dá)C1抑制劑基因獲得這種序列。包括這種序列產(chǎn)生模擬真實(shí)乳腺特異性基因和/或真實(shí)C1抑制劑基因的遺傳環(huán)境。在一些情況下(例如牛αS1-酪蛋白)，這種遺傳環(huán)境導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄基因的更高表達(dá)?；蛘?，從其他異源基因，例如β-珠蛋白或病毒基因獲得3’側(cè)翼區(qū)和非翻譯區(qū)。包括來自C1抑制劑基因的3’和5’非翻譯區(qū)或其他異源基因也可以增加轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方案中，來自乳腺特異性基因的約0.5、1、5、10、15、20或30kb的5’側(cè)翼區(qū)與來自表達(dá)的C1抑制劑基因的約1、5、10、15、20或30kb的3’側(cè)翼區(qū)組合。如果從cDNA序列表達(dá)蛋白，在啟動(dòng)子和編碼序列之間包括內(nèi)含子序列是有利的。內(nèi)含子序列優(yōu)選是由以下形成的雜合序列：獲得啟動(dòng)子的乳腺特異性區(qū)的第一個(gè)內(nèi)含子的插入序列的5’部分和IgG插入序列或C1抑制劑基因的插入序列的3’部分。參見DeBoer等,WO 91/08216(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。用于表達(dá)C1抑制劑cDNA的另一個(gè)優(yōu)選轉(zhuǎn)基因基于可從Invitrogen(Carlsbad,CA)商購的pBC1表達(dá)載體試劑盒。pBC1載體包含山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子和包括幾個(gè)外顯子和內(nèi)含子的一部分山羊β-酪蛋白基因，以及3’非翻譯序列。將C1抑制劑cDNA插入pBC1特有的Xho插入位點(diǎn)將產(chǎn)生包含C1抑制劑cDNA序列的嵌合RNA，其兩側(cè)是山羊β-酪蛋白外顯子和內(nèi)含子序列。然而，一旦適當(dāng)剪切該嵌合RNA分子，只有C1抑制劑cDNA序列被翻譯。

用于從基因組序列表達(dá)C1抑制劑蛋白的優(yōu)選轉(zhuǎn)基因包含編碼完整編碼序列和信號(hào)肽的基因組C1抑制劑序列、3’UTR和3’側(cè)翼序列，任選連接至包含足以導(dǎo)向C1抑制劑蛋白表達(dá)的調(diào)控序列的5’αSI酪蛋白片段。

在至少一種，經(jīng)常幾種生物中的以上列出的所有乳腺特異性基因的DNA序列信息是可獲得的。參見例如Richards等,J.Biol.Chem.256,526-532(1981)(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等,Nucleic AC1ds Res.12,8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等,J.Biol.Chem.260,7042-7050(1985))(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee&Rosen,J.Biol.Chem.258,10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白))；Hall,Biochem.J.242,735-742(1987)(人α-乳清蛋白)；Stewart,Nucleic AC1ds Res.12,389(1984)(牛as1和K酪蛋白cDNA)；Gorodetsky等,Gene 66,87-96(1988)(牛β-酪蛋白)；Alexander等,Eur.J.Biochem.178,395-401(1988)(牛K酪蛋白)；Brignon等,FEBS Lett.188,48-55(1977)(牛αS2酪蛋白)；Jamieson等,Gene 61,85-90(1987),Ivanov等,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369,425-429(1988),Alexander等,Nucleic AC1ds Res.17,6739(1989)(牛β乳球蛋白)；Vilotte等,Biochimie 69,609-620(1987)(牛α-乳清蛋白)(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。

MerC1er&Vilotte,J.Dairy SC1.76,3079-3098(1993)(出于所有目的其全文通過引用并入本文)綜述了各種奶蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能。如果需要其他序列數(shù)據(jù)，使用已有序列作為探針可以容易地克隆已經(jīng)獲得的區(qū)域的側(cè)翼序列。同樣地，使用已知的同源核苷酸序列或抗體或同源蛋白作為探針從生物篩選文庫獲得不同生物的乳腺特異性調(diào)控序列。

