本發(fā)明涉及一種可引導(dǎo)組織再生的膀胱膜生物支架及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

膀胱作為泌尿系統(tǒng)的一個(gè)重要器官，常常由于一些先天性的原因或炎癥、感染、腫瘤、創(chuàng)傷等引起一定的損害或缺損，這些均可以導(dǎo)致膀胱變小和受損，這就最終需要進(jìn)行膀胱擴(kuò)大和修補(bǔ)替代。因此需要使用一定的替代材料進(jìn)行修復(fù)。傳統(tǒng)的替代材料主要有三種來源，有機(jī)合成材料、非泌尿系來源的天然替代材料、以及患者自體的泌尿系組織。但由于上述材料存在生物相容性問題或存在代謝異常、感染、尿路結(jié)石、攣縮甚至惡變的問題，或由于組織來源有限而導(dǎo)致術(shù)后膀胱容量過小等一系列的問題，均在不同程度上限制了這些材料在臨床上的應(yīng)用。

膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)屬于一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)，是新開發(fā)的泌尿系統(tǒng)組織器官替代用生物材料，其仿生的機(jī)械性能和優(yōu)良的組織相容性是多數(shù)生物和高分子材料所不能媲美的。這種材料作為細(xì)胞支架具有良好的生物相容性和結(jié)構(gòu)相容性，有利于細(xì)胞生長、繁殖、分化和形成組織化，與以前應(yīng)用的其他材料相比，具有生理再生重建膀胱組織、生物替代膀胱功能的顯著優(yōu)勢(shì)。這類材料一般通過SDS和TritonX-100的處理而得到。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明提供一種制備膀胱膜生物支架的方法，包括：

(1)用NaOH處理膀胱組織；

(2)用TritonX-100和SDS以任意順序處理所得物，并重復(fù)一遍該步驟；

(3)用NaOH處理所得物；

(4)將所得物低溫干燥。

具體而言，在步驟(2)中，相繼用TritonX-100、SDS、TritonX-100和SDS進(jìn)行處理；或者相繼用SDS、TritonX-100、SDS和TritonX-100進(jìn)行處理。

在實(shí)施方式中，處理中使用的NaOH、TritonX-100和SDS的濃度分別為約1～5N、約0.5～5％和約0.5～5％。例如，NaOH的濃度可以是約1N、2N、3N、4N或5N。TritonX-100的濃度可以是約0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。SDS的濃度可以是約0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。NaOH可以溶于水溶液或緩沖液例如PBS、Tris等。TritonX-100和SDS可以分別溶于水或常用緩沖液例如PBS、Tris等。

在實(shí)施方式中，NaOH處理包括將膀胱組織浸泡在NaOH溶液中，例如約1～5N的NaOH溶液中。Triton X-100和SDS處理分別包括將膀胱組織浸泡在Triton X-100和SDS溶液中并攪拌。

在實(shí)施方式中，NaOH、TritonX-100和SDS的處理可以在約4～16℃下進(jìn)行。

在實(shí)施方式中，在步驟(1)之前，使用蛋白酶抑制劑對(duì)膀胱組織進(jìn)行處理。蛋白酶抑制劑可以是PMSF、胃蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白肽酶等。

在實(shí)施方式中，在步驟(2)中，在TritonX-100和SDS的一遍處理之后，使用核酸酶對(duì)膀胱組織進(jìn)行處理。核酸酶可以是脫氧核糖核酸酶、或脫氧核糖核酸酶加核糖核酸酶。

在實(shí)施方式中，可以在所得物的低溫干燥之前，除去所得物上的核酸、脂肪和其他雜質(zhì)(包括前面處理中殘留的化學(xué)物質(zhì))。核酸、脂肪和其他雜質(zhì)的去除可以通過例如在乙醇和異丙醇的混合水溶液、生理鹽水中完成。

