一種治療糖尿病的中藥制劑及其制備方法和檢測方法與流程
本發(fā)明涉及一種治療糖尿病的中藥制劑(糖寧通絡(luò)片)及其制備方法，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是嚴重危害人類健康的常見多發(fā)病，目前我國的糠尿病患者逐年增多，已經(jīng)超過了兩千多萬人，全世界的糖尿病患者已經(jīng)超過了一億人，已然，糖尿病已經(jīng)成為一個世界性問題。糖尿病死亡率僅次于惡性腫瘤及心血管疾病，是危及人類生命的第三大疾病。
數(shù)千年來我國在治療糖尿病方面，積累了豐富的經(jīng)驗。近年來，已經(jīng)有不少治療糖尿病的中藥配方申請了發(fā)明專利，例如申請?zhí)枮?01010259466.5公開的“根治糖尿病的藥物及其制備方法”、申請?zhí)枮?01110346174.X公開的“一種治療2型糖尿病胰島素抵抗的中藥”、申請?zhí)枮?01110048889.7公開的“一種治療2型糖尿病胰島素抵抗的藥物”等。但是這些現(xiàn)有的降糖藥效果并不顯著，沒有達到很好的治療效果。因而需要人們繼續(xù)挖掘中藥材資源，研制更為有效的藥物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種治療糖尿病的中藥制劑及其制備方法，所述的中藥制劑降糖效果顯著，可以取得更好的治療效果。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種治療糖尿病的中藥制劑，按重量份計算，它的活性成分由以下原料藥制備而成：
科夭羅曲400～550份 車前草300～400份 仙鶴草300～400份 山銀花300～400份。
前述的治療糖尿病的中藥制劑中，優(yōu)選的，按重量份計算，它由以下原料藥制備而成：
科夭羅曲480份 車前草350份
仙鶴草335份 山銀花335份。
前述的治療糖尿病的中藥制劑中，所述的科夭羅曲，按重量份計算，由藥材新鮮瓜蔞2份、新鮮雞血藤2份和新鮮垂盆草1份所組成的混合物經(jīng)壓榨取汁后，藥渣的干燥細粉再與麥粉2份、麩皮1份混合，加入藥汁，經(jīng)曲制進行酵解而成。
前述的治療糖尿病的中藥制劑中，優(yōu)選的，所述的藥渣的干燥細粉與麥粉和麩皮的混合物，加入藥汁攪勻制成軟材，蒸透，保持溫度為18～26℃、濕度為45％～65％，添加曲精發(fā)酵20天～30天，取出，干燥，粉碎，即得科夭羅曲。
前述的治療糖尿病的中藥制劑中，前述科夭羅曲的制備方法中，加入全部藥汁的同時也可以加入水。
前述的治療糖尿病的中藥制劑中，所述的科夭羅曲，按重量份計算，由藥材新鮮瓜蔞2份、新鮮雞血藤2份和新鮮垂盆草1份所組成的混合物經(jīng)壓榨取汁后，藥渣的干燥細粉再與麥粉2份、麩皮1份混合，加入藥汁，經(jīng)曲制進行酵解而成。
前述的治療糖尿病的中藥制劑中，所述的科夭羅曲由藥材新鮮瓜蔞、新鮮冬瓜皮、垂盆草以2：2:1的重量比混合；干燥后，粉碎成細粉，再以該細粉：麥粉：麩皮＝5：2：1的重量配比混勻，加入藥汁，同時加水?dāng)噭蛑瞥绍洸模敉?，保持溫度?8～26℃、濕度為45％～65％，添加曲精發(fā)酵20～30天，取出，干燥，粉碎，即得。
前述的治療糖尿病的中藥制劑的制備方法，，按重量份計算，稱取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花，加6～10倍量水，浸泡30～120分鐘，煎煮1～2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6～10倍量水煎煮1～2小時，過濾；合并兩次濾液，濾過，濃縮，干燥，粉碎，加入輔料，制成相應(yīng)的中藥制劑，即得。
前述的治療糖尿病的中藥制劑的制備方法，優(yōu)選的，所述的制備方法包括：按重量份計算，稱取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加8倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6倍量水煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.2～1.3的清膏，于溫度55～75℃、真空度0.08～0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，加入輔料，制成相應(yīng)的中藥制劑，即得。
前述的治療糖尿病的中藥制劑的制備方法，更優(yōu)選的，所述的制備方法包括：按重量份計算，稱取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加8倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6倍量水煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.2的清膏，于溫度65℃、真空度0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，整粒，加入干膏總重的0.37％的二氧化硅，混勻，裝入膠囊，即得膠囊劑。
前述中藥制劑制得的片劑，還包括活性成分重量1％-5％的填充劑、活性成分重量10％-20％的崩解劑、物料量40-60％且濃度為10-15％的粘合劑、物料量0.1-0.5％潤滑劑。所述的物料量40-60％的粘合劑是指粘 合劑的量為活性成分加入填充劑、崩解劑后的物料總量的40-60％；所述的物料量0.1-0.5％的潤滑劑是指潤滑劑的量為活性成分加入填充劑、崩解劑、粘合劑后的物料總量的0.1-0.5％。
前述中藥制劑制得的片劑，所述的填充劑為預(yù)膠化淀粉，所述的崩解劑為羧甲基淀粉或/和微晶纖維素，所述的粘合劑為淀粉漿，所述的潤滑劑為二氧化硅或/和硬脂酸鎂。
前述中藥制劑制得的片劑，所述的崩解劑按重量份包括1-3份羧甲基淀粉和10-20份微晶纖維素；所述的潤滑劑按重量份包括1-5份二氧化硅和1-5份硬脂酸鎂。
前述中藥制劑制得的片劑，還包括活性成分重量1.67％的羧甲基淀粉鈉、活性成分重量2.9％的預(yù)膠化淀粉、活性成分重量15.67％的微晶纖維素、物料量55％且濃度為12％的淀粉漿、物料量0.16％的二氧化硅和硬脂酸鎂，其中二氧化硅：硬脂酸鎂的重量比為1：1。
前述片劑的制備方法，取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花四味，加水浸泡30分鐘，煎煮兩次，第一次2小時，第二次1小時，合并煎液，濾過，濃縮，干燥成干膏；粉碎，過100目篩，加羧甲基淀粉鈉、預(yù)膠化淀粉及微晶纖維素，制粒，干燥，整粒，加入潤滑劑混合均勻，壓制成1000片，包薄膜衣，即得。
前述片劑的制備方法，稱取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加8倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6倍量水煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.2的清膏，于溫度65℃、真空度0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，整粒，過100目篩，加入干膏總重1.67％的羧甲淀粉鈉，2.9％的預(yù)膠化淀粉，15.67％的微晶纖維素，用物料量55％的、且濃度為12％的淀粉漿為粘合劑制粒，取出濕顆粒于65～75℃干燥，干顆粒用二號篩整粒后，加入物料量0.16％的1：1的二氧化硅和硬脂酸鎂作潤滑劑混合均勻，壓片，包薄膜衣，即得。
前述片劑的檢測方法，(1)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取1.3g，加入10ml的甲醇超聲30分鐘過濾，取濾液5ml，加入少量的鎂粉，滴加12～14滴濃鹽酸，水浴1～2分鐘，溶液變?yōu)榧t紫色。
(2)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取3.8g，加95％乙醇50ml，回流提取2小時，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液。另取木犀草苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液3.5μl、對照品溶液1μl，分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7：3：1：1.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱10分鐘，放冷，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(3)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取2.6g，加95％乙醇50ml，回流提取2小時，濾過，濾液濃縮至10ml，作為供試品溶液。另取大車前苷對照品，加60％甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液2μl、對照品溶液2μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7：3：1：1.2)為展開劑，展開，展距為5cm，取出，在60℃加熱10分鐘，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(4)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取2.6g，加甲醇30ml，回流提取3小時，濾過，濾液濃縮至10ml，作為供試品溶液。另取異綠原酸A對照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液2μl、對照品溶液1μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7：3：1：1.2)為展開劑，展開，展距為5cm，取出，在60℃加熱10分鐘，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