采用αS1酪蛋白調(diào)控序列將重組蛋白的表達(dá)靶向至乳腺的一般策略和示范性轉(zhuǎn)基因更詳細(xì)地描述于DeBoer等,WO 91/08216和WO 93/25567(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。還描述了采用來自其他乳腺特異性基因的調(diào)控序列的轉(zhuǎn)基因的實(shí)例。參見例如Simon等,Bio/Technology 6,179-183(1988)和WO 88/00239(1988)(用于在綿羊中表達(dá)的β乳球蛋白調(diào)控序列)；Rosen,EP 279,582和Lee等,Nucleic AC1ds Res.16,1027-1041(1988)(用于在小鼠中表達(dá)的β-酪蛋白調(diào)控序列)；Gordon,Biotechnology 5,1183(1987)(用于在小鼠中表達(dá)的WAP調(diào)控序列)；WO 88/01648(1988)和Eur.J.Biochem.186,43-48(1989)(用于在小鼠中表達(dá)的α-乳清蛋白調(diào)控序列)(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。

將以上所述的轉(zhuǎn)基因引入非人哺乳動(dòng)物。大多數(shù)非人哺乳動(dòng)物，包括嚙齒類動(dòng)物例如小鼠和大鼠、兔，綿羊類(ovine)例如綿羊(sheep)，山羊類(caprine)例如山羊(goat)，豬類(procine)例如豬(pig)，和牛科例如黃牛和水牛是合適的。牛科的優(yōu)勢是奶產(chǎn)量大，而小鼠的優(yōu)勢是轉(zhuǎn)基因和育種容易。兔提供良好平衡的這些優(yōu)勢。兔每天可以產(chǎn)生100ml蛋白含量為約14％的奶(參見Buhler等,Bio/Technology 8,140(1990))(出于所有目的其全文通過引用并入本文)，還可以用與小鼠相同的原理和相似的設(shè)施操作和育種。一般不采用非胎生哺乳動(dòng)物例如針鼴或鴨嘴獸。

在一些轉(zhuǎn)基因方法中，將轉(zhuǎn)基因引入受精卵的原核。對(duì)于某些動(dòng)物例如小鼠和兔，在體內(nèi)進(jìn)行受精并手術(shù)移除受精卵。在其他的動(dòng)物中尤其是牛，優(yōu)選從活的或屠宰動(dòng)物移除卵并在體外使卵受精。參見DeBoer等,WO 91/08216。體外受精允許將轉(zhuǎn)基因引入對(duì)于整合處于細(xì)胞周期的最佳階段的基本上同步的細(xì)胞(不晚于S階段)。一般通過微注射引入轉(zhuǎn)基因。參見US 4,873,292。然后體外培養(yǎng)受精卵直到獲得包含約16-150個(gè)細(xì)胞的植入前胚胎。胚胎的16-32個(gè)細(xì)胞階段稱為桑椹胚。包含超過32個(gè)細(xì)胞的植入前胚胎稱為囊胚。這些胚胎顯示囊胚腔的發(fā)育，一般在64個(gè)細(xì)胞階段。用于培養(yǎng)受精卵至植入前階段的方法描述于Gordon等,Methods Enzymol.101,414(1984)；Hogan等,Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,C.S.H.L.N.Y.(1986)(小鼠胚胎)；Hammer等,Nature 315,680(1985)(兔和豬胚胎)；Gandolfi等J.Reprod.Fert.81,23-28(1987)；Rexroad等,J.Anim.SC1.66,947-953(1988)(綿羊胚胎)和Eyestone等J.Reprod.Fert.85,715-720(1989)；Camous等,J.Reprod.Fert.72,779-785(1984)；和Heyman等Theriogenology 27,5968(1987)(牛胚胎)(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。有時(shí)，植入前胚胎在植入前冷凍儲(chǔ)存一段時(shí)間。取決于轉(zhuǎn)基因整合時(shí)的發(fā)育階段，將植入前胚胎轉(zhuǎn)移至假懷孕雌性的輸卵管，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因或嵌合動(dòng)物出生。可以育種嵌合哺乳動(dòng)物以形成真正的種系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

