本發(fā)明屬于醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種甘丙肽及其受體在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖中的用途。

背景技術(shù)：

甘丙肽(galanin)：是由29個氨基酸組成的神經(jīng)肽，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中；膠質(zhì)瘤(glioma)：常見的惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，膠質(zhì)瘤細(xì)胞則是由人體膠質(zhì)瘤病理組織體外培養(yǎng)的細(xì)胞系，用于基礎(chǔ)科研研究使用；細(xì)胞增殖(cell proliferation)：細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖并產(chǎn)生新的細(xì)胞，是生命體的重要生命特征。而腫瘤細(xì)胞的增殖則是指細(xì)胞在致癌因素的作用下，基因發(fā)生改變，從而導(dǎo)致異常持續(xù)的分裂增殖。

甘丙肽是由29～30個氨基酸組成的神經(jīng)肽，能廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，并且更有研究提示甘丙肽也存在于神經(jīng)內(nèi)分泌的組織中(Giaid et al.,1991)。在后續(xù)對甘丙肽的研究中發(fā)現(xiàn)，其參與了多種重要的生理、行為以及認(rèn)知過程當(dāng)中。除此之外，更有研究提示甘丙肽與多種疾病有密切的關(guān)系，例如癲癇、抑郁癥、阿爾茨海默病和癌癥。其中，甘丙肽與腫瘤發(fā)生、增殖以及凋亡的關(guān)系越來越引起關(guān)注。早期研究就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甘丙肽和其三種受體亞型廣泛表達(dá)于多種人類腫瘤細(xì)胞系，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌細(xì)胞系以及大腸癌等。在深入研究后發(fā)現(xiàn)，越來越多的數(shù)據(jù)顯示甘丙肽在多種神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)腫瘤的病理過程中起到了負(fù)調(diào)節(jié)的作用，這也提示甘丙肽及其受體可能具有抑癌的功能。

甘丙肽通過其三種G蛋白偶聯(lián)受體亞型廣泛參與和調(diào)控多種類型的生理過程中，分別被克隆和命名為甘丙肽1型受體(GalR1)，甘丙肽2型受體(GalR2)和甘丙肽3型受體(GalR3)。每種甘丙肽受體亞型均展現(xiàn)出了不同的生理藥理特性，并且三種受體亞型分別介導(dǎo)多種不同的下游信號通路。GalR1和GalR3主要與Gi/o蛋白受體亞型偶聯(lián)，通過激活腺苷酸環(huán)化酶引起細(xì)胞膜上電流的超極化和膜上鉀離子通道的開放。與GalR1和GalR3受體亞型不同的是，GalR2下游信號通路的激活主要是通過與Gq/11蛋白受體亞型偶聯(lián)后，使細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷聚集，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放以及下游信號通路的開放。

膠質(zhì)瘤作為人類最為常見的惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，其較高的致死率一直排在顱腦疾病的前列。由于腦膠質(zhì)瘤具有較強的增殖、侵襲以及對藥物耐受的能力，而且預(yù)后效果一直極其不佳，臨床上一直沒有較為有效的治療方法。因此，研究探索一種新的抑癌藥物對于人腦膠質(zhì)瘤在臨床上的治療尤為緊要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種甘丙肽在制備抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用，由此解決現(xiàn)有臨床無甘丙肽是否能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的增殖研究的空白。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案如下：

一種甘丙肽在制備抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用，所述試劑中具有甘丙肽作為有效成分，該試劑通過甘丙肽與甘丙肽受體結(jié)合對膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行作用，并對細(xì)胞系的增殖進(jìn)行抑制。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述膠質(zhì)瘤細(xì)胞選擇人源U251或者T98G瘤細(xì)胞。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，將甘丙肽和生理鹽水混合并制成試劑。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述試劑中，所述甘丙肽的濃度為100nM-1000nM。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述試劑被制備成靜脈注射針劑。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述試劑中，所述甘丙肽的濃度為100nM。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述甘丙肽通過甘丙肽1型受體(GalR1)來介導(dǎo)，并對膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行作用。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，將甘丙肽和培養(yǎng)基混合并制成試劑。

一種制備抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的試劑，所述試劑中具有甘丙肽作為有效成分，該試劑通過甘丙肽與甘丙肽受體結(jié)合對膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行作用，并對細(xì)胞系的增殖進(jìn)行抑制。