在實(shí)施方式中，可以對(duì)得到的膀胱膜生物支架進(jìn)行滅菌。滅菌可以在所得物的低溫干燥之前或之后進(jìn)行。在所得物的低溫干燥之后進(jìn)行的滅菌可以例如通過輻照滅菌等進(jìn)行。

在實(shí)施方式中，膀胱組織取自哺乳動(dòng)物，尤其是大型哺乳動(dòng)物，例如牛、羊、豬等。

一方面，本發(fā)明提供一種由上述方法制得的膀胱膜生物支架，由膀胱組織的脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)成。其中，本發(fā)明的膀胱膜生物支架的特征在于，DNA含量小于0.5wt％，脂肪含量小于0.5wt％，抗拉強(qiáng)度大于4MPa，標(biāo)準(zhǔn)膠原含量大于85wt％，縫合線撕裂力大于10N，疏松層的孔徑為約20～100μm。

另一方面，本發(fā)明提供上述膀胱膜作為膀胱修復(fù)材料的用途。

本發(fā)明通過優(yōu)化脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，即以NaOH處理開始，并以NaOH處理結(jié)束，中間用SDS和TritonX-100進(jìn)行處理，由哺乳動(dòng)物的膀胱組織制備出組織相容性、生物降解性和力學(xué)強(qiáng)度良好，并且引導(dǎo)組織再生能力強(qiáng)的膀胱膜生物支架。在加以成本低廉的NaOH的處理后，可以有效殺滅膀胱膜生物支架上的細(xì)菌和病毒，并減少排異反應(yīng)，得到的產(chǎn)品比傳統(tǒng)方法得到的更優(yōu)。這種膀胱膜生物支架既能防止尿液外滲，又能為細(xì)胞提供生長代謝等的場(chǎng)所，是組織再生的基礎(chǔ)。由于可以取材自大型哺乳動(dòng)物，所制得的膀胱膜生物支架的尺寸足以應(yīng)用至人體的膀胱修復(fù)。在數(shù)個(gè)月的修復(fù)之后，新生膀胱與原膀胱具有相同結(jié)構(gòu)和功能。

附圖說明

圖1示出根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜的外觀圖。

圖2示出根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜的疏松層的顯微照片。

圖3示出根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜包埋于大鼠皮下2周，取材后切片的HE染色圖，標(biāo)尺為50μm。

圖4示出使用本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜進(jìn)行6個(gè)月膀胱修復(fù)的比格犬以及正常比格犬的膀胱造影圖。

圖5A、5B和5C示出使用本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜進(jìn)行6個(gè)月膀胱修復(fù)的比格犬以及正常比格犬的膀胱尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果。

圖6A和6B分別示出使用本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜修復(fù)6個(gè)月后比格犬的膀胱切片的HE染色圖以及正常比格犬的膀胱切片的HE染色圖，標(biāo)尺為50μm。

圖7A和7B分別示出使用本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜修復(fù)6個(gè)月后比格犬膀胱切片的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的熒光染色圖以及正常比格犬膀胱切片的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的熒光染色圖，標(biāo)尺為50μm。

圖8示出使用本發(fā)明示例性實(shí)施方式的膀胱膜修復(fù)6個(gè)月后比格犬膀胱切片的CD31熒光染色圖，標(biāo)尺為50μm。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供的膀胱膜生物支架是膀胱組織的脫細(xì)胞基質(zhì)，即除去細(xì)胞成分并保留細(xì)胞外基質(zhì)的膀胱處理物。這種膀胱膜不僅抗原性低，而且可以很好地模擬組織器官的微環(huán)境。

脫細(xì)胞基質(zhì)通常通過NaOH消蝕、SDS法或TritonX-100法來制備，各方法適用不同組織，且各有利弊。比如，TritonX-100較為柔和，一般不破壞細(xì)胞外基質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和成分，但是處理時(shí)間較長，且會(huì)損失一部分細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白。SDS法可以保留較多細(xì)胞外基質(zhì)，但是膠原纖維間可能有細(xì)胞碎片殘留。NaOH由于比較容易洗去，因此沒有在最終產(chǎn)品上的殘留問題，對(duì)修復(fù)的組織和細(xì)胞沒有毒性。