或者，可以將轉(zhuǎn)基因引入胚胎干細(xì)胞(ES)。這些細(xì)胞從體外培養(yǎng)的植入前胚胎獲得。Bradley等,Nature 309,255-258(1984)(出于所有目的其全文通過引用并入本文)?？梢酝ㄟ^電穿孔或微注射將轉(zhuǎn)基因引入這種細(xì)胞。ES細(xì)胞適合于通過同源重組將轉(zhuǎn)基因引入特定的染色體位點(diǎn)。例如，可以將編碼C1抑制劑的轉(zhuǎn)基因引入遺傳位點(diǎn)，使得其與乳腺中能夠?qū)蚓幋a序列表達(dá)的內(nèi)源調(diào)控序列可操作連接。將轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞與來自非人動(dòng)物的囊胚組合。ES細(xì)胞在胚胎定植，在一些胚胎中形成或促成所得嵌合動(dòng)物的種系。參見Jaenisch,Science,240,1468-1474(1988)(出于所有目的其全文通過引用并入本文)。或者，可以將ES細(xì)胞用作移植入去核受精卵的細(xì)胞核來源，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過涉及細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的方法產(chǎn)生包含能夠表達(dá)C1抑制劑的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物?？梢圆捎酶鞣N類型的細(xì)胞作為待轉(zhuǎn)移至卵母細(xì)胞的細(xì)胞核供體。在各種分化階段的(從未分化至完全分化)、在各種細(xì)胞周期階段的(例如休眠或增殖細(xì)胞)供體細(xì)胞(例如成人、胎兒或胚胎細(xì)胞)可以從包含C1抑制劑轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的所有組織獲得，且可以從體細(xì)胞或種系組織獲得(參見WO 97/07669,WO 98/30683和WO 98/39416，其全文出于所有目的通過引用并入本文)。

或者，使用傳統(tǒng)方法例如Ca-磷轉(zhuǎn)染、微注射或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染從其中引入了C1抑制劑轉(zhuǎn)基因且隨后選擇或篩選存在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因的特殊整合的體外培養(yǎng)的細(xì)胞獲得供體細(xì)胞核(參見WO 98/37183和WO 98/39416,其全文出于所有目的通過引用并入本文)。通過電誘導(dǎo)或化學(xué)誘導(dǎo)的融合方式(參見WO 97/07669、WO 98/30683和WO98/39416任意之一)，或通過微注射(參見WO99/37143，其全文出于所有目的通過引用并入本文)將供體細(xì)胞核引入卵母細(xì)胞。隨后培養(yǎng)移植的卵母細(xì)胞以發(fā)育成胚胎，然后將胚胎植入假懷孕雌性動(dòng)物的輸卵管，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因后代出生(參見WO 97/07669、WO 98/30683和WO 98/39416任意之一)。

另一種轉(zhuǎn)基因方法使用基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體來引入期望轉(zhuǎn)基因。這種載體的實(shí)例包括Yee等(1994,Meth.Cell.Biol.43:99-112,全文出于所有目的通過引用并入本文)所述的源自水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSG-G)MoMLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(VSV-G假型)。如Chan等(1998,Proc.Natl.Acad.SC1.USA 95:14028-14033,全文出于所有目的通過引用并入本文)所述，用這種VSV-G假型載體感染受精前在第二次減數(shù)分裂中期II停滯的卵母細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代?；蛘?，不產(chǎn)生遺傳修飾的動(dòng)物，而是出于制備藥物蛋白的目的，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染來轉(zhuǎn)化受限的器官，優(yōu)選乳腺。在融合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，將編碼C1抑制劑的序列帶入非人乳腺以感染乳腺上皮細(xì)胞允許在這些動(dòng)物的奶中產(chǎn)生C1抑制蛋白(Archer等,1994,Proc.Natl.Acad.SC1.USA 91:6840-6844,全文出于所有目的通過引用并入本文)。

為了產(chǎn)生包含兩個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以使用與單個(gè)轉(zhuǎn)基因相同的方法同時(shí)引入多個(gè)轉(zhuǎn)基因。或者，開始可以將轉(zhuǎn)基因引入單獨(dú)的動(dòng)物，然后通過育種動(dòng)物組合進(jìn)相同基因組。或者，產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)基因之一的第一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然后將第二個(gè)轉(zhuǎn)基因引入那個(gè)動(dòng)物的受精卵或胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，將長度超過約50kb的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建為重疊片段。將這種重疊片段同時(shí)引入受精卵或胚胎干細(xì)胞，并在體內(nèi)進(jìn)行同源重組。參見Kay等,WO 92/03917(全文出于所有目的通過引用并入本文)。