本發(fā)明采取了上述方案以后，從臨床上提供了甘丙肽作為試劑抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的支持，同時，該試劑可進(jìn)一步制備成靜脈注射針劑，一方面易于臨床上的操作和使用，另一方面也能方便于患者術(shù)后自行注射和進(jìn)行輔助康復(fù)治療。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實施本發(fā)明而了解。本發(fā)明的目的和其他優(yōu)點可通過在所寫的說明書、權(quán)利要求書、以及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)和獲得。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，以使得本發(fā)明的上述優(yōu)點更加明確。其中，

圖1a是甘丙肽及其三個受體在人源U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平示意圖；

圖1b是甘丙肽及其三個受體在人源T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平示意圖；

圖2a-圖2f是實驗中甘丙肽對人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖起抑制作用的實驗測試示意圖；

圖3a-圖3d是實驗中甘丙肽抑制人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成的測試示意圖；

圖4a-圖4b是實驗中甘丙肽對細(xì)胞周期發(fā)揮有效的阻滯作用示意圖；

圖5a-圖5h是甘丙肽在裸鼠的腫瘤種植模型實驗中顯著抑制腫瘤的增殖示意圖。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖及實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。需要說明的是，只要不構(gòu)成沖突，本發(fā)明中的各個實施例以及各實施例中的各個特征可以相互結(jié)合，所形成的技術(shù)方案均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

具體來說，隨著甘丙肽的研究，人民逐漸發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長因子，并且發(fā)現(xiàn)其對膠質(zhì)瘤具有顯著的抑癌作用。并且，更有研究提示神經(jīng)肽也能作用到膠質(zhì)瘤并具有抑制其增殖的功能。由于調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的增殖對臨床上抑制腫瘤生長起到了至關(guān)重要的作用，因此，研究甘丙肽是否能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的增殖具有重要的臨床意義。

值得關(guān)注的是，早期就有研究提示甘丙肽及其三種受體亞型均有表達(dá)于人腦膠質(zhì)瘤病理組織當(dāng)中，但是其是否在人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)和發(fā)揮調(diào)節(jié)作用一直很少關(guān)注。近幾年研究發(fā)現(xiàn)甘丙肽通過GalR1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮了抑制其腫瘤增殖的作用，更有研究深入探究了甘丙肽及其受體亞型的抑癌功能主要是通過介導(dǎo)MAPK信號通路而作用的。因此，基于上述的研究基礎(chǔ)，對于探究甘丙肽及其受體對腫瘤的增殖是否起抑制作用具有重要的基礎(chǔ)和臨床意義。并且，由于甘丙肽對人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖和凋亡是否也有一定的調(diào)節(jié)作用一直少有關(guān)注和研究。因此，研究其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系是否也能發(fā)揮抑癌作用顯得尤為重要。

為此，提供了一種甘丙肽在制備抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用，所述試劑中具有甘丙肽作為有效成分，該試劑通過甘丙肽或者甘丙肽受體對膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行作用，并對細(xì)胞系的增殖進(jìn)行抑制。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述膠質(zhì)瘤細(xì)胞選擇人源U251或者T98G瘤細(xì)胞。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，將甘丙肽和生理鹽水混合并制成試劑。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述試劑中，所述甘丙肽的濃度為100nM-1000nM。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述試劑被制備成靜脈注射針劑。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述試劑中，所述甘丙肽的濃度為100nM。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，所述甘丙肽通過甘丙肽1型受體(GalR1)來介導(dǎo)，并對膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行作用。

進(jìn)一步地，優(yōu)選的是，將甘丙肽和培養(yǎng)基混合并制成試劑。

本發(fā)明采取了上述方案以后，從臨床上提供了甘丙肽作為試劑抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的支持，同時，該試劑可進(jìn)一步制備成靜脈注射針劑，一方面易于臨床上的操作和使用，另一方面也能方便于患者術(shù)后自行注射和進(jìn)行輔助康復(fù)治療。

具體來說，在本專利中，通過實時定量PCR檢測到甘丙肽及其三個受體亞型均表達(dá)于人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中。采用體外細(xì)胞實驗分別檢測兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在甘丙肽處理后增殖活性和細(xì)胞周期的變化，同時建立人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞株裸鼠皮下接種模型裸鼠模型。研究結(jié)果表面，甘丙肽能明顯抑制腫瘤的細(xì)胞增殖和周期，并對裸鼠皮下移植模型也起到抑瘤作用。