本發(fā)明的膀胱膜生物支架制備方法，通過結(jié)合上述三種方法，優(yōu)化各方法的處理順序，使得制備出組織相容性好、生物降解性好、機(jī)械強(qiáng)度好并能引導(dǎo)組織再生的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。具體而言，在本發(fā)明中，有兩種處理順序。第一種是相繼用NaOH、TritonX-100、SDS、TritonX-100、SDS和NaOH進(jìn)行處理。第二種是相繼用NaOH、SDS、TritonX-100、SDS、TritonX-100和NaOH進(jìn)行處理。本發(fā)明的發(fā)明人注意到，當(dāng)以NaOH處理開始，并以NaOH處理結(jié)束，可以有效殺滅細(xì)菌和病毒，并減少膀胱膜生物支架的排異反應(yīng)。其中，本發(fā)明的膀胱膜生物支架以0.1g/ml比例浸提，內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml。由于NaOH成本低廉，且有上述效果，使得本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)于傳統(tǒng)方法得到的產(chǎn)品。NaOH通常以約1～5N的濃度溶于水溶液或緩沖液例如Tris、磷酸鹽緩沖液等，優(yōu)選為約2N的濃度。TritonX-100和SDS通常以0.5～5％的濃度分別溶于水或常用緩沖液例如PBS、Tris等，優(yōu)選為約1％的濃度。NaOH每次處理的時(shí)間優(yōu)選為約30分鐘，而TritonX-100和SDS每次處理的時(shí)間優(yōu)選為約24小時(shí)。NaOH、TritonX-100和SDS 的處理可以在約4～16℃下進(jìn)行。在各溶液的各個(gè)處理步驟中，為使處理效果更佳，可以數(shù)次更換新溶液。

在方法的步驟(1)之前，在處理溶液中添加蛋白酶抑制劑，比如PMSF等。在使用NaOH、SDS或TritonX-100對(duì)膀胱組織進(jìn)行處理時(shí)，組織中的細(xì)胞破裂，細(xì)胞中的蛋白酶會(huì)釋放出來。如果不事先使用蛋白酶抑制劑進(jìn)行處理，這些釋放出來的蛋白酶會(huì)降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白，從而破壞膠原蛋白和彈性纖維等形成的支架結(jié)構(gòu)。而這種支架結(jié)構(gòu)正是膀胱修復(fù)中起重要作用的部分，一來可以為尿液容納提供足夠的機(jī)械和力學(xué)強(qiáng)度，二來可以作為引導(dǎo)組織再生的框架和基礎(chǔ)。

在步驟(2)中，在用TritonX-100和SDS以任意順序處理一遍之后，通過添加核酸酶來降解細(xì)胞中的DNA和RNA。此處，核酸酶指脫氧核糖核酸酶和/或核糖核酸酶。RNA一般自身并不穩(wěn)定，在沒有添加核糖核酸酶的情況下，經(jīng)過一段時(shí)間，也會(huì)自然降解。而DNA在細(xì)胞外的存在較為穩(wěn)定，因此添加一定量的脫氧核糖核酸酶，可以保證DNA的降解，從而保證最后制得的膀胱膜的低抗原性。

在步驟(4)之前，一般要除去膀胱膜上殘留的核酸、脂肪和其他雜質(zhì)(包括前面處理殘留的化學(xué)物質(zhì))。一般采用乙醇和異丙醇的混合水溶液。乙醇和異丙醇均能沉淀核酸和脂肪，并在蒸發(fā)時(shí)帶走其他一些雜質(zhì)。也可以進(jìn)一步用生理鹽水進(jìn)行清洗，可以去除化學(xué)物質(zhì)殘留。