如上所述，本文所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在其基因組整合至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)細(xì)胞階段引入轉(zhuǎn)基因一般導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其后代基本上所有的種系和體細(xì)胞(可能已經(jīng)經(jīng)歷體細(xì)胞突變的少數(shù)細(xì)胞除外)在其基因組中包含轉(zhuǎn)基因。在較后階段引入轉(zhuǎn)基因?qū)е虑逗象w或嵌合動(dòng)物。然而，可以育種已經(jīng)在其種系中整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因的一些這種動(dòng)物來產(chǎn)生其中基本上所有體細(xì)胞和種系細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因體。乳腺細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)基因通常產(chǎn)生其中轉(zhuǎn)基因僅在乳腺細(xì)胞中存在的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。這種哺乳動(dòng)物不會(huì)將其種系傳遞至后代。

轉(zhuǎn)基因至少主要在乳腺靶向編碼C1抑制劑蛋白的DNA片段的表達(dá)。C1抑制劑可以至少100、500、1000、2000、5000或10,000、20,000或50,000μg/ml的高水平分泌。本文所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物呈現(xiàn)基本上正常的健康。在乳腺之外的組織中C1抑制劑蛋白的次級(jí)表達(dá)出現(xiàn)的程度不足以引起不良反應(yīng)。此外，外源C1抑制劑蛋白以足夠功效從乳腺分泌，堵塞分泌器官的沉淀物不存在問題。

轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以開始產(chǎn)生奶的年齡當(dāng)然隨動(dòng)物的性質(zhì)而變。對(duì)于轉(zhuǎn)基因牛，年齡為約天然的2歲半，或激素刺激6個(gè)月，而對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠，年齡為約9-11周。當(dāng)然，僅物種的雌性成員用于產(chǎn)生奶。然而，轉(zhuǎn)基因雄性對(duì)于育種雌性后代也是有價(jià)值的。可以將來自轉(zhuǎn)基因雄性的精子冷凍儲(chǔ)存以用于隨后的體外受精并產(chǎn)生雌性后代。F.從奶或其他來源回收蛋白轉(zhuǎn)基因的成年雌性哺乳動(dòng)物產(chǎn)生含有高濃度的外源C1抑制劑蛋白的奶。

可通過以下方式從奶純化C1抑制劑：通過離心和去除脂肪使轉(zhuǎn)基因奶脫脂，然后通過高速離心繼之以死端過濾(例如通過使用連續(xù)下降的過濾器尺寸的死端過濾)或交叉流過濾去除酪蛋白，或直接通過交叉過濾去除酪蛋白。如果需要，可以根據(jù)其特有的物理和化學(xué)性質(zhì)從奶純化蛋白質(zhì)(參見Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982))Prograis等,(1985)J.MediC1ne 16(1-3):303-350；Pilatte等,(1989)J.Immunol.Methods 120:37-43,Reboul等,.(1977)Febs Lett.79:45-50,Alsenz等,(1987)J.Immunol.Methods 96:107-1 14,Ishizaki等,(1977)J.Biochem.82:1155-1 160。純化條件應(yīng)當(dāng)優(yōu)選分離人C1抑制劑和非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的內(nèi)源C1抑制劑。

陽離子、陰離子和金屬親和層析全部可以用于從奶或其他來源(例如重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來源)純化人C1抑制劑蛋白。一些方法使用超過一個(gè)的這些步驟，一些方法使用全部三個(gè)步驟。盡管可以以任何順序進(jìn)行這些步驟，優(yōu)選的順序是進(jìn)行陽離子層析，然后陰離子層析，然后金屬離子親和層析。

陽離子層析例如可以使用Sepharose(TM)大珠或羧甲基纖維素進(jìn)行。使用低鹽的上樣緩沖液(例如20mM檸檬酸鈉，0.02M氯化鈉)?？梢栽谳^高鹽濃度(例如20mM檸檬酸鈉，0.2M氯化鈉)洗脫人C1抑制劑。然后將含有人C1抑制劑的洗脫液進(jìn)行陰離子層析。陰離子柱的基質(zhì)可以是例如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或聚苯乙烯的材料。配體例如可以是二乙基氨乙基(DEAE)、聚乙烯亞胺(PEI)或季銨官能團(tuán)。陰離子交換柱的強(qiáng)度是指配體的電離狀態(tài)。強(qiáng)離子交換柱(例如具有季銨配體的那些)永遠(yuǎn)帶有正電荷。在弱陰離子交換柱(例如DEAE和PEI)中，正電荷的存在取決于柱的pH。一般用pH高于人C1抑制劑的pi的低鹽緩沖液上樣陰離子交換柱。在低鹽緩沖液中洗滌柱幾次以洗脫未結(jié)合的蛋白。然后用鹽濃度增加的緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。