其中，針對發(fā)明中的附圖，簡單說明如下：圖1a-圖1b是通過使用實時定量PCR(RT-PCR)技術(shù)來檢測細(xì)胞中甘丙肽及其三個受體的mRNA表達(dá)水平(Relative Expression)變化，目的基因的mRNA表達(dá)水平以管家基因GAPDH為內(nèi)參，其中，圖1a是甘丙肽及其三個受體在人源U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平；圖1b是甘丙肽及其三個受體在人源T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。

圖2a-圖2f是采用CCK-8體外細(xì)胞活性檢測試劑盒研究甘丙肽和AR-M1896對兩種細(xì)胞系的增殖是否發(fā)揮作用，加藥處理組的細(xì)胞增殖活性均以正常對照組為內(nèi)參來分析細(xì)胞相對增殖率(Relative Cell Proliferation)。

其中，圖2a和圖2b是通過酶標(biāo)儀檢測各細(xì)胞系在不同細(xì)胞種植數(shù)下的吸光值(Absorbance 450nm)，分別研究兩種細(xì)胞的生長曲線，從而確定最佳細(xì)胞種植密度(Cell Number)；

圖2c和圖2d是各種細(xì)胞在不同濃度的甘丙肽和AR-M1896處理48小時后，甘丙肽對細(xì)胞增殖的抑制作用呈正相關(guān)；

圖2e和圖2是經(jīng)100nM甘丙肽和AR-M1896處理后，甘丙肽處理組在48小時對兩種細(xì)胞系均呈現(xiàn)明顯的抑制生長活性的作用；

其中，圖3a和圖3b中，細(xì)胞克隆形成實驗提示，100nM甘丙肽處理組可以顯著降低細(xì)胞的克隆形成數(shù)，提示甘丙肽均對兩種細(xì)胞系發(fā)揮抑制增殖的作用；

圖3c和圖3d中，通過軟瓊脂克隆實驗進(jìn)一步證實，與對照組相比甘丙肽處理組顯著降低了兩種細(xì)胞的克隆形成數(shù)(Colonies Number)。

其中，圖4a-圖4b是細(xì)胞經(jīng)24小時的不同藥物處理后，通過使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測甘丙肽和AR-M1896對細(xì)胞的周期分布(Distribution of Cell Cycle)是否產(chǎn)生影響。2mM秋水仙堿(Colchicine)實驗組作為陽性實驗對照組，處理時間和方法與實驗組一致。

其中，圖4a中，人源U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系在100nM甘丙肽處理后，細(xì)胞周期明顯放生阻滯；

圖4b中，人源T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期同樣在100nM甘丙肽處理后發(fā)生阻滯；

其中，圖5a-圖5b的圖像是從模型動物處死后剝離的腫瘤組成；

圖5c和圖5d中，經(jīng)甘丙肽和AR-M1896藥物組處理后，腫瘤體積大小的變化。結(jié)果提示甘丙肽可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的腫瘤體積大小(Tumor Volume)；

圖5e和圖5f中，腫瘤剝離后經(jīng)稱重，來分析藥物組對腫瘤的生長是否有抑制作用。如圖所示，甘丙肽藥物組腫瘤的重量(Tumor Weight)與正常對照組相比顯著減輕；

圖5g和圖5h是實驗?zāi)Ｐ蛣游锩扛羧斓捏w重變化(Body Weight)。

解決技術(shù)問題的具體實驗步驟：

1實時定量RT-PCR檢測甘丙肽及其受體在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況：

1.1細(xì)胞總RNA提取

(1)4℃離心收集細(xì)胞放于EP管中。按照試劑盒提RNA(QIAGEN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit)的操作步驟，提取細(xì)胞中的RNA；

