本發(fā)明涉及一種有序的生物修復(fù)材料及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，具有高度的致殘性。如今，中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)被證明是可能的，然而常規(guī)的手術(shù)手段只能使這些傷者中的極少數(shù)人徹底康復(fù)。多項研究表明，脊髓內(nèi)部微環(huán)境不適合是造成脊髓再生能力十分有限的主要原因。脊髓損傷后在很短的時間內(nèi)，在受損部位形成了空洞和疤痕，在這樣一個不利的環(huán)境下，軸突即使能夠生長，也很難逾越這樣的一個障礙。目前，對于脊髓損傷，應(yīng)用生物支架來橋接損傷兩側(cè)的脊髓，結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)因子或藥物或干細(xì)胞，從而促進(jìn)軸突再生是一個重要的治療策略。在制備用于神經(jīng)再生的生物支架材料時，材料的取向性非常重要，因為脊髓神經(jīng)纖維(軸突)的生長是有方向的。目前，神經(jīng)損傷修復(fù)材料主要由化學(xué)合成的材料制成，它們往往細(xì)胞相容性不好，容易引起免疫排斥問題。

此外，肌腱損傷是最常見的運動損傷，損傷機(jī)率高，致殘率也高。肌腱損傷后，若未予以及時修復(fù)，常會導(dǎo)致肢體功能障礙，重者甚至殘廢。對于較嚴(yán)重的肌腱損傷往往需要手術(shù)干預(yù)，對于缺損性肌腱損傷往往需要植入修復(fù)體，如：自體肌腱、同種異體肌腱、異種肌腱或人工肌腱。前三者由于移植體來源有限或者排異反應(yīng)等諸多原因，不能滿足臨床治療需求，因此開發(fā)人工肌腱具有重要現(xiàn)實意義。肌腱獨特的生物力學(xué)性能主要歸因于肌腱細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的高度組織性。細(xì)胞外基質(zhì)主要由I型膠原蛋白構(gòu)成，肌腱中的ECM呈等級束狀且分不同層面平行地排列在基質(zhì)蛋白中，棱形的肌腱成纖維細(xì)胞(也稱肌腱細(xì)胞)呈縱向排列且大量鞘樣細(xì)胞延伸至細(xì)胞外基質(zhì)。I型膠原可以誘導(dǎo)肌腱胞外基質(zhì)的形成增加410％。因此，基于膠原的并有一定取向性的材料是用于肌腱損傷修復(fù)的良好材料。

牛的肌肉表面存在一層保護(hù)組織，通常稱為筋膜，屬于肌腱的延伸部分，其主要成分與肌腱一樣，由I型與III型膠原纖維構(gòu)成。這種材料具有平行排列的纖維狀結(jié)構(gòu)，如圖1所示，有可能作為一種合適的神經(jīng)導(dǎo)向材料和肌腱修復(fù)材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明涉及一種制備有序修復(fù)材料的方法，其包括：

(1)使筋膜在氫氧化鈉溶液中處理；

(2)使所得物在去污劑溶液中處理；

(3)使所得物干燥。

在實施方式中，筋膜可以取自哺乳動物，例如牛、羊、馬等，優(yōu)選為牛。筋膜是新鮮的筋膜。

在實施方式中，在步驟(1)之前，除去筋膜組織上粘附的組織，例如肌肉組織等。在實施方式中，還包括在步驟(1)之前去除筋膜組織中的脂肪。

在實施方式中，氫氧化鈉溶液可以是氫氧化鈉的水溶液。氫氧化鈉溶液的濃度可以是約2～5N，例如約2N、3N、4N或5N。步驟(1)可以在約4℃～16℃進(jìn)行，例如約4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或16℃。此外，步驟(1)可以進(jìn)行約30分鐘至300分鐘，例如約30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘、150分鐘、300分鐘等。在步驟(1)中，可以更換新的氫氧化鈉溶液，例如更換2～4次新的氫氧化鈉溶液。