Q Sepharose FF是優(yōu)選的陰離子交換柱，因?yàn)樵摬牧吓c其他陰離子交換柱相比相對(duì)便宜且具有適合大規(guī)模純化的相對(duì)較大的珠子尺寸。在特定條件下，可以從Q Sepharose FF洗脫人C1抑制劑，而不洗脫兔奶中發(fā)現(xiàn)的兔C1抑制劑或其他蛋白。為獲得人酸性α-葡萄糖苷酶與Q Sepharose FF的良好結(jié)合，將柱在低鹽(例如少于50mM，如磷酸鈉緩沖液)中預(yù)平衡。緩沖液的pH應(yīng)當(dāng)為約7.0+/-1.0以獲得人C1抑制劑與柱的良好結(jié)合。然后以增加的鹽濃度通過逐步洗脫或梯度洗脫人C1抑制劑。逐步洗脫對(duì)于大規(guī)模純化更易于控制。大多數(shù)加載的人C1抑制劑可以以相對(duì)高的純度在一個(gè)步驟(約0.25M鹽)中從Q FF柱上洗脫。

金屬親和層析用基質(zhì)例如Sepharose和結(jié)合的金屬離子例如銅、鋅、鎳、鈷或鈣來進(jìn)行。也可以使用有機(jī)螯合基團(tuán)例如亞氨基二乙酸。用相對(duì)高濃度(例如高于0.2M)的非螯合鹽(例如氯化鈉)將柱平衡至約6-8的pH。在這些條件下，殘留污染蛋白與柱結(jié)合，而人C1抑制劑不結(jié)合，從而可以容易洗脫。

示例性的純化方法在實(shí)施例部分描述。該方法提供C1抑制劑制劑，其相對(duì)于所有污染物純度為至少98％或99％(w/w)且包含少于0.5％、0.1％或0.05％的兔C1抑制劑(w/w)。額外的純化優(yōu)選用于獲得純度為至少99％，優(yōu)選為至少99.5％，更優(yōu)選99.8％，最優(yōu)選99.9％的C1抑制劑制劑。

藥物組合物

在一些方法中，將從奶或其他來源純化的C1抑制劑以純化形式與藥物載體一起作為藥物組合物施用。優(yōu)選的形式取決于意欲的施用模式和治療應(yīng)用。藥物載體可以是適合將多肽遞送至患者的任何相容的無毒物質(zhì)。無菌水、醇、脂肪、蠟和惰性固體可用作載體。藥物組合物也可以包含藥學(xué)上可接受的佐劑、緩沖劑、分散劑等。藥物組合物中抑制劑的濃度可以差異很大，例如從少于約0.1％重量，一般為至少約1％重量至高達(dá)20％重量或更高。

藥物組合物優(yōu)選通過胃腸外施用，例如通過靜脈、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或通過鞘內(nèi)或顱內(nèi)施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過靜脈輸注施用。用于胃腸外施用的合適制劑是本領(lǐng)域已知的，且一般為液體制劑。

具體實(shí)施方式

應(yīng)理解，下述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為說明的目的，基于其的各種修飾或變化將向本領(lǐng)域技術(shù)人員建議，并包含在本發(fā)明的精神和權(quán)限以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

從兩個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)及其開放標(biāo)簽延伸研究匯集來自用靜脈rhC1INH(50IU/kg)治療的患有實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)診斷HAE的患者(13歲或更大)的數(shù)據(jù)。觀察患者在呈現(xiàn)前少于5小時(shí)的癥狀發(fā)作以及大于或等于50mm(嚴(yán)重)的基線視覺模擬量表(VAS；Reidl MA,Ann Allergy Asthma Immunol 2013,110(4):295-9,其通過引用并入本文)得分。在一個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，患者接受第二rhC1INH劑量作為威脅生命的癥狀的搶救藥物或在第一劑量后4小時(shí)沒有發(fā)生緩解。在另一個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，患者沒有接受第二劑量。在開放標(biāo)簽延伸研究中，允許rhC1INH的第二劑量基于臨床反應(yīng)由研究者決定。