(2)在各EP管中加0.5ml QIAZOL；

(3)反復(fù)吹打直至QIAZOL澄清，室溫放置5分鐘；

(4)加200μl chloroform試劑，劇烈震蕩15秒，室溫放置2-3分鐘；

(5)12000rpm，4℃離心15分鐘；

(6)可見液體明顯分層，取上清至一新管，并加入等體積70％乙醇溶液；

(7)將液體轉(zhuǎn)移至2ml RNeasy column tube，≥8000rpm離心15秒，棄濾液；

(8)加入700μl buffer RW1，≥8000rpm，15s，棄濾液；

(9)加入500μl RPE，≥8000rpm離心15秒，棄濾液；

(10)加入500μl RPE，≥8000rpm離心2分鐘，棄濾液；

(11)更換1.5ml EP管，加入30-50ul無RNA酶水，≥8000rpm離心1分鐘。

1.2RNA的定性與定量鑒定

取1ulRNA進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，可見清晰的28s rRNA、18s rRNA和5s rRNA三條帶，28s rRNA的寬度和亮度約為18sRNA的1.5～2.0倍，且5srRNA帶亮度不如18S帶和28S帶清晰，表明提取過程中RNA未被降解。

取1ulRNA，用DEPC水稀釋至100ul，用紫外分光光度計測量樣品在260nm和280nm處的光密度(optic density，OD)值。RNA濃度的計算公式為：RNA濃度(ug/ml)＝[OD260×40×100]。OD260/OD280在1.8-2.0之間，表明無蛋白質(zhì)污染且RNA純度比較好。

1.3逆轉(zhuǎn)錄

(1)將反轉(zhuǎn)錄試劑從冰箱取出置于冰上溶解，然后混勻、離心；

(2)配制cDNA合成混合體系，成分及用量如下:

10×RT Buffer 2μl

25mM MgCl2 4μl

0.1M DTT 2μl

RNase OUT 1μl

SuperScriptⅢRT 1μl

Total 10μl

(3)取1ug新鮮提取的RNA，配制用于反轉(zhuǎn)錄的混合體系b并加入到cDNA合成體系中，成分及用量如下：

Total RNA總量 1ug

Primer[oligo(dT)] 1ul

10mM dNTP mix 1ul

DEPC-free H2O 5ul

(4)將含有反轉(zhuǎn)錄體系的PCR管放入65℃水浴鍋10分鐘，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰上最少放置1分鐘；

(5)然后將PCR放置于PCR儀中，設(shè)置程序：50℃50分鐘，85℃5分鐘，4℃降溫；

(6)完成上述的反應(yīng)體系后加入1ul RNase H，然后至于37℃，20分鐘；

(7)將cDNA合成反應(yīng)物置于-20℃度保存。

1.4引物設(shè)計及合成

根據(jù)Genbank已發(fā)表的人源Galanin，受體GalR1，GalR2，GalR3序列,用primer 5.0軟件輔助設(shè)計特異引物，并由上海英駿公司合成。

Gal-F AGGAAAAACGAGGCTGGAC

Gal-R TGGTTTCATGTCATCTTCGGG

GalR1-F CATTCGCAAAGATTCACACCTGAG

GalR1-R GTTTGTTTCTGTGTCTGGTCCACT

GalR2-F ACAGGTATCTGGCCATCCGCTAC

GalR2-R ACTGGCGGTAGTAGCTCAGGTAGG

GalR3-F TACACGCTGGATGCCTGGCTCTTT

GalR3-R GTACCTGTCCACGGAGACAGCAG

Gadph-F TGGGTGTGAACCATGAGAAG

Gadph-R GAGTCCTTCCACGATACCAAAG

1.5RT-PCR檢測基因的表達(dá)

(1)將反轉(zhuǎn)錄后的細(xì)胞cDNA樣品按RT-PCR反應(yīng)體系加入，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

SYBR GREEN PCR Master Mix 10.0μl

上游引物(10μM) 0.5μl

下游引物(10μM) 0.5μl

cDNA模板 1.0μl

無菌ddH2O補充至 20.0μl

(2)每一模板擴增目的片段三個復(fù)孔，擴增GAPDH三個復(fù)孔，并設(shè)陰性對照；

50℃預(yù)熱2min

95℃變性10min

96℃預(yù)變性3min；

94℃變性15s，59℃退火20s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；

(3)應(yīng)用相對定量分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，顯示擴增曲線，比較各組目的基因表達(dá)量。實時定量PCR的過程是在7300實時PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Applied Biosystems)完成，熒光信號用7300系統(tǒng)SDS軟件進(jìn)行分析。