【檢查】應(yīng)符合片劑項下有關(guān)的各項規(guī)定(《中國藥典》2010年版一部附錄I D)
【浸出物】照浸出物測定法(《中國藥典》2010年版附錄ⅩA浸出物測定法熱浸法)測定，本品水溶性浸出物不得低于25.0％。
【性狀】本品為薄膜衣片，除去包衣后應(yīng)顯棕色至棕褐色，氣微，味苦。
為了確保本發(fā)明的效果，本申請人進行了一系列實驗來選擇本發(fā)明提供的藥物制劑的制備工藝，保證科學(xué)、合理、可行。具體如下：
實驗例1：劑型的選擇
本品由科夭羅曲、車前草、仙鶴草、山銀花四味藥組成，是結(jié)合苗醫(yī)長期臨床運用的經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上，以辯病與辯證相結(jié)合，根據(jù)“從脾論治糖尿病”的治療方法和“兩病兩綱”的苗醫(yī)理論，糖尿病及并發(fā)癥屬內(nèi)冷外熱癥，需熱冷兼顧用藥以確立治法，進行選藥組方的。方中科夭羅曲碳為苗醫(yī)特有，具益氣健脾、生津消渴之效，調(diào)理脾胃，益液充盈為熱藥，入冷經(jīng)，屬主藥；仙鶴草收斂止血，截瘧，止痢，解毒；車前草清熱利尿，祛痰，涼血，解毒；山銀花疏風(fēng)解毒，和胃生津；后三味均屬冷藥入熱經(jīng)，共為輔藥；諸藥 伍用，共奏固本養(yǎng)陰、化濁通脈、生津止渴之功效。膠囊劑與片劑相比較，膠囊劑不加壓力，所以藥物在胃腸道崩解快，從而顯效快，吸收好；另外，膠囊不透光，對光敏感的藥物及遇濕熱不穩(wěn)定的藥物，裝入膠囊后，可保護藥物不受濕氣和空氣中的氧以及光線的影響，從而可提高其穩(wěn)定性。因此，在盡量保留中藥傳統(tǒng)煎煮后湯劑直接服用的特點上，考慮用膠囊的劑型，并在其中盡可能少的加輔料來進行工藝研究。
實驗例2：制備工藝研究
為使處方中藥材的成份盡量提取出來，以出膏率為考察指標，對藥材的炮制長度、加水量，浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數(shù)分別進行考察，其結(jié)果如下：
(1)處方中藥材的炮制長度對出膏率的影響
將車前草、仙鶴草炮制成不同長度，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，用10倍量水將藥材浸潤30分鐘，煎煮2次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮，進行出膏率測定，結(jié)果見表1：
表1藥材炮制長度對出膏率的影響
由表1可知：藥材粗粉的出膏率最高，但藥材粗粉提取后藥液難于過濾，實驗時所用機械的方法榨干藥渣，并不適于大工業(yè)生產(chǎn)；而切制成1.0cm段的出膏率與其相近，故將車前草、仙鶴草切制成1.0cm段進行提取為佳。
(2)浸泡時間對出膏率的影響
將車前草、仙鶴草炮制成1.0cm段，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，用10倍量水將藥材浸潤不同時間，煎煮2次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮，進行出膏率測定，結(jié)果見表2所示：
表2不同浸泡時間對出膏率的影響
由表2可知：不同的浸泡時間，對藥材的出膏率影響不大，從節(jié)約時間和成本考慮，以浸潤30分鐘為佳。
(3)不同的加水量、煎煮時間和提取次數(shù)對出膏率的影響
將車前草、仙鶴草炮制成1.0cm段，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，用不同的加水量，浸泡30分鐘，用不同的煎煮時間和提取次數(shù)提取，過濾，濾液，濃縮，進行出膏率測定，具體以下表3中的方案進行考察，試驗結(jié)果如表4所示：
表3不同的提取方案
表4不同提取方案對浸膏收率的影響
由表3、表4可知：處方藥材提取2次，第一次加8倍量水浸泡30分鐘，煎煮2小時，第二次加6倍量水煎煮1小時后，浸膏收率幾乎不再增加，從節(jié)約能源和時間成本考慮，以車前草、仙鶴草炮制成1.0cm段，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，煎煮2次，第一次用8倍量水將藥材浸潤30分鐘，煎煮2小時；第二次用6倍量水煎煮1小時，過濾，合并濾液的工藝為佳。
所述的出膏率測定的具體方法為：取濃縮至相對密度為1.2～1.3(測定溫度60℃)的清膏，轉(zhuǎn)移并定容至1000ml容量瓶中，搖勻；精密量取20ml，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣于105℃干燥3小時，取出，置干燥器中放置30分鐘，稱重，計算。
(4)濃縮及干燥工藝研究
粗提液試驗中采用濾過(300目濾布)法進行，為防止有效成分長時間受熱破壞，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)條件，采用三效減壓濃縮設(shè)備進行濃縮。結(jié)果顯示：合并的濾液減壓濃縮成相對密度為1.2～1.3的清膏，測量溫度為60℃；同時干燥條件為：溫度55～75℃，真空度0.08～0.1Mpa時效果最好。
(5)潤滑劑及用量的篩選
將干燥后的浸膏打粉過60目，直接填充膠囊，發(fā)現(xiàn)粉末的流動性太差，影響裝量，故考慮加入潤滑劑。經(jīng)過預(yù)實驗，得出用二氧化硅作潤滑劑效果最佳；以粉末流動性為考察指標，對二氧化硅的加入量進行考察，結(jié)果如表5所示：
表5二氧化硅的加入量試驗考察結(jié)果
由表5可知：二氧化硅的加入量為原料藥總量的0.27％時，粉末流動性一般，加入總量的0.37％及總量的0.47％時，粉末流動性均較好，從節(jié)省成本方面考慮，以加入總量0.37％的二氧化硅為最佳選擇。
(6)科夭羅曲的制備方法研究：
研究表明，科夭羅曲采用以下方法制備效果較好：
按配比稱取藥材新鮮瓜蔞、新鮮雞血藤和新鮮垂盆草，壓榨取汁，備用；將藥渣干燥后，粉碎成細粉；按配比稱取麥粉和麩皮，將麥粉和麩皮與藥渣細粉混勻，加入藥汁和水?dāng)噭蛑瞥绍洸?，蒸透，保持溫度?8～26℃、濕度為45％～65％，添加曲精發(fā)酵20～30天，取出，干燥，粉碎，即得。
科夭羅曲的制備方法中：
一、
1、發(fā)酵曲胚排列間隔：3-4cm(側(cè)掌桿下自如)；
2、發(fā)酵培養(yǎng)起點溫度23-25℃(夏季越低越好)；
3、入房培養(yǎng)要求稻草視季節(jié)而定，冬季：墊和蓋達3公分厚；夏季：墊和蓋達2公分厚；
4、發(fā)酵培養(yǎng)，品溫最高時達56℃(后三天要根據(jù)氣候適當(dāng)排潮)；
5、上小墻要求為正長方行，高度4-7層；
6、后期發(fā)酵培養(yǎng)溫度28-30℃，并做好通風(fēng)；
7、發(fā)酵完畢，上大墻高度6-8層。
二、發(fā)酵管理：
1、前發(fā)酵2-3天內(nèi)，保溫、保水，使其正常發(fā)酵；
2、發(fā)酵中期4-7天內(nèi)，通風(fēng)排潮得當(dāng)，保持曲胚表面濕度，不干燥、開裂；
3、翻曲上、下?lián)Q面，如溫度過高，拉開曲胚之間的距離。
三、關(guān)鍵工序：
1、前期培菌：
隨著季節(jié)和室溫的不同，曲胚升溫也有所不同，夏季升溫快些，冬季慢些，當(dāng)隨著溫度逐漸上升，曲房水汽增大，潮濕悶熱，曲房溫度升到30-45℃，曲胚表面有菌絲(呈現(xiàn)白色斑點時，應(yīng)勤加檢查，并根據(jù)室內(nèi)溫度、濕度情況，進行排潮)。若曲胚表面水份已蒸發(fā)到一定程度，且?guī)в玻徽呈郑纯蛇M行翻曲，其方法是將曲塊底部翻到上面，四周的翻至中間，中間的翻至四周，根據(jù)季節(jié)確定曲塊的距離，并蓋好一層稻草，關(guān)閉門窗保溫。
2、中期管理：
①翻曲后，關(guān)閉門窗，曲房溫度會逐漸上升，當(dāng)溫度上升到45-50℃以上時(視中、高溫曲而定)進行第二次翻曲，翻完后關(guān)閉門窗。
②當(dāng)溫度又繼續(xù)上升到35-45℃時，要打開門窗，并要排潮，調(diào)節(jié)溫度，溫度降到30℃時(夏季以室溫為準)進行第二次翻曲。
③根據(jù)升溫情況，曲胚的干燥程度，翻曲4-6次；每翻一次，上小墻后曲塊高一層，當(dāng)曲房升溫基本結(jié)束時，有明顯曲香氣味時，曲塊已基本成熟。
3、后期管理：
視季節(jié)不同，當(dāng)曲房溫度逐漸降至10-35℃時，可以上大墻，即把基本成熟的曲塊逐漸集中堆放在一間房內(nèi)，要求擺實、靠緊(地面要加墊板)。整個發(fā)酵時間在16-25天，要求內(nèi)無積濕、長霉好、水分≤20.0％；儲存三個月以后使用，理化指標：水分≤14.0％。
另外，對于科夭羅曲：
檢查：水分不得過9.0％(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅨH第一法)；酸不溶性灰分不得過1.0％(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅨK)；
性狀：為不規(guī)則細粉或細小顆粒狀腐熟物，表面灰白色至微黃色，粗糙，質(zhì)脆易碎，氣香；
性味與歸經(jīng)：甘、辛，溫；歸脾、胃經(jīng)；
功能與主治：益氣健脾，生津消渴，調(diào)理脾胃，益液充盈。用于口渴喜飲、多食、多尿、消瘦、氣短、體倦乏力；