在4個(gè)臨床試驗(yàn)的過程中，由于一次或多次發(fā)作，127位患者接受50IU/kg的rhC1INH。121位患者適合接受rhC1INH的第二劑量。對(duì)于所有解剖部位的所有發(fā)作，結(jié)合反應(yīng)、再發(fā)(relapse)和復(fù)發(fā)(recurrence)數(shù)據(jù)。反應(yīng)定義為治療4小時(shí)內(nèi)的持續(xù)4小時(shí)的緩解(兩個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的VAS得分的降低大于或等于20mm)且在持續(xù)前沒有額外劑量或搶救藥物。測定所有患者在24小時(shí)隨訪數(shù)據(jù)中的再發(fā)，并測定所有患者在3天隨訪數(shù)據(jù)中的復(fù)發(fā)或新的發(fā)作癥狀。

圖1顯示對(duì)于急性HAE發(fā)作施用的rhC1INH劑量的次數(shù)。93％的發(fā)作用單次劑量的rhC1INH治療。7％的發(fā)作用兩次劑量的rhC1INH治療。

圖2顯示在用rhC1INH治療的患者中的反應(yīng)和再發(fā)率。反應(yīng)定義為4小時(shí)內(nèi)持續(xù)的癥狀開始緩解。對(duì)于兩個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)和兩個(gè)開放標(biāo)簽延伸研究中的患者，用rhC1INH治療后沒有血栓或血栓栓塞事件，沒有過敏反應(yīng)，且沒有誘導(dǎo)中和抗體。

圖3顯示rhC1INH治療后3天內(nèi)發(fā)作癥狀復(fù)發(fā)或新的發(fā)作癥狀的次數(shù)。在93％患者中，沒有復(fù)發(fā)或新的發(fā)作癥狀。

基于該研究，以4小時(shí)內(nèi)開始緩解的發(fā)作的次數(shù)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)用rhC1INH治療導(dǎo)致高反應(yīng)率。大多數(shù)在4小時(shí)內(nèi)開始緩解的發(fā)作用單次rhC1INH劑量有效治療。一些發(fā)作需要第二次rhC1INH劑量。對(duì)于4小時(shí)內(nèi)緩解的發(fā)作，24小時(shí)內(nèi)沒有發(fā)生明顯的再發(fā)。rhC1INH治療3天內(nèi)再發(fā)或新的發(fā)作癥狀的發(fā)生率較低。此外，在治療急性HAE發(fā)作中，單次劑量的rhC1INH提供持續(xù)和持久的反應(yīng)。

實(shí)施例2

已經(jīng)報(bào)道血栓栓塞事件(TEE)具有一些源自血漿的C1INH，但不具有重組的人C1INH(rhC1INH，超過1000次施用)。該研究評(píng)估對(duì)于急性HAE發(fā)作rhC1INH的安全性和功效，包括監(jiān)測TEE并分析D-二聚體纖維蛋白降解產(chǎn)物(D-二聚體水平)和深靜脈血栓形成(DVT)風(fēng)險(xiǎn)。

74位患有急性HAE發(fā)作的患者隨機(jī)分為3:2，并接受50IU/kg rhC1INH或安慰劑。在輸注期間，在研究之前、之后2小時(shí)和第7天分析D-二聚體水平(以平均25^th-75^th四分位表示)。使用威爾斯預(yù)測規(guī)則分析DVT風(fēng)險(xiǎn)。Wells PS,等Thromb.Haemost.2000:83:416-20。在靜脈注射研究藥物后2小時(shí)和第7天(發(fā)作消除后)，通過在基線收集的血液樣品(即，從發(fā)作起少于5小時(shí)并在研究用藥之前)評(píng)估D-二聚體水平。認(rèn)為小于或等于250μg/L的值正常(即參考標(biāo)準(zhǔn))。