2細(xì)胞生長標(biāo)準(zhǔn)曲線

在對細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測之前，需要確定細(xì)胞生長的最佳種植密度，從而確定藥物對細(xì)胞作用時的每孔最佳細(xì)胞數(shù)。因此，根據(jù)每孔細(xì)胞種植數(shù)與對應(yīng)OD值的相互關(guān)系，繪制細(xì)胞的體外生長標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(1)吸棄培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)上清，在PBS洗滌之后加入胰酶消化5分鐘；

(2)加入含有10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基終止胰酶消化，并且重懸細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；

(3)按照每100ul細(xì)胞懸液中分別含有1000～10000個細(xì)胞依次進(jìn)行濃度稀釋，然后分別將按比例稀釋后的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組樣品重復(fù)9個副孔；

(4)將細(xì)胞置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，然后于每孔中加入20ul的CCK-8細(xì)胞增殖檢測溶液，在培養(yǎng)箱孵育2小時；

(5)用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度值，統(tǒng)計數(shù)據(jù)并分別繪制每種細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線。

3CCK-8方法檢測細(xì)胞活力

(1)將細(xì)胞按1×105個/孔的密度用100μl培養(yǎng)基接種于96孔板，每種細(xì)胞重復(fù)8個復(fù)孔；

(2)細(xì)胞接種后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，然后向各孔中加入CCK-8溶液10μl，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～2小時；

(3)將96孔板置于酶標(biāo)儀中，讀取450nm波長處的吸光度值，并統(tǒng)計作圖。

4細(xì)胞克隆形成實驗

細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示細(xì)胞在接種后貼壁細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。細(xì)胞貼壁后不一定都能增殖和形成克隆，但是形成克隆的細(xì)胞必須是有貼壁和增殖活力的細(xì)胞。因此，細(xì)胞克隆形成率可以反映出細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

基本步驟：

1)取對數(shù)生長期的各組單層培養(yǎng)細(xì)胞，分別用0.25％Trypsin-EDTA消化并吹打成單個細(xì)胞；

2)使用臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，并把細(xì)胞懸浮在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用；

3)每組細(xì)胞分別以1000個/孔種植于含2mL 37℃預(yù)溫DMEM培養(yǎng)基的六孔板中，并輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板，使細(xì)胞盡量均勻分散的分布；

4)待細(xì)胞貼壁后(約12h)，分別給予10-7M甘丙肽以及10-7M甘丙肽二型受體激動劑AR-M1896，并同時設(shè)control空白對照組。然后置于37℃5％CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周；

5)每3天更換培養(yǎng)基并觀察克隆形成情況，待培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)；

6)棄去培養(yǎng)基，用PBS小心浸洗細(xì)胞2次后，加入1mL/孔甲醇固定5分鐘；

7)棄去固定液并以流水緩慢沖洗干凈，每孔加入1mL結(jié)晶紫染色液染色10分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，置于通風(fēng)櫥中干燥；

8)將培養(yǎng)皿倒置，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡下計數(shù)直徑大于50m(或含50個細(xì)胞以上)的細(xì)胞克隆數(shù)。每種藥物處理的細(xì)胞樣本接種3個復(fù)孔，并獨立重復(fù)3次實驗；

9)按以下公式計算細(xì)胞克隆形成率，并計算細(xì)胞克隆形成率并保存圖像：

細(xì)胞克隆形成率(％)＝藥物處理后的克隆形成數(shù)/接種的總細(xì)胞數(shù)×100％

5細(xì)胞雙層軟瓊脂實驗。

(1)用蒸餾水分別制備出1.2％和0.65％兩個濃度的低溶點瓊脂糖液體，高壓滅菌后，維持在50℃中，使之保持溶解狀態(tài)；

(2)在無菌條件下制備2×DMEM(含2×抗生素和20％小牛血清)，保存在37℃中待用；

(3)按1:1比例混合1.2％的瓊脂糖和2×DMEM(含2×抗生素和20％小牛血清)后，取3ml混合液加入六孔培養(yǎng)板中并確保沒有氣泡，待底層冷卻凝固后，置入培養(yǎng)箱中備用；

(4)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化并輕輕吹打至細(xì)胞懸液，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個每毫升，然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋；

(5)按1:1比例讓0.65％的瓊脂糖和2×DMEM(含2×抗生素和20％小牛血清)培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.1mL的細(xì)胞懸液并充分混勻，輕輕加入到鋪有1.2％瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天；

(6)觀察細(xì)胞克隆形成情況，每三天補加細(xì)胞培養(yǎng)基，待2～3周后將培養(yǎng)皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)并統(tǒng)計克隆形成率；