用法與用量：3～6g；
貯藏：置陰涼干燥處，防蛀。
實驗例3：對本發(fā)明的治療糖尿病的膠囊制劑的物理性質(zhì)研究
①性狀：以3批制劑樣品為依據(jù)描述劑型顏色、外形、氣味等，如表6所示：
表6三批樣品的性狀描述
結(jié)論：通過對三批樣品的形狀描述，說明該藥品的性狀穩(wěn)定，確定本藥品的性狀為硬膠囊；除去囊殼后顯棕色至棕褐色，味苦。
其中，科夭羅曲的性狀如表7所示：
表7
②堆密度：稱取一定重量合格顆粒，裝入10ml量筒中，以一定高度落下數(shù)次(盡可能控制條件一致)，使松緊適度，以重量除以容積得堆密度，結(jié)果如表8所示：
表8顆粒堆密度測定結(jié)果
③休止角的測定：取合格顆粒經(jīng)漏斗流下并呈圓錐體狀，測定其休止角，結(jié)果如表9所示：
表9顆粒休止角測定結(jié)果
由表9可知：顆粒的休止角低于45.0°，具有良好的流動性，適合于填充膠囊的要求。
④顆粒的臨界相對濕度測定，如表10、表11所示，臨界相對濕度測定曲線如圖3所示：
表10不同溶液的相對濕度表
表11臨界相對濕度測定數(shù)據(jù)
由圖3的吸濕曲線可求得，臨界相對濕度約為58％；結(jié)合生產(chǎn)，在打粉、混合、填充及貯存時應(yīng)將相對濕度控制在55％以下，以減少水分對藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性的影響。
實驗例4：中試生產(chǎn)試驗
按照本發(fā)明的制備工藝，進行中試規(guī)模的工藝試驗，共投料3批，三批中試產(chǎn)品檢測數(shù)據(jù)如表12所示，檢驗結(jié)果如表13所示：
表12三批中試試驗數(shù)據(jù)
表13三批試制樣品檢驗結(jié)果
進行三批次中試生產(chǎn)的驗證，如表12、表13，結(jié)果表明：本發(fā)明的治療糖尿病的中藥制劑的工藝是合理的、可行的。
實驗例5：浸出物測定
本品未含有毒性藥材，含量測定確有一定難度，根據(jù)《貴州省醫(yī)療機構(gòu)制劑技術(shù)評審要點-中藥民族藥》(試行)增加該項目的測定，測定方法依據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩA浸出物測定法熱浸法予以測定，測試3批中試樣品浸出物含量，結(jié)果見下表14：
表14本發(fā)明3批中藥制劑的浸出物測定
故將本品水溶性浸出物含量暫定為不低于50.0％。
實驗例6：藥效學(xué)試驗
一、本發(fā)明的中藥制劑對db/db自發(fā)性糖尿病小鼠的影響
1.儀器與試藥
1.1本發(fā)明的中藥制劑
本發(fā)明的中藥制劑(批號：20130401，規(guī)格：0.3g/粒，相當(dāng)于1.5g生藥/粒，人用量為每次3粒，每 日3次，由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司提供)。
試驗設(shè)3個劑量組：低劑量組(4倍臨床等效劑量)1.8g/kg、中劑量組(8倍臨床等效劑量)3.6g/kg、高劑量組(16倍臨床等效劑量)7.2g/kg，動物給藥體積為0.1ml/10g體重；故藥物配制濃度分別為7.2g/kg/10ml＝0.72g/ml，3.6g/kg/10ml＝0.36g/ml，1.8g/kg/10ml＝0.18g/ml。
配制方法：膠囊每粒為0.3g，故每次分別取24、12、6粒，加蒸餾水配制成10ml待用。
2.2鹽酸二甲雙胍片
鹽酸二甲雙胍片由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)(批號：1303107)；適應(yīng)癥：高胰島素血癥、2型糖尿病。用法用量：通常本品(鹽酸二甲雙胍片)的起始劑量為0.5克，每日2次，一日用藥量為1g。人體重按照60kg計算，折算成動物給藥劑量為120mg/kg；動物給藥體積為0.1ml/10g體重；故藥物配制濃度為120mg/kg/10ml/kg＝12mg/ml。
配制方法：片劑規(guī)格為0.5g，故每次取1粒，加蒸餾水配制成41.70ml待用。
2.3.試劑與儀器
葡萄糖，購自北京化工廠(批號：20121205)；血脂四項CHO(批號：120971)，TG(批號：125161)，HDL(批號：120331)，LDL(批號：120411)，試劑盒購自日立高科技貿(mào)易(上海)有限公司；小鼠胰島素ELISA試劑盒(批號：13061201)，購自美國Crystal Chem公司；穩(wěn)豪型血糖試紙(批號：3462320)和穩(wěn)豪型血糖儀，購自強生(上海)醫(yī)療器材有限公司；酶標儀，購自帝肯(上海)公司；日立7080全自動生化儀，購自日本日立株式會社；電子天平，購自梅特勒托利多儀器(上海)有限公司。
3.動物與飼養(yǎng)條件
3.1試驗動物：SPF級自發(fā)性糖尿病小鼠模型C57BL/KsJ-db/db小鼠(簡稱db/db小鼠)，6～8周齡，體重45～55g，雄性；由中國科學(xué)院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。
3.2飼養(yǎng)條件：在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動物中心進行動物飼養(yǎng)，動物實驗設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標準。主要環(huán)境指標的控制范圍：室溫20～26℃，日溫差≤4℃；相對濕度40％～70％；最小換氣次數(shù)15次/小時；光照明：暗＝12h，明＝12h。動物飼養(yǎng)于標準盒內(nèi)，每盒5只，其飼養(yǎng)空間符合中華人民共和國國家標準GB14925-2010中關(guān)于實驗動物所需最小空間的規(guī)定。所有動物均由培訓(xùn)合格的人員進行飼養(yǎng)管理，整個飼養(yǎng)過程中保持動物飲食活動自由。
3.3檢疫及馴化過程：新領(lǐng)到的動物檢疫期3～5天。在檢疫期間觀察動物飲水、攝食和健康狀況，以及是否存在疾病和死亡征兆。健康動物皮毛光滑、反應(yīng)靈敏、無異常分泌物等。發(fā)現(xiàn)任何異常現(xiàn)象都需向?qū)ｎ}負責(zé)人和臨床獸醫(yī)報告，在獸醫(yī)指導(dǎo)下、經(jīng)專題負責(zé)人確認，剔除有病的動物、用健康動物進行代替。確認動物健康無病，方能使用。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后方可進行試驗。
4試驗方法
4.1對db/db小鼠空腹血糖的影響
同周齡C57/BL雄性小鼠為空白對照組，25只雄性db/db小鼠隨機分為5組，6-8周齡，試驗分別為模型組、鹽酸二甲雙胍組、本發(fā)明中藥制劑高劑量組、本發(fā)明中藥制劑中劑量組、本發(fā)明中藥制劑低劑量組，共5組，每組5只。均給予標準顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)14d后，血糖值超過13.9mmol/L后開始給予藥物干預(yù)，各組灌胃給藥，每日1次，灌胃體積0.1ml/10g，連續(xù)給藥35天，其中空白對照組和模型組每天灌胃0.1ml/10g的飲用水。動物禁食不禁水5h后，用全自動血糖儀測定小鼠尾靜脈血血糖值，給藥期間，每周測定一次。
4.2對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響
同周齡C57/BL雄性小鼠為空白對照組，25只雄性db/db小鼠隨機分為5組，分別為模型組、鹽酸二甲雙胍組、本發(fā)明中藥制劑高劑量組、本發(fā)明中藥制劑中劑量組、本發(fā)明中藥制劑低劑量組，共5組，每組5只。均給予標準顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)14d后，血糖值均超過13.9mmol/L后開始給予藥物干預(yù)，各組灌胃給藥，每日1次，灌胃體積0.1ml/10g，連續(xù)給藥35天，其中空白對照組和模型組每天灌胃0.1ml/10g的飲用水。動物禁食不禁水，5h后，2.5g/kg葡萄糖灌胃后0min，30min，60min，90min，120min用全自動血糖儀測定尾靜脈血血糖值。
4.3對db/db小鼠血清胰島素水平的影響
給藥和處理同上4.2，動物禁食不禁水，5h后測定空腹血糖和糖耐量之后，動物麻醉，腹主動脈采血500μL，3500rpm離心15min，取上清，胰島素ELISA試劑盒檢測血清胰島素。
4.4對db/db小鼠血脂四項CHO，TG，HDL，LDL的影響
給藥和處理同上4.2，動物禁食不禁水，5h后測定空腹血糖和糖耐量之后，動物麻醉，腹主動脈采血500μL，3500rpm離心15min，取上清，全自動生化儀檢測血脂四項。
5實驗結(jié)果
5.1對db/db小鼠一般狀態(tài)的影響
與C57/BL對照組比較，db/db模型組體型肥胖，體重顯著增加，活動減少，其他狀態(tài)如毛色，飲食無變化；與db/db模型比較，二甲雙胍和本發(fā)明中藥制劑對db/db小鼠體型、活動、毛色、飲食無顯著性改變。本發(fā)明中藥制劑組體重偏輕，但無統(tǒng)計學(xué)差異。
5.2對db/db小鼠空腹血糖的影響