在實施方式中，步驟(2)中的去污劑可以是化學(xué)去污劑，例如吐溫-80、吐溫-20、TritonX-100等。去污劑溶液的濃度可以是約1～5％，例如約1％、2％、3％、4％、5％等。去污劑的溶液可以是去污劑的水溶液、緩沖液溶液等，其中緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液等。

在實施方式中，在步驟(3)之前，對所得物進(jìn)行充分清洗。其中，可以用去熱源水對材料進(jìn)行清洗；也可以用其他水例如蒸餾水、去離子水進(jìn)行清洗。

在實施方式中，在步驟(3)中，可以采用低溫干燥使所得物干燥，例如冷凍真空干燥等。在所得物干燥之后，可以進(jìn)行滅菌，例如輻照滅菌等。

另一方面，本發(fā)明提供由上述方法制備得到的有序修復(fù)材料，其為線性膠原纖維。該線性膠原纖維包含I型膠原纖維和III型膠原纖維，其保留有天然膠原纖維的結(jié)構(gòu)，并可以根據(jù)需要聚集成不同直徑的束狀，也可以修剪成任意形狀和長度。此外，這些線性纖維具有利于細(xì)胞貼附的粗糙表面，并具有良好的生物相容性和生物可降解性。而且，在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應(yīng)更小。

再一方面，本發(fā)明提供本文有序修復(fù)材料作為組織修復(fù)材料的用途。

在實施方式中，本發(fā)明的有序修復(fù)材料可以用于組織的修復(fù)，尤其是神經(jīng)和肌腱的修復(fù)。

本發(fā)明以天然筋膜為基礎(chǔ)，用NaOH處理結(jié)合常見的去污劑處理，即可以以簡單的處理工藝在短時間內(nèi)得到有序排列的線性膠原纖維。NaOH處理可以有效殺滅細(xì)菌和病毒，并且減少最終產(chǎn)品的排異反應(yīng)。這些線性膠原纖維保持有天然膠原纖維的結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)需要構(gòu)成任意長度的片狀或任意直徑和長度的束狀。此外，這些線性膠原材料具有可以引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等在膠原纖維方向上生長的有序方向性、利于細(xì)胞粘附的粗糙纖維表面、應(yīng)用于有機(jī)體的良好的生物相容性和生物可降解性。因此，本發(fā)明的線性膠原纖維可以用作組織修復(fù)材料，特別是用作神經(jīng)修復(fù)材料和肌腱修復(fù)材料。

附圖說明

圖1示出天然牛筋膜的平行排列的纖維狀結(jié)構(gòu)。

圖2A示出根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的線性膠原纖維的宏觀外觀圖，其中圖下方為cm尺，可見纖維長為約7cm，圖2B示出根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的線性膠原纖維的掃描電鏡圖。

圖3A示出大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在普通培養(yǎng)平皿中的軸突生長方向，圖3B示出大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的線性膠原纖維上的軸突生長方向，圖3C示出大鼠小腦顆粒細(xì)胞在根 據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的線性膠原纖維上的生長情況，其中各圖中的標(biāo)尺均為200μm。

圖4A示出大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的線性膠原纖維上的生長情況，圖4B示出人成纖維細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明示例性實施方式的線性膠原纖維上的生長情況，其中各圖中的標(biāo)尺均為200μm。