在去除核酸和脂肪等之后，將所得的膀胱處理物低溫干燥。低溫干燥可以除去所得物中的水分和溶液殘留，完好保持膀胱組織剩余部分的結(jié)構(gòu)。低溫干燥可以通過例如冷凍干燥的方法，在冷凍干燥儀中進(jìn)行。

如果膀胱膜要用于醫(yī)療用途，例如用于臨床的膀胱修復(fù)，則需要對(duì)其進(jìn)行滅菌。滅菌可以在所得物的低溫干燥之前或之后進(jìn)行。在低溫干燥之后的滅菌可以通過輻照進(jìn)行，例如鈷源照射等。

按照本發(fā)明方法得到的膀胱膜無毒性，抗原性極低，生物組織相容性好，具有生物可降解性(體內(nèi)降解速度為約3個(gè)月)及降解可調(diào)節(jié)性，并具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度。具體而言，本發(fā)明制得的膀胱膜包括致密層和疏松層，其中致密層為膀胱的粘膜層，而疏松層則主要是膀胱的肌肉層。致密層具有儲(chǔ)尿以及防止尿液外滲等功能特征。 疏松層富含膠原、彈性蛋白等，構(gòu)成的三維空間可以引導(dǎo)細(xì)胞的生長和延伸，并為這些細(xì)胞提供真實(shí)原始的細(xì)胞外微環(huán)境，這些細(xì)胞可以在此獲取營養(yǎng)，進(jìn)行氣體交換、排泄廢物以及生長代謝。疏松層在降解的同時(shí)，細(xì)胞分泌的基質(zhì)逐漸替代本發(fā)明的膀胱膜，從而完成組織修復(fù)。

由于本發(fā)明的膀胱膜可以由哺乳動(dòng)物，特別是大型哺乳動(dòng)物制得，因此膀胱膜的尺寸可以足夠大，以在膀胱修復(fù)中提供足夠的儲(chǔ)尿空間。進(jìn)行原材料采集時(shí)，要選取處死半小時(shí)以內(nèi)的動(dòng)物新鮮膀胱，迅速置于冰盒內(nèi)保存。在使用之前，要去除多余的周圍組織。

通過本發(fā)明的方法，可以以便利和廉價(jià)的方式得到可引導(dǎo)組織再生的膀胱膜生物支架，該膀胱膜生物支架在不引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)的情況下，一邊替代原損傷組織發(fā)揮膀胱功能，例如儲(chǔ)尿等，一邊引導(dǎo)細(xì)胞的生長和延伸，逐漸生成新的膀胱組織。經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，新生膀胱與原膀胱具有同樣的結(jié)構(gòu)和功能。

以下提供本發(fā)明的具體實(shí)施例，實(shí)施例僅為示例說明本發(fā)明，而并不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

制備例1

分別取處死半小時(shí)以內(nèi)的牛、豬、羊的新鮮膀胱，迅速置于冰盒內(nèi)PBS緩沖液(pH 7.4)中保存。修剪去除膀胱周圍的肌肉、脂肪等多余組織，自膀胱頸部以下剪除，然后正中剪開膀胱直至圓頂部，整個(gè)膀胱成片狀攤開。PBS漂洗三遍后待用。

之后，按照以下步驟制備膀胱膜生物支架：

(1)將膀胱浸于Tris(pH 8.0，Amresco，code：0497)緩沖液中，緩沖液內(nèi)含有蛋白酶抑制劑PMSF(sigma貨號(hào)78830)(濃度0.35ml/L)，室溫下持續(xù)浸泡攪拌24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次緩沖液；

(2)將膀胱置于PBS(pH 7.4，Nissui，貨號(hào)ZZR05913)中，在15℃下置于搖床上60～80rpm漂洗1小時(shí)；

(3)在4℃下，在2N的NaOH水溶液中浸泡30分鐘；

(4)置于PBS中，在15℃下漂洗1小時(shí)；

(5)置于含有1％TrionX-100(Amresco，code:0694)的PBS緩沖液(即TBS)中，于15℃持續(xù)浸泡攪拌24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次TBS緩沖液；