(7)在倒置顯微鏡下(100×)，在鏡下隨機選擇10個視野，計數(shù)視野中大于50個克隆數(shù)(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆數(shù)：

克隆形成率＝(大于50個克隆數(shù)/所有克隆數(shù))×100％

(8)用顯微鏡拍照后可將上層培養(yǎng)基吸干后，每孔中加入0.1％結(jié)晶紫染色液染色15～30分鐘后用數(shù)碼相機拍照統(tǒng)計，并作圖分析。

6細(xì)胞周期分析

碘化丙啶是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量呈正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

(1)收集細(xì)胞培養(yǎng)基到離心管備用。用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用槍頭吹打下來時，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打下所有的貼壁細(xì)胞；

(2)將細(xì)胞懸液收集到離心管內(nèi)，1000g左右離心5分鐘，沉淀細(xì)胞；

(3)小心棄去上清，剩余約50ul左右的培養(yǎng)基以避免流失細(xì)胞；

(4)加入約1ml預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中；

(5)再次離心沉淀細(xì)胞，并且小心洗除上清，預(yù)留約50ul左右的PBS；

(6)輕輕彈擊離心管底使得細(xì)胞分散，避免細(xì)胞成團；

(7)加入1ml冰浴預(yù)冷70％乙醇，并且輕輕吹打均勻，4℃固定過夜；

(8)細(xì)胞固定后1000g左右離心5分鐘，沉淀細(xì)胞；

(9)小心棄去上清并加入1ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞；

(10)再次離心沉淀細(xì)胞并洗除上清，輕輕彈擊離心管底部以適當(dāng)分散細(xì)胞；

(11)每管細(xì)胞樣品中加入0.5ml含有RNase A的碘化丙啶染色液，輕輕充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30分鐘；

(12)用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，并采用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA的含量分析。

6裸鼠皮下移植瘤模型

6.1實驗動物及來源

SPF清潔級BALB/c裸鼠共計36只，4～6周齡，體重約18g～20g，雄性，均由首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，并飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心的SPF清潔級實驗環(huán)境。

6.2動物模型的建立

在含有10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)擴增人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到所需數(shù)量后，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞收集，用胰酶消化后離心處理，并棄去上清。用提前冰浴的生理鹽水重懸細(xì)胞，并調(diào)整成1×107個/mL的細(xì)胞懸液。在無菌環(huán)境下，抽取100ul細(xì)胞懸液接種于裸鼠前肢右側(cè)腋下皮下，每天觀察腫瘤的生長情況。若在種植細(xì)胞5天后，在接種部位的皮下可見移植瘤包塊，并且測量其體積約為100mm3，則判定為建立成功的膠質(zhì)瘤模型。

造模后，每隔兩天稱量裸鼠體重，并分別測量腫瘤最長徑(mm)、垂直徑(mm)和寬度(mm)。按照文獻(xiàn)公式計算腫瘤體積V：V＝(平均直徑)3×π/6。分別計算每次測量腫瘤的體積，并繪制腫瘤生長曲線(El-Salhy et al.,2004)。

6.3動物的分組給藥

分別給18只裸鼠種植U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并根據(jù)不同的細(xì)胞系隨機將造模成功的18只裸鼠分為3組，每組6只。分別為空白對照組、甘丙肽劑量組、AR-M1896劑量組。每天腹腔注射溶解于100ul生理鹽水的甘丙肽和AR-M1896(40ug/kg)，給藥1次，共計25天。在最后一次給藥后的次日處死裸鼠，剝離腫瘤稱重，并進(jìn)行相關(guān)分析檢測。

7數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)檢驗

采用Prism 5.0版統(tǒng)計軟件，對實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。兩組間的比較采用非配對t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若比較兩組及兩組以上并且有不同時間點則采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，檢驗顯著性取α＝0.05，p<0.05作為有顯著性差異。

技術(shù)研究結(jié)果：

1甘丙肽及其受體亞型均在人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)

早期研究提示甘丙肽及其三個受體均在人體的腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)(Berger et al.,2003)。但是在細(xì)胞水平層面，甘丙肽及其三個受體是否在人腦U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)一直未知。