具體實施方式

天然筋膜的結(jié)構(gòu)緊密，成分較為復(fù)雜，不適合細(xì)胞的貼附和生長，而且有引起機(jī)體免疫排斥的風(fēng)險。

本發(fā)明通過氫氧化鈉消蝕與去污劑處理的結(jié)合，除去筋膜中的細(xì)胞成分并保留細(xì)胞外基質(zhì)，得到具有有序結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性和良好的生物可降解性的線性膠原纖維。而且，這種線性膠原纖維在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應(yīng)更小。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，氫氧化鈉和去污劑均可以起到脫細(xì)胞的作用，但強(qiáng)度不同。去污劑例如吐溫-80、TritonX-100的處理較為柔和，一般不破壞細(xì)胞外基質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和成分，但是處理時間較長，且會損失一部分細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白。而NaOH的作用更為劇烈，但是由于比較容易洗去，沒有在最終產(chǎn)品上的殘留問題，對修復(fù)的組織和細(xì)胞沒有毒性。兩種處理的結(jié)合可以較好地去除筋膜的抗原性，并保留其I型和III型膠原纖維，主要保留I型膠原纖維。比起單獨去污劑的處理，NaOH的在先處理可以有效殺滅細(xì)菌和病毒，并且減少最終產(chǎn)品的排異反應(yīng)。由于NaOH成本低廉，且有上述效果，使得本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)于傳統(tǒng)方法得到的產(chǎn)品。具體地，本發(fā)明提供一種制備有序修復(fù)材料的方法，其包括：

(1)使筋膜在氫氧化鈉溶液中處理；

(2)使所得物在去污劑溶液中處理；

(3)使所得物干燥。

筋膜可以是取自哺乳動物，例如牛、羊、馬等的新鮮筋膜。由于來源較為便利且價廉，而處理后得到的材料沒有免疫原性，因此本發(fā)明的修復(fù)材料可以大量應(yīng)用于臨床。

所使用的氫氧化鈉溶液為氫氧化鈉的水溶液，濃度可以是約2～5N，例如約2N、3N、4N或5N。當(dāng)氫氧化鈉的濃度小于2N時，脫細(xì)胞效果不好，而當(dāng)濃度大于5N時，對膠原材料的物理性能具有一定破壞作用。步驟(1)可以在約4℃～16℃的低溫下進(jìn)行，優(yōu)選為約10℃。此外，步驟(1)可以進(jìn)行30～300分鐘，并且優(yōu)選在此過程中更換新的氫氧化鈉溶液，例如更換2～4次新的氫氧化鈉溶液。延長的處理時間和溶液的更新可以使處理效果更好，即更好地去除細(xì)胞成分。

在步驟(2)中，去污劑的選擇要考慮其強(qiáng)度以及其殘留對所得材料應(yīng)用的影響。經(jīng)測試，吐溫-80、吐溫-20、TritonX-100可以用在本發(fā)明中，并具有良好的效果。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，這幾種去污劑可以替換使用。去污劑的濃度在約1～5％的范圍內(nèi)，濃度過低會使處理效果變差，而濃度過高會影響材料的性能。此外，去污劑的處理時間和溫度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定。

在步驟(3)中，可以采用低溫干燥對所得物進(jìn)行干燥。低溫真空干燥可以除去所得物中的水分和溶液殘留，完好保持筋膜處理后剩余部分的結(jié)構(gòu)。低溫干燥可以通過例如冷凍真空干燥的方法，在冷凍干燥儀中進(jìn)行。

如果本發(fā)明方法的所得物要用于醫(yī)療用途，需要對所得物進(jìn)行充分清洗，并進(jìn)行殺菌消毒。其中，可以用去熱源水對材料進(jìn)行清洗；也可以用其他水例如蒸餾水、去離子水進(jìn)行清洗并輻照殺菌。其中，去熱源水為不含熱源物質(zhì)的水。去熱源水的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，如用超濾膜、反滲透、層析等方法處理水等而得到。

使用本發(fā)明方法制備得到的有序修復(fù)材料是線性膠原纖維。該線性膠原纖維保留有天然膠原纖維的結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)要求隨意聚集成不同直徑的束狀，也可以修剪成任意長度，方便用于任意大小和任意部位的組織修復(fù)。

本發(fā)明的線性膠原纖維還具有方向性。這種方向性對于神經(jīng)纖維和肌腱成纖維細(xì)胞的生長尤其重要。其中，神經(jīng)纖維(軸突)的方向性是準(zhǔn)確有效傳送神經(jīng)脈沖的基礎(chǔ)，而本領(lǐng)域人員已知肌腱的成纖維細(xì)胞呈縱向排列。本發(fā)明的線性膠原纖維不僅給神經(jīng)纖維和肌腱成纖維細(xì)胞的生長提供支持，還可以與藥物等結(jié)合使用來促進(jìn)兩種細(xì)胞的 生長。