(6)置于PBS中，在15℃下漂洗1小時(shí)；

(7)置于含有1％SDS(Amresco code:0227)的Tris(pH 8.0)緩沖液中，在15℃下持續(xù)浸泡攪拌24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次緩沖液；

(8)置于PBS中，在15℃下漂洗24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次緩沖液；

(9)置于含有核糖核酸酶(sigma，貨號(hào)：6513，40u/ml)和脫氧核糖核酸酶(sigma，貨號(hào)：DN25，40u/ml)的1mol/L NaCl溶液中，室溫持續(xù)浸泡攪拌12小時(shí)；

(10)置于含有1％TrionX-100的PBS緩沖液(即TBS)中，15℃下持續(xù)浸泡攪拌24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次TBS緩沖液；

(11)置于PBS中，在15℃下漂洗1小時(shí)；

(12)置于含有1％SDS的Tris(pH 8.0)緩沖液中，于15℃持續(xù)浸泡攪拌24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次緩沖液；

(13)置于PBS中，在15℃漂洗2小時(shí)；

(14)在4℃下，于2N的NaOH水溶液中浸泡30分鐘；

(15)置于PBS中，在15℃漂洗2小時(shí)；

(16)置于乙醇(95％)水溶液與異丙醇(100％)的(體積比1:1)混合液中，15℃持續(xù)浸泡攪拌24小時(shí)，間隔8小時(shí)更換一次緩沖液；

(17)置于生理鹽水中漂洗，每隔2小時(shí)更換一次生理鹽水，共更換3～5次；

(18)將所得物放置在LABCONCO 6L Freeze Dry System凍干機(jī)中，-40℃冷凍4小時(shí)，-10℃凍干20小時(shí)；

(19)鈷源照射(15KGY)，密封保存。

由此，得到樣品1(牛)、樣品2(豬)和樣品3(羊)。

制備例2

使用牛的膀胱，如同制備例1進(jìn)行膀胱膜的制備，除其中步驟(5)與步驟(7)交換順序并且步驟(10)與步驟(12)交換順序外。得到 樣品4。

制備比較例

使用牛的膀胱，如同制備例1進(jìn)行膀胱膜的制備，除不進(jìn)行其中的步驟(3)和步驟(14)外。得到比較樣品1。

實(shí)施例1：膀胱膜的理化特性

樣品1～4和比較樣品1的外觀和理化性質(zhì)均相似，但是產(chǎn)品1～4在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應(yīng)更小。其中，樣品1的外觀如圖1所示。

(1)DNA含量：根據(jù)《中華人民共和國藥典》第三部附錄IX B規(guī)定方法檢測(cè)。

結(jié)果表明，樣品1～4和比較樣品1的DNA含量小于0.5wt％。

(2)脂肪含量：按GB/T 5009.3-2010第一法的規(guī)定方法進(jìn)行。

結(jié)果表明，樣品1～4和比較樣品1的脂肪含量小于0.5wt％。

(3)抗拉強(qiáng)度：使用上海傾技產(chǎn)的QJ212型抗拉強(qiáng)度試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行測(cè)定。

結(jié)果表明，樣品1～4和比較樣品1的抗拉強(qiáng)度為大于4MPa。

(4)標(biāo)準(zhǔn)膠原含量：按照羥脯氨酸含量測(cè)定法進(jìn)行

A.1采用BergmanⅠ和Loxley R方法檢測(cè)

A.2試劑

2.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(中科院上海生化所)1.6mmol/L：稱取20.98mg(0.02098g)羥脯氨酸，溶于0.001mol/L鹽酸溶液中，使總體積為100ml，4℃可保存數(shù)月。

2.2羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.08mmol/L)：移取上述儲(chǔ)備液5.00ml，用水稀釋至100ml。