患者和研究設(shè)計(jì)：這是隨機(jī)、雙盲、安慰劑(鹽水)對(duì)照、多中心、多國研究，用來評(píng)估對(duì)于治療患有HAE的患者的急性血管性水腫發(fā)作，rhC1INH與鹽水相比的功效和安全性?；加袑?shí)驗(yàn)室確認(rèn)診斷HAE的75位患者(年齡≥13歲；美國和加拿大之外的≥18歲)隨機(jī)集中(3:2)以接受用于治療適合的血管性水腫發(fā)作的rhC1INH(對(duì)于<84kg的患者50IU/kg,或?qū)τ凇?4kg的患者4200IU)或鹽水的雙盲靜脈注射。如果(i)他們的發(fā)作部位是外周(四肢)、腹部、面部和/或咽部-喉部；(ii)這些發(fā)作的發(fā)生在去診所之前少于5小時(shí)；和(iii)患者評(píng)分的發(fā)作總體嚴(yán)重度在100mm的視覺模擬量表(VAS)上為至少50mm，患者適合治療(Reidl MA,Ann Allergy Asthma Immunol2013,110(4):295-9)，其通過引用并入本文)。對(duì)于患有多個(gè)適合發(fā)作部位的患者，主要發(fā)作部位被定義為在基線具有最高VAS得分的部位。

血栓風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：臨床監(jiān)測所有隨機(jī)患者的血栓事件。通過使用威爾斯預(yù)測規(guī)則(Wells PS,等Thromb.Haemost.2000:83:416-20)評(píng)估深靜脈血栓形成(DVT)風(fēng)險(xiǎn)。要求給藥后得分升高的患者進(jìn)行下肢超聲檢查以排除DVT。對(duì)于血栓事件的可能發(fā)展，評(píng)估患者輸注后D-二聚體水平的升高(包括超聲檢查，如果臨床指示)。

血漿樣品收集：為了測定D-二聚體水平，在靜脈注射研究藥物后2小時(shí)和第7天(發(fā)作消除后)，在基線收集檸檬酸血液樣品(即，從發(fā)作起少于5小時(shí)并在靜脈注射研究藥物之前)。對(duì)于所有分析，對(duì)于接受搶救藥物后的任何評(píng)估，將接受rhC1INH作為搶救藥物的隨機(jī)化以接受鹽水溶液的患者從鹽水溶液處理組換成rhC1INH治療組。

D-二聚體測量：在中心實(shí)驗(yàn)室測量血漿中的D-二聚體水平(正常范圍<540μg/L)。

患者人口特征：募集顯示患有合適急性HAE發(fā)作的75位患者接受研究藥物：44位隨機(jī)接受50IU/kg rhC1INH，31位隨機(jī)接受鹽水；1位隨機(jī)化以接受rhC1INH治療的患者沒有被治療且不包括在分析中。

表1的治療組總結(jié)了患者的安排、關(guān)鍵人口特征和HAE發(fā)作頻率以及合適發(fā)作的嚴(yán)重度。治療組之間的患者人口特征和基線特征總體上相似。兩個(gè)組中患者用100mm VAS量表評(píng)分的基線的發(fā)作嚴(yán)重度相似(rhC1INH組平均為73.5mm vs鹽水組平均為77.3mm)。rhC1INH組和鹽水組中的主要發(fā)作部位也相似(外周部位為rhC1INH組44％vs鹽水組45％，腹部部位為rhC1INH組37％vs鹽水組39％)。

深靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)：基于威爾斯預(yù)測規(guī)則評(píng)分，沒有患者被鑒定為具有增加的DVT風(fēng)險(xiǎn)。在rhC1INH組的39位患者和鹽水組的30位患者中記錄的所有得分較低，從-2至0，表明患者患DVT的可能性非常低。對(duì)威爾斯得分為0的2位患者(1位rhC1INH和1位鹽水)進(jìn)行的超聲檢查在腹部和下肢均正常，沒有證據(jù)表明DVT。

D-二聚體水平：在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(基線，rhC1INH輸注后2小時(shí)，和用rhC1INH治療后7天)評(píng)估D-二聚體水平(以平均25^th-75^th四分位表示)。通過評(píng)估主要發(fā)作部位類型(粘膜下：腹部和咽部-喉部vs皮下：面部和外周)、嚴(yán)重度(對(duì)于主要發(fā)作部位，中度：VAS為50-75mm；嚴(yán)重為≥76mm)和單個(gè)vs多個(gè)影響部位進(jìn)行進(jìn)一步分類。