另外，本發(fā)明的有序修復(fù)材料具有良好的生物相容性。本發(fā)明的有序修復(fù)材料由I型和III型天然膠原蛋白構(gòu)成，主要為I型膠原蛋白，沒有免疫原性，因此可以應(yīng)用到組織修復(fù)中。在損傷的脊髓中，本發(fā)明的膠原材料可以搭接損傷脊髓的兩側(cè)，為軸突的生長提供支持，并且可以結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)因子或藥物等促進(jìn)神經(jīng)再生。而本發(fā)明神經(jīng)纖維的粗糙表面，有利于細(xì)胞的貼附。此外，已經(jīng)證實，肌腱的獨特生物力學(xué)性能主要歸因于肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的高度組織性，而本發(fā)明的有序修復(fù)材料中包含的I型膠原可以誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的形成增加410％。

目前用于組織損傷修復(fù)的膠原生物材料，主要從酸溶的膠原制備，工藝復(fù)雜，步驟較多，而且主要以無序的管狀和膠原凝膠為主。本發(fā)明的加工方法，以機(jī)體天然筋膜為基礎(chǔ)，利用獨特的處理工藝，開發(fā)出可用于脊髓和肌腱損傷修復(fù)的新材料，其對細(xì)胞具有良好相容性，免疫原性低。更重要的是，這種材料可以使神經(jīng)元或肌腱再生種子細(xì)胞沿著膠原纖維的方向有序生長，這對于肌腱及脊髓損傷的修復(fù)非常重要。因此，本發(fā)明的有序修復(fù)材料具有很好的臨床應(yīng)用前景。

以下提供本發(fā)明的具體實施例，實施例僅為示例說明本發(fā)明，而并不限制本發(fā)明的范圍。

制備例.線性膠原纖維的制備

1.取新鮮帶有白色筋膜的成年牛的肌肉組織，用10℃去離子水沖洗3遍；

2.用鑷子和手術(shù)刀分離出筋膜，盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織；

3.將外層的脂肪、附著的肌肉血管組織去除后，用氫氧化鈉水溶液處理(氫氧化鈉的摩爾濃度、溫度和處理時間見以下表格)；

4.更換新的氫氧化鈉溶液(摩爾濃度、溫度和處理時間與上一步保持一致)，該步驟重復(fù)次數(shù)見以下表格；

5.用去污劑溶液(去污劑的種類、濃度和溶劑見以下表格)在16℃下處理60分鐘；

6.用去熱源水對材料進(jìn)行充分清洗；

7.將材料用冷凍干燥儀凍干。

參照以下表格，按照上述步驟進(jìn)行線性膠原纖維的制備。

在步驟1中采用來自成年羊的肌肉組織，如上進(jìn)行制備例14～26；在步驟1中采用來自成年馬的肌肉組織，如上進(jìn)行制備例27～36。

制備比較例.僅使用去污劑制備線性膠原纖維

1.取新鮮帶有白色筋膜的成年牛的肌肉組織，用10℃去離子水沖洗3遍；

2.用鑷子和手術(shù)刀分離出筋膜，盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織；

3.將外層的脂肪、附著的肌肉血管組織去除后，用5％的吐溫-20水溶液在16℃下處理60分鐘；

4.用去熱源水對材料進(jìn)行充分清洗；

5.將材料用冷凍干燥儀凍干。

得到比較樣品1。

實施例1.線性膠原纖維的形態(tài)觀察

對各個制備例和制備比較例得到的樣品進(jìn)行形態(tài)觀察?？梢钥吹剑鱾€制備例和制備比較例中得到的線性膠原纖維均可以聚集成束狀，如圖2A所示，其長度和束狀直徑可以隨意調(diào)節(jié)，并且呈現(xiàn)出方向性。之后，通過掃描電鏡來觀察制備例和制備比較例的膠原纖維，其中圖2B示出本發(fā)明制備例13膠原纖維的其中一根的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)線狀膠原纖維具有有序結(jié)構(gòu)，其粗糙的表面結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的貼附。