結(jié)果表明，給予藥物處理1周后，與模型組比較空腹血糖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異；給予藥物處理2周后，與模型組比較空腹血糖有降低的趨勢，本發(fā)明中藥制劑高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異。給予藥物處理4周后，陽性藥物和本發(fā)明中藥制劑組與模型組比較空腹血糖均有統(tǒng)計學(xué)差異，本發(fā)明中藥制劑組劑量與降糖效果存在量效關(guān)系；給予藥物處理5周后，陽性藥物和本發(fā)明中藥制劑組與模型組比較空腹血糖均有統(tǒng)計學(xué)差異，本發(fā)明中藥制劑組劑量與降糖效果存在量效關(guān)系。本發(fā)明中藥制劑高劑量組在給藥2周后與模型組空腹血糖有差異，中、低劑量組在給藥4周后與模型組空腹血糖有差異。高劑量組在給藥2周后血糖值接近正常(低于13.9mmol/L)，此后空腹血糖一直維持在此水平。低劑量組隨著給藥時間的延長，降糖效果逐漸加強，在第四周與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表15：
表15二甲雙胍和本發(fā)明的中藥制劑對db/db小鼠空腹血糖的影響(mmol/L，n＝5)
*，p＜0.05；**，p＜0.01，和同時間點db/db模型組比較。
5.3對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響
結(jié)果表明，與C57正常對照組比較，模型組不同時間點的血糖均顯著升高。給藥組服用葡萄糖后各時間點血糖值均升高，與模型組比較有降低趨勢，均但無統(tǒng)計學(xué)差異，見表16：
表16二甲雙胍和本發(fā)明的中藥制劑對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響(不同時間點血糖值，mmol/L，n＝5)
*，p＜0.05，與正常對照組比較。#，p＜0.05；##，p＜0.01，與模型組比較。
與C57正常對照組比較，模型組服用葡萄糖后血糖-時間曲線下面積(AUC)均顯著升高。與模型組 比較，給藥組服用葡萄糖后血糖-時間曲線下面積(AUC)降低，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，見表17：
表17二甲雙胍和本發(fā)明的中藥制劑對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響(曲線下面積，AUC，min·mmol/L，n＝5)
*，p＜0.05，與正常對照組比較；#，p＜0.05；##，p＜0.01，與模型組比較。
5.4對db/db小鼠血清胰島素的影響
結(jié)果表明，與C57正常對照組比較，db/db小鼠模型組血清胰島素下降，但沒有顯著性差異，與db/db小鼠模型組比較，給藥組可以增加血清胰島素，但沒有顯著性差異，見表18：
表18二甲雙胍和本發(fā)明的中藥制劑對db/db小鼠血清胰島素的影響(n＝5)
5.5對db/db小鼠血脂四項的影響
結(jié)果表明，與C57正常對照組比較，db/db小鼠模型組CHO下降，TG升高趨勢明顯，但沒有顯著性差異；與db/db小鼠比較，給藥組TG下降趨勢明顯，沒有顯著性差異；其他指標變化不明顯，見表19：
表19二甲雙胍和本發(fā)明的中藥制劑對血脂四項的影響(n＝5)
6.結(jié)論
給予藥物處理5周后，與模型組比較，陽性藥物和本發(fā)明中藥制劑組空腹血糖顯著降低；本發(fā)明中藥制劑組劑量與降糖效果存在量效關(guān)系。本發(fā)明中藥制劑高劑量組在給藥2周后，與模型組比較，空腹血糖顯著降低；中、低劑量組在給藥4周后空腹血糖顯著低于模型組。高劑量組在給藥2周后空腹血糖值接近正常(低于13.9mmol/L)，此后空腹血糖一直維持在此水平。低劑量組隨著給藥時間的延長，降糖效果逐漸顯現(xiàn)，在第四周空腹血糖顯著低于模型組。在此模型(db/db)上，本發(fā)明中藥制劑表現(xiàn)出降糖和改善糖耐量的效果，較高劑量較早出現(xiàn)降糖效果，低劑量給藥一定時間(4周)也表現(xiàn)出較好的降糖效果，該藥物表現(xiàn)出現(xiàn)持續(xù)的降糖作用。本發(fā)明中藥制劑對db/db小鼠血清胰島素、血脂四項的影響試驗中，對血清胰島素有升高趨勢，TG有降低趨勢，由于動物數(shù)量較少，與db/db小鼠模型比較，本發(fā)明中藥制劑的效果無顯著性差異。
通過上述試驗結(jié)果初步證明本發(fā)明的中藥制劑具有較好的降血糖作用，高劑量組略優(yōu)于二甲雙胍組，同時對于糖耐量有顯著的改善作用；因而該中藥制劑具有較好的開發(fā)前景。
二、本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠降糖作用的實驗研究
1.材料與方法
1.1材料
1.1.1動物 清潔級雄性SD大鼠，體重150～180g，購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號SCXK(渝)，2012-0006。
1.1.2藥品及試劑
1.1.2.1本發(fā)明的中藥制劑：由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司提供(以下簡稱TNTL)，成人臨床劑量為0.045g/kg,大鼠等效劑量與人換算為7倍人用臨床劑量。臨用時將中藥制劑的內(nèi)容物(褐色粉末)取出用純水配制。試驗時大鼠TNTL低劑量組為0.63g/kg(二倍臨床劑量)，高劑量組為1.26g/kg(四倍臨床劑量)。
1.1.2.2鏈脲佐菌素(Streptozotocin STZ)，北京博奧拓達科技有限公司，批號：040M1367。
1.1.2.3大鼠胰島素試劑盒：Manufactured by Mercodia AB，Sylveniusgatan 8A,SE-754 50 Uppsala，Sweden。批號：20518，用時按說明書操作。
1.1.2.4大鼠C肽試劑盒：上海藍基科技有限公司，批號：20130617。用時按說明書操作。
1.1.2.5二甲雙胍：為天安牌鹽酸二甲雙胍腸溶片,成人臨床劑量為每日0.03g/kg，換算為大鼠等效量0.21g/kg。
1.1.2.6普通飼料，購于重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司。
1.1.2.7高脂高糖飼料制作：白砂糖、豬油、雞蛋均購于超市，雞蛋煮熟只用蛋黃，普通飼料打碎成粉。飼料配方：每100g高脂飼料中含普通飼料35g(重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司)，豬油15g、白砂糖25g、雞蛋黃25g、飼喂動物20天。
1.2動物分組及給藥方法
1.2.1預(yù)先給予TNTL對Ⅱ型糖尿病大鼠的影響試驗：大鼠分為3組，分別為正常組、模型組、TNTL組。正常組給予普通飼料，模型組和TNTL組高脂高糖飼料喂養(yǎng)，同時TNTL組每天灌胃給予本發(fā)明的中藥制劑(0.63g/kg，1次/天)，20天后，模型組和TNTL組腹腔注射STZ(臨用時以檸檬酸鹽緩沖液配制，pH值4.2，30mg/kg，在30分鐘內(nèi)完成注射)，制造糖尿病模型，篩選出造模成功的大鼠用普通飼料喂養(yǎng)12天(TNTL組全程給藥32天)。
1.2.2TNTL對2型糖尿病大鼠的影響試驗：大鼠分成5組，正常組、模型組、二甲雙胍組、TNTL低劑量組、TNTL高劑量組。正常組給予普通飼料，其他4組高脂高糖飼料喂養(yǎng)20天后造模(同上)，造模成功的大鼠改用普通飼料喂養(yǎng)，同時各組開始給藥，2次/d，上、下午各1次。二甲雙胍組ig 0.21g/kg，TNTL低劑量ig 0.63g/kg，(二倍臨床劑量)，TNTL高劑量ig 1.26g/kg(四倍臨床劑量)。全程給藥27天。
1.2.3TNTL與西藥聯(lián)合使用對2型糖尿病大鼠和正常大鼠的影響試驗：大鼠分成4組，正常組、模型組、二甲雙胍+TNTL低劑量組、正常+TNTL高劑量組。正常組和正常+TNTL高劑量組給予普通飼料，模型組、二甲雙胍+TNTL低劑量組高脂飼料喂養(yǎng)20天后造模(同上)，篩選造模成功的大鼠改用普通飼料喂養(yǎng)，同時各組開始給藥，2次/d，上、下午各1次。二甲雙胍+TNTL低劑量組先給二甲雙胍27天(ig，0.21g/kg)，然后換成TNTL低劑量(ig，0.63g/kg，二倍臨床劑量)21天。正常+TNTL高劑量組給TNTL高劑量(ig，1.26g/kg，四倍臨床劑量)21天。
1.3檢測方法及儀器
1.3.1胰島素、C肽均用ELISA法檢測，檢測儀器Biotek Synergy 2熒光酶標儀，美國Biotek公司產(chǎn)品。
1.3.2血糖檢測儀及試紙：美國羅氏產(chǎn)品，ACCU-CHEK Pertorma。
1.4病理切片檢查大鼠空腹16小時后，斷頭處死，取胰腺置于中性甲醛液中固定保存，做病理檢測。該項檢測在貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科完成。根據(jù)胰腺被損傷后的萎縮程度將其分成正常和萎縮，按每組萎縮和正常的只數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)(卡方)檢驗處理。
1.5統(tǒng)計方法：使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表達，計數(shù)資料以百分比表達，組后計量資料以T檢驗比較，計數(shù)資料以卡方檢驗比較。
2.結(jié)果
2.1預(yù)先給予TNTL對Ⅱ型糖尿病大鼠的影響
2.1.1糖耐量：大鼠空腹16小時后，給予葡萄糖溶液(灌胃，20g/100mL,3mL/只)，測定大鼠的空腹、1h、2h、3h血糖值，結(jié)果見表20、圖4：
表20預(yù)先給本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠糖耐量的影響
注：與正常組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01
由表20、圖4可知，TNTL組3h的血糖值明顯低于模型組(P<0.05),其他兩時間點亦有降低。