患者在基線的總體中值D-二聚體水平升高(2149[480-5105]μg/L,正常范圍<540μg/L)(表2)。用rhC1INH或鹽水治療后2小時(shí)，所有患者的D-二聚體水平持續(xù)升高至中值水平2469(643-5827)μg/L。治療后第7天，兩個(gè)治療組的D-二聚體水平均恢復(fù)至正常附近的水平。應(yīng)當(dāng)注意的是，用rhC1INH或鹽水治療后2小時(shí)和第7天，組之間的平均D-二聚體水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在兩個(gè)治療組的第2小時(shí)(rhClINH:145μg/L；鹽水:192μg/L)和第7天(rhClINH:-2401μg/L；鹽水:-1923μg/L)，兩個(gè)治療組從基線起的平均變化也相似，表明rhC1INH治療不影響HAE患者的D-二聚體產(chǎn)生。

發(fā)生在粘膜下或皮下水腫的HAE發(fā)作影響皮膚、腸和上呼吸道。基于粘膜下和皮下主要發(fā)作部位評(píng)估患者群的D-二聚體水平(表3)。與具有皮下發(fā)作的患者相比，具有粘膜下發(fā)作的患者的中值D-二聚體水平至少比基線(p＝0.0274)和治療后2小時(shí)(p＝0.0126)高三倍。在總體群中，用rhC1INH治療在兩個(gè)給藥后的時(shí)間點(diǎn)對(duì)D-二聚體水平?jīng)]有明顯影響。沒有進(jìn)一步評(píng)估個(gè)體主要發(fā)作部位(例如面部、外周、腹部、咽部-喉部)的D-二聚體水平之間的比較。

在基線將主要發(fā)作部位的嚴(yán)重度分類為中度(VAS≥50mm且<75mm)或嚴(yán)重(VAS≥75mm)?？傮w上，患有中度(1674[593-5241]μg/L)和嚴(yán)重(2320[260-5550]μg/L)發(fā)作的患者的中值基線D-二聚體水平相似(表4)。用rhC1INH治療的嚴(yán)重發(fā)作在第7天的D-二聚體水平(280[109-925]μg/L)確實(shí)傾向于比用鹽水治療的那些(560[273-4056μg/L)低。

盡管大多數(shù)HAE發(fā)作表現(xiàn)分為單個(gè)部位的癥狀，一些發(fā)作可能表現(xiàn)為同時(shí)受影響的多個(gè)解剖部位。鑒于此，還測定D-二聚體水平是否被多個(gè)受影響部位的存在所影響。64位患者表明單個(gè)部位發(fā)作，10位表明多個(gè)部位發(fā)作。在基線，具有多個(gè)受影響部位的患者(9555[4315-13300)μg/L)的中值D-二聚體水平高于具有單個(gè)部位的患者(4568[2065-24634]μg/L)。治療后2小時(shí)，多個(gè)發(fā)作部位的D-二聚體水平仍然更高(5040[812-11045]μg/L vs.單個(gè)部位的2294[615-5065]μg/L)。至第7天，兩個(gè)組的D-二聚體水平恢復(fù)至正常。

表1：患者的人口特征和基線特征

表2：所有患者隨時(shí)間的D-二聚體水平*

*正常范圍＜540μg/L

表3：具有粘膜下vs皮下部位的合適發(fā)作的有癥狀HAE患者的D-二聚體水平

數(shù)值以中值(四分位范圍)表示。

^*解剖部位表示主要發(fā)作部位(參見方法)。

^a粘膜下＝咽部-喉部、腹部、沒有報(bào)道泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)作。

^b皮下＝外周，面部。

表4：在主要發(fā)作部位的D-二聚體水平嚴(yán)重度

^a嚴(yán)重度是基于主要發(fā)作部位在每次訪問時(shí)的總體VAS得分。

圖4-9進(jìn)一步總結(jié)了結(jié)果。與緩解時(shí)間相比，在HAE發(fā)作期間的D-二聚體水平升高。然而，D-二聚體水平的升高與rhC1INH治療無關(guān)。用rhC1INH沒有觀察到血栓栓塞事件。

在本申請中引用的所有文獻(xiàn)、專利、專利申請和公告專利的內(nèi)容通過引用明確并入本文。除非另有說明，本文所用的技術(shù)術(shù)語基于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的常規(guī)用法。在標(biāo)準(zhǔn)教科書中可以找到分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義(例如Oxford University Press出版的Benjamin Lewin，Genes V，1994(ISBN 0-19854287-9)；Kendrew等(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，published by Blackwell Science Ltd，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和VCH出版社出版的Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8))。