實施例2.線性膠原纖維的內(nèi)毒素含量測定

盡管制備例和制備比較例得到的樣品在形態(tài)上沒有差別，但是制備例得到的產(chǎn)品在細(xì)菌和病毒殺滅方面更徹底，且排異反應(yīng)更小。在各制備例樣品的浸提液中，內(nèi)毒素含量<0.5EU/ml，而在將制備比較例樣品同樣處理得到的浸提液中，內(nèi)毒素含量>2.5EU/ml。

內(nèi)毒素檢測方法：

浸提液的制備：使用注射水按6cm²/ml比例浸提材料24小時，測試浸提液的內(nèi)毒素含量。

1、選擇所需規(guī)格(0.1ml)及靈敏度(0.25EU/ml)的鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究所，批號250601-201174)及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(2ml/支，內(nèi)毒素含量低于0.003EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)。

2、取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)1支，用水溶解后稀釋至所需濃度備用。

3、取鱟試劑8支，2支作供試品檢查管，2支作陰性對照管，2支作陽性對照管，2支作供試品陽性對照管。

4、陰性對照管加入0.2ml檢查用水，其余各管加入0.1ml檢查用水；每支供試品檢查管另加入0.1ml樣品；陽性對照管加入0.1ml濃度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；供試品陽性對照管加入0.1ml濃度為2λ內(nèi)毒素的樣品。

5、封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃恒溫器中孵育60±2分鐘，然后觀察結(jié)果。試管孵育期間應(yīng)避免任何震動。

6、將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°時，若管內(nèi)形成凝膠，且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為(+)；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。 保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。

7、陰性對照管必須是陰性，陽性對照管、供試品陽性對照管必須是陽性，否則實驗結(jié)果無效。

實施例3.神經(jīng)元在線性膠原纖維上的生長

分離SD大鼠的背根神經(jīng)節(jié)，分別接種在普通平皿或本發(fā)明制備例13的線性膠原纖維上。

具體而言，在解剖顯微鏡下暴露E15胎鼠的椎管和椎間孔，用鑷子將脊髓連帶兩旁的神經(jīng)節(jié)一起取出，用顯微鑷逐個摘除神經(jīng)節(jié)。用0.25％(vol/vol)的胰蛋白酶(Sigma，SH3004201B，溶于PBS緩沖液)37℃消化30min，用約2ml血清(invitrogen，10099141)終止反應(yīng)。300目篩網(wǎng)過濾，1000rpm離心5min收集細(xì)胞。PBS(pH 7.4)清洗一遍后，離心收集，用適量DMEM/F12完全培養(yǎng)液(invitrogen,11330032)吹打成單細(xì)胞懸液，分別接種在普通平皿或本發(fā)明制備例13的線性膠原纖維上。接種后放在二氧化碳培養(yǎng)箱(品牌和型號：HERAcell 150i)中培養(yǎng)(37℃，5％CO₂)。

接種7天后，在顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)球的生長情況。如圖3A所示，普通平皿中背根神經(jīng)節(jié)球的軸突四散分布，而在本發(fā)明的線性膠原纖維上，背根神經(jīng)節(jié)的軸突沿著膠原纖維的方向有序分布，如圖3B所示。