2.1.2胰腺組織病理切片檢查
病理檢測結(jié)果提示，預(yù)先給TNTL組較模型組胰腺病理損傷明顯減輕。見表21、圖5-圖7：
表21預(yù)先給本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠胰腺的影響(單位：只)
注：與正常組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05
2.2TNTL對2型糖尿病大鼠的影響
2.2.1體重
TNTL可顯著改善糖尿病大鼠降低的體重，結(jié)果見表22、圖8：
表22本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠體重的影響
注：與正常組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01
2.2.2糖耐量
大鼠空腹16小時后，給予葡萄糖溶液(灌胃，20g/100mL,3mL/只)，使用羅氏血糖儀測定空腹、1h、2h、3h血糖值。結(jié)果見表23、圖9：
表23本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠糖耐量的影響
注：與正常組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01
由表23、圖9可知，各組大鼠的空腹血糖沒有顯著差異，TNTL低劑量和高劑量各時間點的血糖值均低于模型組，差異有顯著意義(p<0.01)，但是與正常組尚有差異。中藥TNTL低劑量組與中藥TNTL高劑量組間無顯著性差異。
2.2.3胰島素和C肽
大鼠空腹16小時后，取血離心取上清，使用大鼠胰島素ELISA試劑盒(Mercodia)、大鼠C肽ELISA試劑盒(BluGene),檢測450nm波長處的OD值，結(jié)果見表24：
表24本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠空腹胰島素、C肽的影響
注：與正常組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01
由表24所示，模型組的胰島素顯著低于正常組，TNTL高、低劑量組胰島素較模型組有增加趨勢，但仍明顯低于正常組。C肽結(jié)果顯示，模型組有所降低，TNTL高、低劑量組較模型組有輕度增高趨勢。
2.2.4胰腺病理檢查
采集胰腺置于中性甲醛液中固定保存，病理切片檢查，結(jié)果見表25、圖10-圖14：
表25本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病胰腺的影響(單位：只)
注：與正常組比較，*p<0.05；與模型組比較，#p<0.05
2.3 TNTL與二甲雙胍聯(lián)合使用對2型糖尿病大鼠的影響
2.3.1糖耐量：
大鼠空腹16小時后，給予葡萄糖溶液(灌胃，20g/100mL,3mL/只)，測定大鼠的空腹、1h、2h、3h血糖值。結(jié)果見表26、圖15：
表26聯(lián)合用藥對2型糖尿病大鼠糖耐量的影響
注：與正常組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01
由表26、圖15可知，二甲雙胍+TNTL低劑量組空腹血糖顯著低于模型組，正常+TNTL高劑量組與正常組糖耐量值沒有差異，說明該TNTL對正常血糖值沒有影響。
2.3.2胰腺病理檢查
采集胰腺置于中性甲醛液中固定保存，做病理檢測，結(jié)果見表27、圖16-圖19：
表27聯(lián)合用藥對大鼠胰腺病理切片檢查的影響(單位：只)
注：與正常組比較，*p<0.05
該項試驗前3組做比較，結(jié)果二甲雙胍+TNTL低劑量組對大鼠胰島有一定保護作用，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。正常+TNTL高劑量組與正常組比較，兩組間沒有差異性，高劑量的TNTL對正常大鼠胰腺沒有影響。
結(jié)論：
本實驗用雄性SD大鼠，以高熱卡飼喂加半量鏈脲佐菌素部分破壞胰島B細胞的經(jīng)典方法，成功地構(gòu)建了2型糖尿病大鼠模型。
本研究發(fā)現(xiàn)，無論是以預(yù)先給藥的方法還是常規(guī)治療給藥的方法，無論是單獨給藥的方法還是與二甲雙胍聯(lián)合給藥的方法，無論是以糖耐量觀察還是以常規(guī)血糖觀察，TNTL皆能明顯降低2型糖尿病大鼠血糖(P值均<0.05),表明TNTL具明顯降糖作用。
本研究還發(fā)現(xiàn)，TNTL作用于2型糖尿病大鼠后，在血糖明顯降低的同時，其空腹胰島素和C肽并無明顯改變，提示此降糖作用機制不一定是胰島B細胞促泌作用，可能與改善胰島素抵抗(IR)等因素有關(guān)。
本研究觀察了TNTL作用后的胰腺病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)其萎縮數(shù)明顯低于未經(jīng)TNTL作用的模型組(P<0.05)，表明TNTL對2型糖尿病大鼠具一定程度的胰島保護作用。
本研究將TNTL作用于正常SD大鼠，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常SD大鼠的血糖在TNTL作用前后無變化，其胰腺亦無病理變化，表明TNTL對正常大鼠無血糖影響，對其胰島亦無明顯影響。此結(jié)果也進一步提示TNTL的降糖作用可能不是主要通過促進胰島B細胞分泌胰島素來實現(xiàn)的。
實驗例7：急性毒性試驗
1.1藥物
本發(fā)明的中藥制劑，由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司提供，批號：20130106。臨用時用蒸餾水配制成所需濃度的混懸液灌胃給藥。
1.2動物
昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(渝)2012-0003。
1.3飼料
飼料為全價顆粒飼料，由上述單位提供。
1.4動物實驗場所
貴陽中醫(yī)學(xué)院藥理毒理實驗室通風(fēng)良好，清潔衛(wèi)生，溫度、濕度均達到新藥藥理研究要求。
1.5主要儀器
ALC-210.3型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司。
1.6統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)采用組間比較差異性，以表示，進行t檢驗。
2實驗方法與結(jié)果
2.1預(yù)試試驗
以最大濃度23％的本發(fā)明的中藥制劑水溶液，0.3ml/10g體重一次灌胃給予小鼠，觀察7天。結(jié)果：未見動物死亡，表明不能測定其LD50，故測定本發(fā)明的中藥制劑的最大給藥量。
2.2正式試驗
取昆明種小鼠40只，隨機分成空白對照組、本發(fā)明的中藥制劑組，每組20只，雌雄各半。實驗前禁食不禁水12h，本發(fā)明的中藥制劑組灌胃給予小鼠23％的本發(fā)明的中藥制劑水溶液0.3ml/10g體重，一日二次，相當(dāng)于13.8g/kg體重，為臨床擬用劑量0.0345g/kg體重的400倍；空白對照組以相同量的生理鹽水灌胃，一日二次。給藥后連續(xù)觀察14d，記錄動物有無毒性反應(yīng)以及實驗前后體重變化，以不產(chǎn)生死亡的劑量為最大給藥量。
結(jié)果：昆明種小鼠灌胃本發(fā)明的中藥制劑水溶液13.8g/kg后，發(fā)育健康，肌肉豐滿，被毛密而有光澤，眼睛明亮而靈活、無異常的分泌物，肛周潔凈，攝食正常，四肢健壯，自發(fā)活動正常，觀察期內(nèi)體重逐漸增加，與空白對照組比較無明顯差異。14d內(nèi)未見動物死亡及毒副反應(yīng)。實驗結(jié)束時肉眼尸解未見明顯病理改變。實驗結(jié)果見表28：
表28本發(fā)明的中藥制劑對小鼠體重(g)的影響(n＝10)
注：本發(fā)明的中藥制劑組雌性與空白對照組雌性比較P>0.05；本發(fā)明的中藥制劑組雄性與空白對照組雄性比較P>0.05。
結(jié)論：昆明種小鼠灌胃本發(fā)明的中藥制劑，以最大濃度0.23g/ml，給藥容積0.3ml/10g體重，一日二次給藥，相當(dāng)于13.8g/kg體重，為臨床擬用劑量的400倍。根據(jù)文獻報道“一般認為按體重計算小鼠的最大耐受量相當(dāng)于人用量100倍以上則較安全”，因此，可以認為本發(fā)明的中藥制劑對動物的急性毒性甚小，安全，可以提供臨床試用；此外，發(fā)明人還對本發(fā)明的中藥制劑進行了長期毒性試驗，試驗結(jié)果也表明本發(fā)明的中藥制劑毒性較小，臨床使用較安全。
實驗例8長期毒性試驗
1.目的
觀察較大劑量、較長時間、連續(xù)給予大鼠重復(fù)灌胃本發(fā)明的中藥制劑12周、24周及停藥4周對大鼠所產(chǎn)生毒性反應(yīng)，嚴重程度及首先出現(xiàn)的癥狀；觀察毒性反應(yīng)的靶器官恢復(fù)和發(fā)展情況，確定無毒反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供依據(jù)。
2.實驗材料
2.1藥物
本發(fā)明的中藥制劑，由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司提供，批號：20130106。功能主治：養(yǎng)陰通脈、生津止渴、清熱瀉火。用于氣陰兩虛所致的消渴病，癥見口渴喜飲、多食、多尿、消瘦、氣短、乏力、眠差、腰痛、手足心熱；2型糖尿病見上述證候者。劑型：膠囊劑。用法用量：口服，一日3次，一次3-4粒；飯前服用。規(guī)格：每粒膠囊重0.3g，相當(dāng)于生藥量1.73g。成人體重按照60kg計算，則臨床擬定成人日用量為0.0345g/kg體重，相當(dāng)于0.19895g生藥量/kg體重。