2.3氧化劑溶液：

a.氯氨T水溶液：稱取7.0g氯氨T(SIGMA產(chǎn)，貨號(hào)SIAL-23270-50G)溶于100ml水中，貯存在棕色瓶中置于暗處，可保存1～2周。

b.醋酸－檸檬酸緩沖溶液(pH 6.0)：稱取醋酸鈉(3H₂O)57.0g，檸檬酸三鈉(2H₂O)37.5g，檸檬酸(H₂O)5.5g，加少量水溶解，再加入385ml異丙醇，用水稀釋至1000ml，此溶液可長期保存使用。

臨用前將(a)和(b)液按1：4體積混合，即得到氧化劑溶液，置于 棕色瓶中。

2.4艾氏試劑(顯色劑)：對(duì)二甲氨基苯甲醛(國藥產(chǎn)，貨號(hào)10008792)1.18mol/L,高氯酸(國藥產(chǎn)，貨號(hào)10015161)2.44mol/L,異丙醇0.74(體積分?jǐn)?shù))，臨用前配制，置于棕色瓶中。

2.56mol/l鹽酸溶液：取54ml鹽酸，用水稀釋至100ml。

2.66mol/l氫氧化鈉溶液：稱取24g氫氧化鈉，用水稀釋至100ml。

2.7甲基紅指示劑：取甲基紅(國藥產(chǎn)，貨號(hào)71025214)0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液7.4ml使之溶解，再加水稀釋至200ml。變色范圍pH 4.2～6.3(紅→黃)。

2.80.001mol/l鹽酸：9ml鹽酸稀釋至100ml得1mol/l鹽酸溶液。取1ml的1mol/l鹽酸溶液稀釋至1000ml。

A.3檢測(cè)方法

3.1樣品處理

取供試品0.1g，放入具塞試管(或安瓿)中，加入6mol/l鹽酸溶液10ml，封口后置135℃烤箱中水解4小時(shí)，冷卻后打開封口加入2滴甲基紅指示劑使之呈紅色，用6mol/l氫氧化鈉溶液中和該液至中性呈微黃色，然后用純化水稀釋至1000ml，過濾，作為樣品供試液。

3.2樣品測(cè)定

于帶塞的比色管中，加入0.5ml樣品供試液，加入0.5ml純化水，作為樣品溶液，再加入2ml異丙醇和1ml氧化劑溶液，搖勻，室溫放置4分鐘使其氧化。再加入2ml艾氏試劑，加塞搖勻，放入60℃水浴中加熱顯色，20分鐘后室溫放置1小時(shí)。用1cm比色皿，以純化水做參比液，在560nm處測(cè)定吸光度，并以試劑空白進(jìn)行校正。

A.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取0.00；0.20；0.40；0.60；0.80；1.00ml羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到6個(gè)比色管中，(羥脯氨酸濃度分別為0μmol/l；16μmol/l；32μmol/l；48μmol/l；64μmol/l；80μmol/l)不足1ml的用蒸餾水補(bǔ)至1ml，按上述步驟，測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)溶液中羥脯氨酸的含量在0～80μmol/L范圍內(nèi)時(shí)符合朗伯－比爾定律。羥脯氨酸最佳測(cè)定范圍為16～56μmol/L，吸光度相應(yīng)為0.2～0.7Abs，每微克羥脯氨酸可產(chǎn)生0.097的吸光度。(由于顯色劑、氧化劑是用前配制，每一次試驗(yàn)都需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。)

結(jié)果表明，樣品1～4和比較樣品1的標(biāo)準(zhǔn)膠原含量為大于85wt％。(5)縫合線撕裂力：參照QB/T 4198-2011撕裂力的測(cè)定。

結(jié)果表明，樣品1～4和比較樣品1的縫合線撕裂力大于10N。

(6)疏松層的孔徑大?。?/p>

在冷凍掃描電子顯微鏡(HITACHI S-3000N&Quorum PP3000T)下觀察樣品1～4和比較樣品1的疏松層，可看到其孔徑大小為約20～100μm，其中樣品1的顯微圖如圖2所示。該孔徑范圍可以使得細(xì)胞附著在其中，均勻生長。