此后，如下所述制備出大鼠的小腦顆粒細(xì)胞。出生一周的SD大鼠，延顱骨中縫打開顱骨，分離小腦置于冷的PBS(pH 7.4)中。將分離腦組織的腦膜和血管剝離干凈。剪碎腦組織至1mm³的小塊。將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)移至2mL 0.25％(vol/vol)的胰酶(Sigma，SH3004201B，溶于PBS緩沖液)中，37℃消化15分鐘，加入100微升胰酶抑制劑(invitrogen，17075-029)終止消化。5分鐘后再加入4mL的DMEM/F121:1基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用玻璃滴管將組織吹散，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，向剩余的沉淀物中加入4mL的新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)吹打，轉(zhuǎn)移上清后再吹打一次。將收集的所有上清和沉淀合并在一起，用40μm的濾膜(BD,352340)過濾。將濾后的液體于500g離心5分鐘，去除上清，將沉淀用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基(含2％B27的DMEM-F12)(B27，invitrogen,17504044；DMEM-12，invitrogen,11330032)重懸，計數(shù)后接種至添 加有本發(fā)明制備例13的線性膠原纖維的包被有多聚賴氨酸(sigma，P0899)的培養(yǎng)皿上。

具體而言，將所得的大鼠小腦顆粒細(xì)胞以5×10⁴/mm³的密度接種在本發(fā)明的線性膠原纖維上。接種后放在二氧化碳培養(yǎng)箱(品牌和型號：HERAcell 150i)中培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。

2天后，可以看到，神經(jīng)元細(xì)胞沿線性膠原纖維的纖維方向生長，呈現(xiàn)出很好的有序性，如圖3C所示。

實施例4.大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞及人成纖維細(xì)胞在線性膠原纖維上的生長

如下所述制備出大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞。選取出生后4周的SD大鼠，脫臼處死，75％酒精浸泡5min，在無菌條件下取出雙側(cè)脛骨、股骨，然后清除兩端骨骺及軟組織，在暴露出骨髓腔后，把無血清L-DMEM培養(yǎng)液(HYCLONE，SH3002101B)作為沖洗液，用無菌注射器反復(fù)沖洗骨髓至透明為止，然后將所得的沖洗液裝入15mL離心管；1000rpm離心5min，棄上清。用10mL無血清L-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過濾成單細(xì)胞。使用血球計數(shù)板計數(shù)，細(xì)胞以1×10⁶/mL接種于含10％血清的L-DMEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于5％CO₂濃度，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。24h半量換液，48h全量換液，然后每3天進(jìn)行培養(yǎng)液的更換。當(dāng)細(xì)胞增殖并逐漸融合到90％時，用0.25％的胰酶進(jìn)行消化傳代，然后以1×10⁶/mL的密度，在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)。

如下制備得到人成纖維細(xì)胞。將人包皮組織用PBS溶液漂洗三次，洗去組織表面附著的血細(xì)胞；將包皮組織置于PBS的培養(yǎng)皿中，用眼科剪去除皮膚內(nèi)表面附著的皮下組織；再將包皮組織置于新的盛有PBS的3.5cm培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織剪成1mm³的組織塊；1000rpm離心2min；用1ml DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,11330032)重懸組織塊，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶(Corning，430639)中，用Pasteur管(Fisher，13-678-20A)使組織塊均勻分布，并小心吸出多余培養(yǎng)基；將T25培養(yǎng)瓶倒置，放置于37℃培養(yǎng)箱中；約20～24h后，將T25培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，加入1～1.5ml培養(yǎng)基；隔日換液，約3～7日后可見細(xì)胞從組織塊周圍爬出；約10～14日后可進(jìn)行傳代(0.25％TE消化)。

取生長狀態(tài)良好的大鼠MSC細(xì)胞(P3代)或人成纖維細(xì)胞(P5代)，0.25％胰酶消化后，將細(xì)胞離心后重懸于約1ml DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,11330032)中，接種于制備例13的線性膠原纖維上。置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中放置4～5h，加入適量DMEM培養(yǎng)基，以淹沒線性膠原纖維為宜。之后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2天后，可以在顯微鏡下觀察到，大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(圖4A)和人成纖維細(xì)胞(圖4B)在本發(fā)明的線性膠原纖維上沿材料纖維方向良好生長，如圖4所示。