通過實時定量PCR技術(shù)來檢測甘丙肽及其三個受體在人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞上面的mRNA水平表達(dá)情況。實驗結(jié)果提示，甘丙肽的三種受體亞型均表達(dá)于人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中(圖1a和圖1b)。但是相比于其三個受體的表達(dá)水平，甘丙肽的mRNA水平在細(xì)胞中表達(dá)較低。

2甘丙肽可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和活性

通過實時定量PCR技術(shù)提示，甘丙肽的三個受體亞型在mRNA水平上均表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，這些結(jié)果提示了甘丙肽很有可能在細(xì)胞功能水平參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的調(diào)控。因此，采用體外細(xì)胞增殖實驗來進(jìn)一步研究甘丙肽是否對人源膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長與活性發(fā)揮作用。

2.1人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長曲線的制備

在人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)甘丙肽和甘丙肽2型及3型受體特異性激動劑(AR-M1896)處理之前，需要先確定各膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的最佳生長細(xì)胞數(shù)，然后在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測藥物對細(xì)胞增殖的作用。由于每一種細(xì)胞系都有著不同的生長速率和密度，因此，為了更加客觀的研究甘丙肽和AR-M1896是否對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，需要先制備人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長曲線。

如圖所示(圖2a)，通過酶標(biāo)儀檢測人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的吸光值可以明顯看出，當(dāng)細(xì)胞數(shù)處在4,000～6,000個/mL之間時，細(xì)胞處于對數(shù)生長期。當(dāng)細(xì)胞生長至9,000個/mL時，細(xì)胞處于生長平臺期。因此，結(jié)果提示當(dāng)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞在5,000個/mL時，細(xì)胞生長旺盛，是后續(xù)細(xì)胞增殖實驗的理想細(xì)胞種植密度。同樣，人T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的吸光值顯示，在細(xì)胞密度處于6,000個/mL時，是該細(xì)胞系的最佳種植密度(圖2b)。

2.2甘丙肽對細(xì)胞的增殖起抑制作用

人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度的甘丙肽和AR-M1896處理48小時后，兩種細(xì)胞系的增殖均呈現(xiàn)抑制現(xiàn)象。并且，甘丙肽抑制細(xì)胞活性的程度與其濃度梯度呈正比。當(dāng)甘丙肽的濃度達(dá)到100nM時，均能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但是，甘丙肽2型和3型受體激動劑AR-M1896無論在何種濃度下都無法降低細(xì)胞的生長活性(圖2c和圖2d)。

在確認(rèn)甘丙肽在100nM時能有效對人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖發(fā)揮抑制作用后，進(jìn)一步檢測甘丙肽和AR-M1896對兩種細(xì)胞系的增殖抑制是否與時間相關(guān)。實驗結(jié)果提示，在兩種細(xì)胞系經(jīng)100nM甘丙肽處理48小時后，其細(xì)胞的增殖均明顯發(fā)生抑制，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但AR-M1896對細(xì)胞的增殖仍無顯著抑制作用(圖2e和圖2f)。

3甘丙肽抑制細(xì)胞的克隆形成

為了在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗證甘丙肽對細(xì)胞增殖的抑制作用，采用細(xì)胞克隆形成實驗來反映人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆存活率是否也受到甘丙肽或者AR-M1896的影響。結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞系經(jīng)100nM甘丙肽處理后，與對照組相比，其細(xì)胞的克隆形成情況均受到明顯的抑制(P<0.05)。但是，AR-M1896處理組與對照組相比，仍然沒有顯著性差異(圖3a和圖3b)。

除此之外，還通過軟瓊脂克隆形成實驗將人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別培養(yǎng)于立體軟瓊脂培養(yǎng)基當(dāng)中，通過單克隆細(xì)胞生長聚集形成的克隆數(shù)量來反映甘丙肽和AR-M1896對兩種細(xì)胞系的生長活性是否也起抑制作用。如圖所示(圖3c和圖3d)，將兩種細(xì)胞系分別培養(yǎng)于含有100nM甘丙肽的軟瓊脂培養(yǎng)基中，與無藥物處理的對照組相比，100nM甘丙肽能顯著減少細(xì)胞的克隆形成數(shù)(P<0.05)，而100nM的AR-M1896處理組與對照組相比并無顯著性差異。因此，采用軟瓊脂克隆形成實驗同樣也體現(xiàn)出甘丙肽對兩種細(xì)胞系增殖的抑制作用。