臨用時用蒸餾水配制成所需濃度的混懸液灌胃給藥。
2.2動物
SD大鼠，雌雄各半，120只，體重100g±20g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(渝)2012-0003。
2.3主要儀器
JY601型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；OLYMPUS BH-2顯微鏡，日本；SC-970全自動血 細胞分析儀，瑞士貝肯公司；日立7170A全自動生化分析儀，美國柯達；HPIAS-1000高清晰度彩色圖文病理分析系統(tǒng)、光鏡。
2.4實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計
實驗數(shù)據(jù)以表示，進行組間t檢驗。
3實驗方法
3.1實驗條件
給藥前后的大鼠均單性別每籠5只群養(yǎng)，以全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫20℃～23℃，濕度55％～65％。給藥前先適應(yīng)環(huán)境，觀察7天大鼠一般狀況，無異常變化，再開始分組給藥進行試驗。
3.2分組和劑量
SD大鼠120只，雌雄各半，隨機分為4組，每組30只，分別作為本發(fā)明的中藥制劑高、中、低三個劑量組及空白對照組。給藥組劑量分別為2.07g、1.035g、0.5175g/kg體重，給藥濃度分別為20.7％、10.35％、5.175％，即為該制劑擬定臨床成人日用劑量0.0345g/kg體重的60倍、30倍、15倍。給藥容積為10ml/kg體重。
3.3給藥途徑及方法
因為本發(fā)明的中藥制劑臨床給藥途徑是口服給藥，所以各組動物均灌胃給藥。每日上午8-10時灌胃給藥一次，給藥容積為10ml/kg體重，連續(xù)24周；每天觀察動物一般狀況，每周記錄各組動物體重及進食量一次，根據(jù)動物體重增長變化，調(diào)整給藥量。
3.4試驗周期
試驗總周期為28周，前24周為給藥時間，后4周停藥，分別觀察動物不同時間有否毒性反應(yīng)。給藥期，分別于給藥12周、24周時，于末次給藥后禁食不禁水12小時，每組取10只動物(雌雄各半)稱重后股靜脈取血，測定動物血液細胞學(xué)、血液生化學(xué)，同時處死動物進行系統(tǒng)尸解，觀察動物各臟器組織有無充血、腫大、出血等異常變化后，再取各鼠主要臟器分別稱重，計算臟器系數(shù)后及其他臟器組織標本仔細剝離周圍脂肪組織等浸入10％甲醛固定，進行病理組織形態(tài)學(xué)檢查。停藥期，其余動物停藥常規(guī)飼養(yǎng)4周，每天進行一般狀況觀察，每周記體重及進食量，禁食不禁飲12小時處死動物，檢測上述各項指標。
4檢查項目
4.1一般觀察
每日觀察各組動物的外觀形態(tài)體征、行為活動、毛發(fā)光澤、進食、飲水、大便性狀等；發(fā)現(xiàn)中毒動物立即隔離，重點觀察；發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物，即刻尸檢。每周稱動物體重，據(jù)此調(diào)整給藥量，同時記錄各組動物飼料消耗量。
4.2檢測項目
4.2.1血液細胞學(xué)檢查指標
白細胞(WBC)、中性粒細胞總數(shù)(#NEUT)、淋巴細胞絕對值(#LYMPH)、單核細胞計數(shù)(MONO#)、嗜酸細胞數(shù)(#EOS)、嗜堿細胞數(shù)(#BASO)、紅細胞分布寬度(RDW)、中性粒細胞百分比(％NEUT)、淋巴細胞百分比(％LYMPH)、單核細胞百分比(％MONO)、嗜酸細胞百分比(％EOS)、嗜堿細胞百分比(％BASO)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、平均血小板容積(MPV)。
4.2.2血液生化學(xué)檢查指標
鉀(K)、鈉(Na)、氯(CL)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、總膽紅素(TBIL)。
4.2.3主要器官組織標本
心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、大腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪，分別稱重，計算器官系數(shù)；再于心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦組織、甲狀腺、垂體、氣管、食管、胃、腸、膀胱、胰腺、淋巴結(jié)、視神經(jīng)等臟器同一部位取材進行石蠟包埋，切片，HE染色；置光學(xué)顯微鏡觀察并與空白對照組進行臟器病理組織比較。先對比檢查高劑量組與空白對照組動物組織形態(tài)病理變化，中劑量組及低劑量組動物器官組織標本10％甲醛固定備查。
4.2.4病理學(xué)檢查
進行尸析，并將主要的器官和組織用10％甲醛固定、保存。當(dāng)各劑量組動物尸析未發(fā)現(xiàn)明顯病變時只進行高劑量組和空白對照組動物的組織病理學(xué)檢查。如發(fā)現(xiàn)病變再對中、低劑量組動物進行相應(yīng)的檢查。
4.3指標觀察時間
每天全面觀察所有實驗動物的一般狀況，動物活動行為，大便性狀，外觀體征，飼料一周的消耗量； 每周稱體重一次；給藥12周、24周末次藥后12小時及停藥4周恢復(fù)期末，各進行一次上述項目全面檢查。
5實驗結(jié)果
5.1本發(fā)明的中藥制劑對大鼠一般情況及進食的影響
在連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周內(nèi)，將各給藥組與空白對照組比較，觀察動物活動、行為、飲食、大便、毛發(fā)光澤等，4組動物情況相似，未見明顯異常變化。在同一時間內(nèi)大鼠攝食量亦無明顯差異。結(jié)果見表29、表30：
表29本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周期間對雌性大鼠周平均進食量(g)的影響
注：不同時間點，各給藥組與空白對照組比較，P>0.05。
表30本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周期間對雄性大鼠周平均進食量(g)的影響
注：不同時間點，各給藥組與空白對照組比較，P>0.05。
結(jié)果表明，各組動物周消耗食量均呈逐漸增加趨勢，各給藥組與空白對照組比較，無明顯差異，P＞0.05。表明大鼠連續(xù)灌胃給藥12周、24周及停藥4周，對雌雄大鼠食物周消耗量無明顯影響。
5.2本發(fā)明的中藥制劑對大鼠體重的影響
本發(fā)明的中藥制劑高、中、低三種劑量對大鼠連續(xù)給藥不同時間后的體重與空白對照組比較，其差異無明顯變化，結(jié)果見表31、表32。
表31本發(fā)明的中藥制劑長期連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周期間對雌性大鼠體重(g)的影響
注：各給藥組與空白對照組比較，P>0.05；0周為藥前期，n＝15；1-12周為給藥期1，n＝15；13-24周為給藥期2，n＝10；25-28周為停藥期，n＝5。
表32本發(fā)明的中藥制劑長期連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周期間對雄性大鼠體重(g)的影響
注：各給藥組與空白對照組比較，P>0.05；0周為藥前期，n＝15；1-12周為給藥期1，n＝15；13-24周為給藥期2，n＝10；25-28周為停藥期，n＝5。
結(jié)果表明，觀察期內(nèi)，各組雌雄大鼠體重均逐漸增加，生長發(fā)育良好；各給藥組與同時間段空白對照組相比，各時間點體重與空白對照組相比無明顯差異，P＞0.05。表明大鼠連續(xù)灌胃給藥12周、24周及停藥4周，對雌雄大鼠體重?zé)o明顯毒性影響。
5.3本發(fā)明的中藥制劑對大鼠血液細胞學(xué)影響
本發(fā)明的中藥制劑給大鼠灌胃給藥12周、24周和停藥4周，各組動物血液學(xué)指標檢測結(jié)果見表33～35。
表33本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周對大鼠血液細胞學(xué)指標的影響(n＝10)
注：各給藥組動物血液細胞學(xué)各項指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指標數(shù)值比較，P>0.05。
表34本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥24周對大鼠血液細胞學(xué)指標的影響(n＝10)
注：各給藥組動物血液細胞學(xué)各項指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指標數(shù)值比較，P>0.05。
表35本發(fā)明的中藥制劑停藥4周對大鼠血液細胞學(xué)指標的影響(n＝10)
注：各給藥組動物血液細胞學(xué)各項指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指標數(shù)值比較，P>0.05。
結(jié)果表明，本發(fā)明的中藥制劑高、中、低三種劑量連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周，對大鼠的血細胞均未見顯著影響，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＞0.05。因此，可以認為本發(fā)明的中藥制劑較大劑量、較長時間(24周)給藥及停藥4周，對大鼠的造血功能無顯著的毒性影響。