(7)內(nèi)毒素含量：

內(nèi)毒素檢測(cè)方法：

浸提液的制備：使用注射水按0.1g/ml比例浸提樣品24小時(shí)，測(cè)試浸提液的內(nèi)毒素含量。

1、選擇所需規(guī)格(0.1ml)及靈敏度(0.25EU/ml)的鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究所，批號(hào)：250601-201174)及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(2ml/支，內(nèi)毒素含量低于0.003EU/m，湛江安度斯生物有限公司)。

2、取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)1支，用注射水溶解后稀釋至所需濃度備用。

3、取鱟試劑8支，2支作供試品檢查管，2支作陰性對(duì)照管，2支作陽性對(duì)照管，2支作供試品陽性對(duì)照管。

4、陰性對(duì)照管加入0.2ml檢查用水，其余各管加入0.1ml檢查用水；每支供試品檢查管另加入0.1ml樣品；陽性對(duì)照管加入0.1ml濃 度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；供試品陽性對(duì)照管加入0.1ml濃度為2λ內(nèi)毒素的樣品。

5、封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃恒溫器中孵育60±2分鐘，然后觀察結(jié)果。試管孵育期間應(yīng)避免任何震動(dòng)。

6、將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(+)；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

7、陰性對(duì)照管必須是陰性，陽性對(duì)照管、供試品陽性對(duì)照管必須是陽性，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。

結(jié)果表明，在各制備例樣品的浸提液中，內(nèi)毒素含量<0.5EU/ml，而在將制備比較例樣品同樣處理得到的浸提液中，內(nèi)毒素含量>2.5EU/ml。

實(shí)施例2：膀胱膜的細(xì)胞相容性

將樣品1包埋于大鼠皮下，2周后，取出包埋的膀胱膜材料，采用蘇木精(SIGMA-701)和伊紅(BioRY-DH0047)進(jìn)行HE染色。

圖3示出染色結(jié)果，未見炎癥反應(yīng)，即沒有見到類似免疫細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞出現(xiàn)。

實(shí)施例3：膀胱膜的修復(fù)功能

取5只比格犬，1周歲，雄性，對(duì)其膀胱做半切模型。然后，將樣品1的膀胱膜縫合在剩余的原膀胱上，其中膀胱膜比切除部分稍大一些，留出縫合空間，使得修復(fù)面積和切除面積基本一致。

6個(gè)月后，采用膀胱造影及膀胱尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)膀胱膜修復(fù)后的再生膀胱組織的功能。

對(duì)實(shí)驗(yàn)比格犬和未做實(shí)驗(yàn)的正常組比格犬(3只)靜脈注射造影劑，然后進(jìn)行造影。具體操作描述如下，靜脈推注碘油造影劑(2ml/kg)，馬上進(jìn)行X線連續(xù)拍片，觀察雙側(cè)腎臟及輸尿管顯影情況。膀胱開始顯影后，逆行插入8F尿管，向膀胱內(nèi)注射造影劑，同時(shí)觀察膀胱顯影情況。

圖4示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，0min顯示兩組均未看到陽性結(jié)石影像；3min可見造影劑排出，說明輸尿管排泄通暢，未見明顯梗阻；7min可見造影劑順利進(jìn)入膀胱。膀胱造影顯示，相比于正常組，實(shí)驗(yàn)組比格犬的膀胱形態(tài)基本正常，無明顯結(jié)石、憩室、占位。

此外，按照如下步驟，對(duì)兩組比格犬進(jìn)行膀胱尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：