4甘丙肽對細(xì)胞的周期產(chǎn)生明顯阻滯作用

通過上述結(jié)果得出，兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系經(jīng)甘丙肽處理后，細(xì)胞的增殖均發(fā)生明顯的抑制，而AR-M1896并不能起到相同的抑制細(xì)胞活性的作用。因此，為了進(jìn)一步研究甘丙肽和AR-M1896抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象是否通過影響其細(xì)胞的有絲分裂前期過程，通過使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測甘丙肽是否有影響到兩種細(xì)胞系的細(xì)胞周期。

與無處理的正常對照組相比，兩種細(xì)胞系在經(jīng)過100nM甘丙肽處理24小時后通過流式細(xì)胞術(shù)可以得出，其細(xì)胞周期G1期顯著減少，均大量滯留在S/G2期，且其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其甘丙肽處理組的實驗結(jié)基本與陽性實驗對照組，即細(xì)胞經(jīng)過2mM秋水仙堿處理24小時后相同。相反，AR-M1896處理組與正常對照組結(jié)果較為一致，幾乎沒有對細(xì)胞周期產(chǎn)生任何的顯著作用。因此，實驗結(jié)果也提示甘丙肽是通過阻滯細(xì)胞周期來影響細(xì)胞的增殖能力的。

以上細(xì)胞水平的實驗結(jié)果均顯示，甘丙肽可以在一定的濃度和時間作用下對人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞增殖發(fā)揮顯著的抑制作用。但是，甘丙肽2型和3型受體激動劑AR-M1896無論在不同濃度和時間的作用下，均不能對細(xì)胞的生長活性起到抑制作用。這也進(jìn)一步提示，甘丙肽抑制細(xì)胞的增殖能力有可能是通過甘丙肽1型受體(GalR1)來介導(dǎo)的。

5甘丙肽在體內(nèi)裸鼠模型中能有效抑制腫瘤的生長

在上述體外細(xì)胞水平的實驗結(jié)果基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步在動物體內(nèi)水平上來驗證甘丙肽和AR-M1896對人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑癌作用。因此，分別建立人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞株裸鼠皮下接種模型裸鼠模型，研究甘丙肽和AR-M1896是否可以抑制裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞皮下移植模型中的腫瘤生長。

參照實驗方法中的裸鼠皮下接種方法，將人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，并于25天之后將動物處死并剝離腫瘤(圖5a和圖5b)。隨著腫瘤細(xì)胞皮下移植天數(shù)的增加，空白正常對照組和AR-M1896藥物處理組的腫瘤呈正比例增長，而甘丙肽藥物處理組的腫瘤細(xì)胞增長明顯受到抑制(圖5c和圖5d)。在測量與分析了腫瘤生長的體積大小之后，將腫瘤剝離并且稱量其重量。與甘丙肽抑制腫瘤體積大小的結(jié)果一致，甘丙肽實驗組的腫瘤重量顯著減輕(P<0.05)，但是AR-M1896實驗組的腫瘤重量與正常對照組無顯著差異(圖5e和圖5f)。

綜上體外和體內(nèi)水平實驗的結(jié)果可以得出，甘丙肽對人源U251和T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞有顯著的抑癌作用，因此預(yù)示甘丙肽有可能對臨床上的人腦膠質(zhì)瘤也起到抑制作用。但是，由于AR-M1896無論是在細(xì)胞水平還是裸鼠模型上，都無法顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這也提示了甘丙肽對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用主要是通過甘丙肽1型受體(GalR1)所介導(dǎo)的。

其中，本發(fā)明采取了上述方案以后，由于甘丙肽易于提取和合成，試劑配制方法操作簡單，具有經(jīng)濟適用的臨床價值。

需要說明的是，對于上述方法實施例而言，為了簡單描述，故將其都表述為一系列的動作組合，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知悉，本申請并不受所描述的動作順序的限制，因為依據(jù)本申請，某些步驟可以采用其他順序或者同時進(jìn)行。其次，本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)該知悉，說明書中所描述的實施例均屬于優(yōu)選實施例，所涉及的動作和模塊并不一定是本申請所必須的。

本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)明白，本申請的實施例可提供為方法、系統(tǒng)、或計算機程序產(chǎn)品。因此，本申請可采用完全硬件實施例、完全軟件實施例、或結(jié)合軟件和硬件方面的實施例的形式。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。