5.4本發(fā)明的中藥制劑對大鼠血液生化學(xué)的影響
本發(fā)明的中藥制劑給大鼠灌胃給藥12周、24周和停藥4周，各組動物血液生化學(xué)指標檢測結(jié)果見表36、表37、表38。
表36本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周對大鼠血液生化學(xué)指標的影響(n＝10)
注：各給藥組動物血液細胞學(xué)各項指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指標數(shù)值比較，P>0.05。
表37本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥24周對大鼠血液生化學(xué)指標的影響(n＝10)
注：各給藥組動物血液細胞學(xué)各項指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指標數(shù)值比較，P>0.05。
表38本發(fā)明的中藥制劑停藥4周對大鼠血液生化學(xué)指標的影響(n＝10)
注：各給藥組動物血液細胞學(xué)各項指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指標數(shù)值比較，P>0.05。
結(jié)果表明，本發(fā)明的中藥制劑高、中、低三種劑量連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周，對大鼠的血液生化指標均未見顯著影響，大鼠的肝功能及腎功能等各項生化指標數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)數(shù)值相比較，未見明顯差異，P＞0.05；故表明本發(fā)明的中藥制劑較大劑量連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周對大鼠肝功能、腎功能等指標均無顯著毒性作用。
5.5本發(fā)明的中藥制劑對大鼠主要器官指數(shù)的影響
本發(fā)明的中藥制劑給大鼠灌胃給藥12周、24周和停藥4周，系統(tǒng)尸體解剖：大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、甲狀腺、胃、腸、睪丸、附睪、前列腺、子宮、卵巢等臟器的形態(tài)、大小、顏色均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的變化。各組動物主要臟器指數(shù)檢測結(jié)果見表39，表40，表41，表42，表43，表44。
表39本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周對雌性大鼠主要臟器指數(shù)(g/100g)的影響(n＝5)
注:各給藥組動物各臟器指數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指數(shù)值比較，P>0.05。
表40本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥24周對雌性大鼠主要臟器指數(shù)(g/100g)的影響(n＝5)
注:各給藥組動物各臟器指數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指數(shù)值比較，P>0.05。
表41本發(fā)明的中藥制劑停藥4周對雌性大鼠主要臟器指數(shù)(g/100g)的影響(n＝5)
注:各給藥組動物各臟器指數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指數(shù)值比較，P>0.05。
表42本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周對雄性大鼠主要臟器指數(shù)(g/100g)的影響(n＝5)
注:各給藥組動物各臟器指數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指數(shù)值比較，P>0.05。
表43本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥24周對雄性大鼠主要臟器指數(shù)(g/100g)的影響(n＝5)
注:各給藥組動物各臟器指數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指數(shù)值比較，P>0.05。
表44本發(fā)明的中藥制劑停藥4周對雄性大鼠主要臟器指數(shù)(g/100g)的影響(n＝5)
注:各給藥組動物各臟器指數(shù)值分別與空白對照組相應(yīng)指數(shù)值比較，P>0.05。
結(jié)果表明，本發(fā)明的中藥制劑高、中、低三種劑量連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周，對大鼠主要臟器組織未見明顯的毒性影響，各給藥組大鼠各項臟器指數(shù)與空白對照組相比均無顯著差異，P＞0.05；故表明本發(fā)明的中藥制劑較大劑量連續(xù)給藥12周、24周及停藥4周對大鼠各臟器組織無顯著毒性作用。
5.6本發(fā)明的中藥制劑對大鼠重要臟器組織器官病理形態(tài)的影響
對本發(fā)明的中藥制劑連續(xù)給藥12周、24周，以及停藥4周的高、中、低三種劑量組及空白對照組三批次，殺取大鼠并解剖出各組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、大腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪、前列腺、甲狀腺、氣管、食管、胃、主動脈、十二指腸、結(jié)腸、膀胱、胰腺、淋巴結(jié)、視神經(jīng)、坐骨神經(jīng)等組織器官，在相同部位取材，用10％甲醛溶液固定。將本發(fā)明的中藥制劑高劑量組及空白對照組大鼠臟器標本進行組織切片，進行病理學(xué)檢查，其余標本保留以備用。結(jié)果：經(jīng)對兩組動物臟器標本檢查，各種器官組織結(jié)構(gòu)基本正常，細胞染色均勻，無明顯改變。由于本發(fā)明的中藥制劑高劑量組動物被檢查的器官組織未出現(xiàn)藥物致病理改變，故對本發(fā)明的中藥制劑中劑量組及低劑量組未進行器官組織切片。被檢器官組織形態(tài)切片照片及病理切片報告附后。
病理觀察結(jié)果表明，各給藥組大鼠諸多臟器的組織細胞無損害，形態(tài)學(xué)上提示該藥物對各臟器組織無毒性作用。
6.結(jié)論
大鼠長期毒性試驗結(jié)果表明，以本發(fā)明的中藥制劑2.07g/kg、1.035g/kg、0.5175g/kg，相當(dāng)于臨床成人日劑量0.0345g/kg體重的60倍、30倍、15倍，每日一次，連續(xù)12周、24周大鼠灌胃給藥及停藥4周，與空白對照組比較；各個劑量給藥對大鼠的一般狀態(tài)(外觀形態(tài)、活動、大便形狀等)，生長發(fā)育(體重增長)，造血功能(血液學(xué)檢查)，肝、腎功能(血液生化學(xué))，重要器官重量指數(shù)，均未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒性作用；經(jīng)病理學(xué)檢查證明，本發(fā)明的中藥制劑高劑量組與空白對照組比較觀察，對大鼠心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、大腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪、前列腺、甲狀腺、氣管、食管、胃、主動脈、十二指腸、結(jié)腸、膀胱、胰腺、淋巴結(jié)、視神經(jīng)、坐骨神經(jīng)等組織器官均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性損傷變化。由于本發(fā)明的中藥制劑高劑量組動物各組織器官未出現(xiàn)明顯病理變化，故對本發(fā)明的中藥制劑中劑量組、低劑量組未進行器官組織切片檢測，其標本保存?zhèn)溆?。所以可以認為較大劑量、較長時間口服給予本發(fā)明的中藥制劑的毒性較低，臨床使用安全。
由治療糖尿病的中藥制劑制成的片劑的實驗過程：
本品薄膜衣片具有片劑美觀，標志更清晰，不易冒仿，體積更小，更易吞咽，方便攜帶的優(yōu)點，計量更準確的優(yōu)勢。在不改變原提取工藝、干燥工藝及給藥途徑的條件下特對其進行了研究，增加本品不含糖的薄膜衣片劑，彌補臨床上糖寧通絡(luò)片的劑型空白，更好地服務(wù)于患者。
提取工藝研究實驗：
為使處方中藥材的成份盡量提取出來，以出膏率為考察指標，對藥材的炮制長度、加水量，浸泡時間、煎煮時間、煎煮次數(shù)分別進行考察，其結(jié)果如下：
(1)處方中藥材的炮制長度對出膏率的影響
將車前草、仙鶴草炮制成不同長度，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，用10倍量水將藥材浸潤30分鐘，煎煮2次，每次2小時，過濾，合并濾液，濃縮，進行出膏率測定，結(jié)果見表51：
表51藥材炮制長度對出膏率的影響
由表51可知：藥材粗粉的出膏率最高，但藥材粗粉提取后藥液難于過濾，實驗時所用機械的方法榨干藥渣，并不適于大工業(yè)生產(chǎn)；而切制成1.0cm段的出膏率與其相近，故將車前草、仙鶴草切制成1.0cm段進行提取為佳。
(2)浸泡時間對出膏率的影響
將車前草、仙鶴草炮制成1.0cm段，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，用10倍量水將藥材浸潤不同時間，然后用個篩子把水過濾掉，稱取藥材的重量，進行吸濕率(濕重減去干重除以藥材干重即為吸濕率)測定，結(jié)果見表52所示：