1.尿道外口插入尿動(dòng)力檢測(cè)管；

2.排空比格犬膀胱內(nèi)尿液，同時(shí)往肛門內(nèi)插入腹壓檢測(cè)管；

3.壓力調(diào)零后與Nidoc 970A⁺尿動(dòng)力學(xué)分析儀相連接；

4.啟動(dòng)檢測(cè)，灌注速度20ml/min，當(dāng)尿道外口剛有生理鹽水溢出時(shí)，標(biāo)記為膀胱的最大容量；

6.儀器自動(dòng)記錄壓力/容積曲線；

7.分析曲線，記錄膀胱最大容量、逼尿肌最大壓力、順應(yīng)性等指標(biāo)。

圖5的圖表示出結(jié)果，使用樣品1膀胱膜對(duì)比格犬的大面積損傷的膀胱進(jìn)行修復(fù)后，修復(fù)后的膀胱形態(tài)接近正常水平，恢復(fù)效果明顯。其中，圖5A示出兩組比格犬的膀胱最大體積，圖5B示出膀胱的最大壓力，圖5C示出膀胱的順應(yīng)性，順應(yīng)性反映出膀胱的彈性，是體積和壓力的比值。

在以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之后，處死比格犬，暴露其膀胱組織。觀察膀胱外部結(jié)構(gòu)，可發(fā)現(xiàn)，在膀胱膜縫合6個(gè)月后，再生的膀胱組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯疤痕組織，形狀與正常膀胱組織相似，且無尿液滲漏，手感有彈性，具有儲(chǔ)尿功能。

將再生的膀胱組織取下，用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備厚5μm的病理學(xué)切片。經(jīng)HE染色后，觀察再生組織的微觀結(jié)構(gòu)。圖6示出染色結(jié)果，在再生組織中，大部分膀胱膜材料已降解，可見膀胱組織各層的再生，包括粘膜層、肌層和漿膜層。膀胱組織的收縮能力源于其肌層具有豐富的平滑肌組織，經(jīng)膀胱膜修復(fù)后的再生膀胱組織具有明顯的束狀平滑肌組織的再生，與正常膀胱組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)十分類似。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的膀胱膜具有明顯促進(jìn)膀胱組織再生的修復(fù)效果。

為進(jìn)一步鑒定膀胱平滑肌組織的再生，對(duì)10μm的冰凍切片進(jìn)行膀胱平滑肌特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的免疫熒光染色， 具體步驟如下：

1.冰凍切片室溫晾15min；

2.PBS(pH7.4)浸泡10min；

3.血清(中杉金橋產(chǎn)羊血清工作液，貨號(hào)ZLI-9022)室溫封閉30min；4.加入一抗(ABCAM產(chǎn)，貨號(hào)ab119952，1:500稀釋)4℃過夜；

5.第二天，切片PBS清洗5min×3次；

6.血清室溫封閉15min；

7.加入熒光二抗(invitrogen產(chǎn)貨號(hào)A-21202，1:500稀釋)，室溫60min

8.PBS清洗5min×3次

9.封片

10.觀察

圖7示出染色結(jié)果，膀胱膜在修復(fù)6個(gè)月后，膀胱平滑肌組織再生明顯，且其結(jié)構(gòu)與正常膀胱平滑肌組織類似。圖中較亮的點(diǎn)為α-SMA特異性陽性纖維，稍暗的點(diǎn)為細(xì)胞核。

之后，對(duì)10μm的冰凍切片進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31的熒光染色，具體步驟同上，其中一抗為ABCAM產(chǎn)，貨號(hào)ab26975，1:500稀釋，二抗為invitrogen產(chǎn)，貨號(hào)A-21202，1:500稀釋。

圖8示出染色結(jié)果，在新生的膀胱組織中，有明顯的血管生成(圖中圓圈為血管)。

從以上結(jié)果看來，本發(fā)明的膀胱膜可以作為膀胱修復(fù)膜使用，由于膀胱與尿道、輸尿管細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)相似，因此本發(fā)明的膀胱膜還可以用于其他組織的再生引導(dǎo)，如尿道、輸尿管等。