表52不同浸泡時間對出膏率的影響
由上表可見，藥材浸潤30分鐘后，吸水率幾乎不再增加，從節(jié)約時間和成本考慮，以浸潤30分鐘為佳。
(3)不同的加水量、煎煮時間和提取次數(shù)對出膏率的影響
將車前草、仙鶴草炮制成1.0cm段，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，用不同的加水量，浸泡30分鐘，用不同的煎煮時間和提取次數(shù)提取，過濾，濾液，濃縮，進行出膏率測定，具體以下表53中的方案進行考察，試驗結(jié)果如表54所示：
表53不同的提取方案
表54不同提取方案對浸膏收率的影響
由表53、表54可知：處方藥材提取2次，第一次加8倍量水浸泡30分鐘，煎煮2小時，第二次加6倍量水煎煮1小時后，浸膏收率幾乎不再增加，從節(jié)約能源和時間成本考慮，以車前草、仙鶴草炮制成1.0cm段，山銀花的飲片和科夭羅曲直接投料，稱取處方量藥材，煎煮2次，第一次用8倍量水將藥材浸潤30分鐘，煎煮2小時；第二次用6倍量水煎煮1小時，過濾，合并濾液的工藝為佳。
所述的出膏率測定的具體方法為：取濃縮至相對密度為1.2～1.3(測定溫度60℃)的清膏，轉(zhuǎn)移并定容至1000ml容量瓶中，搖勻；精密量取20ml，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣于105℃干燥3小時，取出，置干燥器中放置30分鐘，稱重，計算。
實驗例3：過濾、濃縮及干燥工藝研究
3.1過濾工藝研究：
粗提液試驗中采用濾過(300目濾布)法進行，結(jié)合生產(chǎn)設(shè)備條件，考察了用離心機離心和板框過濾兩種方案：
離心方案：取粗提液經(jīng)離心機3000/min離心1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、觀察離心效果，離心2分鐘以上時，上清液明顯變清和沉淀分離良好。
板框過濾方案：取粗提液經(jīng)5塊、8塊、10塊過濾板過濾，取過濾液經(jīng)離心機3000/min離心2分鐘，觀察沉淀的多少，發(fā)現(xiàn)粗提液經(jīng)10塊過濾板過濾后，幾乎沒有沉淀。
從簡便省時，節(jié)省能源的角度考慮用粗提液經(jīng)10塊過濾板過濾的方案較好。
3.2濃縮工藝研究：
結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)條件，有敞口傾倒式夾層蒸鍋和三效減壓濃縮設(shè)備，
為防止有效成分長時間受熱破壞，采用三效減壓濃縮設(shè)備進行濃縮。合并的濾液減壓濃縮成相對密度為1.2～1.3的清膏，測量溫度60℃。
減壓濃縮條件：溫度為65～75℃，真空度為0.04～0.06Mpa，溫度和真空度高出上限提取液會爆沸，低于下限耗時較長。
3.3干燥工藝研究：結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)條件，有常壓干燥和減壓干燥設(shè)備，為使生產(chǎn)周期縮短，選用減壓干燥。
干燥條件：
采用溫度為65～75℃，真空度為0.07～0.09Mpa進行減壓干燥。溫度和真空度過高會起泡溢出盤外，污染干燥器，浪費物料。
實驗例4：制劑成型工藝研究
4.1輔料種類及用量選擇
①、崩解劑種類的篩選
根據(jù)預(yù)實驗的篩選，在本處方藥粉與輔料比例恒定的情況下，將藥物浸膏粉直接加入不同崩解劑，混勻，壓片，以崩解時間為考察指標，測定其崩解時限。
崩解時限的測定：按《中國藥典》2010年一部附錄ⅫA崩解時限檢查法項下薄膜衣片檢查要求進行。記錄完全崩解時間，結(jié)果見表54-1：
表54-1崩解劑種類篩選結(jié)果
由上可見：以羧甲基淀粉鈉和微晶纖維素的崩解時間較短，故選擇羧甲基淀粉鈉和微晶纖維素聯(lián)合應(yīng)用作為崩解劑。
②助懸劑的篩選
因本品崩解后，即形成粘稠狀混懸液，故不必加助懸劑。
③填充劑的篩選
實驗中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用多種優(yōu)質(zhì)崩解劑，硬度小、崩解均不太理想，因為藥物浸膏粉粘性、吸潮性都較強，而常用的崩解劑多有吸濕性，浸膏粉吸潮性增強，粘性增加而使片劑難崩解。因此應(yīng)選擇一種輔料作填充劑以降低浸膏粉的吸濕性及增大水分子的滲入作用，便于制粒及降低崩解劑的用量。實驗以羧甲基淀粉鈉和微晶纖維素聯(lián)合作崩解劑，浸膏粉與輔料為2︰1的比例加入不同種類相同量的填充劑，混勻，壓片，以崩解時間為考察指標，結(jié)果見表54-2：
表54-2：填充劑種類篩選結(jié)果
結(jié)果表明，預(yù)膠化淀粉為填充劑時，片劑崩解時間短，硬度相對較好，故選擇預(yù)膠化淀粉做填充劑。
④粘合劑的篩選
在藥物浸膏粉中加入羧甲淀粉鈉、微晶纖維素及預(yù)膠化淀粉，壓制所得的片子雖然硬度和崩解時限都很好，但外觀不光潔，粉性很大，因此考慮選用粘合劑來改善這一狀況，實驗以浸膏粉占2份，羧甲淀粉鈉、微晶纖維素及預(yù)膠化淀粉三者等量加入，共占1份，用不同種類不同用量的粘合劑，制粒，壓片，以崩解時間、硬度、外觀為考察指標，結(jié)果見表54-3：
表54-3粘合劑種類篩選結(jié)果
結(jié)果表明，以用量為物料量55％的淀粉漿(濃度為12％)為粘合劑時，片劑崩解時間短，硬度相對較好，外觀光潔。
⑤潤滑劑的篩選
在用淀粉漿制成顆粒后，壓片時其流動性不是很好，經(jīng)過預(yù)實驗，得出用二氧化硅和硬脂酸鎂兩者比例為1:1配合作潤滑劑最佳，以浸膏粉占2份，羧甲淀粉鈉、微晶纖維素及預(yù)膠化淀粉三者等量加入，共占1份，用物料量55％的淀粉漿(濃度為12％)為粘合劑，制粒，壓片，以可壓性為考察指標，結(jié)果見表54-5：
表54-5潤滑劑及用量的篩選實驗
其中以加入物料量0.16％的(二氧化硅:硬脂酸鎂)1:1作潤滑劑可壓性為最佳。
⑥崩解劑、填充劑用量的篩選
指標的確定：
顆粒流動性：采用測定休止角的方法測定顆粒的流動性。休止角：
α值越小表明顆粒的流動性越好。
顆粒粒度：根據(jù)生產(chǎn)實踐顆粒粒度在20-60目之間越大顆粒的可壓性越好。測定過20目篩不過60目篩的顆粒重量，并計算重量百分比。
外觀的評價：觀察片子的完整性，有無裂片，光潔程度，是否粘沖，色澤是否均勻。
片重差異：按《中國藥典》2005年版一部(附錄ⅠD片劑項下)測定。
硬度：用片劑硬度測試儀測定片子的硬度。
崩解時限：按《中國藥典》2005年版一部(附錄ⅠD片劑項下)測定。
指標的評價：
可壓性非常好：指休止角α小于45度，顆粒粒度20-60目重量百分比大于70％，片子外觀完整，光潔，片重差異符合規(guī)定。片子硬度大于5Kg；
可壓性較好：指休止角α大于45度小于50度，顆粒粒度20-60目重量百分比在60％～70％之間，片子外觀完整，光潔，片重差異符合規(guī)定。片子硬度在4Kg～5Kg之間；
可壓性一般：指休止角α大于50度小于55度，顆粒粒度20-60目重量百分比在50％～60％之間，片子外觀完整，但光潔度差，片重差異符合規(guī)定，片子硬度大于3～4Kg；
可壓性差：指休止角α大于55度小于60度，顆粒粒度20-60目重量百分比大于40％小于50％，片子外觀不夠完整。片重差異大，片子硬度小于3Kg；
可壓性較差：指休止角α大于60度，顆粒粒度20-60目重量百分比小于40％，片子外觀不夠完整。片重差異較大，片子硬度小于3Kg；
當(dāng)確定輔料的種類之后，為了保證質(zhì)量，并使其質(zhì)量更為優(yōu)良，應(yīng)對各種輔料的用量進行篩選。采用正交實驗的方法，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果確定各因素的不同水平，見表54-6：
表54-6綜合評價實驗水品的建立
按照L9(34)實驗，將藥粉(按藥材提取出干膏率20.30％計)加入適當(dāng)比例的輔料混勻，用物料量55％的淀粉漿(濃度為12％)為粘合劑，制粒，加入優(yōu)選用量的潤滑劑，壓片，以可壓性為考察指標，進行評價。正交實驗結(jié)果：見表54-7：
表54-7正交實驗結(jié)果
X1、X2、X3分別為各因素下不同水平的3次結(jié)果均值。
表54-8正交設(shè)計方差分析表：
*P<0.05
由表54-8可見，根據(jù)數(shù)字愈小愈好各因素影響的順序為C>A>B，即微晶纖維素具有海綿狀的多孔管狀結(jié)構(gòu)，受壓時其多孔結(jié)構(gòu)由雜亂無章變?yōu)榫€性排列，使水分子容易進入片劑內(nèi)部，協(xié)助崩解，微晶纖維素的加入對實驗結(jié)果影響最大；羧甲淀粉鈉具有良好的親水性、吸水性和膨脹性，膨脹本身體積的200～300倍，崩解效果優(yōu)越，提高片子的可壓性，壓得的片子的硬度增加，外觀光潔，沒有出現(xiàn)粉性的情況。最佳處方組成A2B2C2，即羧甲淀粉鈉占藥粉量1.67％，預(yù)膠化淀粉占藥粉量的2.9％，微晶纖維素為藥粉量的15.67％，其它輔料適量。
4.2顆粒物理性質(zhì)研究
①性狀：本品顆粒為棕色至棕褐色，氣微，味苦。
②堆密度：稱取一定重量合格顆粒，裝入10ml量筒中，以一定高度落下數(shù)次(盡可能控制條件一致)，使松緊適度，以重量除以容積得堆密度，結(jié)果見表54-9。
表54-9顆粒堆密度測定結(jié)果
③休止角的測定：取合格顆粒經(jīng)漏斗流下并呈圓錐體狀，測定其休止角，結(jié)果見表54-10。
表54-10顆粒休止角
顆粒的休止角低于45.0°，具有良好的流動性，適合于壓片的要求。
④顆粒的臨界相對濕度測定
表54-11不同溶液的相對濕度表
表54-12臨界相對濕度測定數(shù)據(jù)
由吸濕曲線求得，臨界相對濕度約為58％。結(jié)合生產(chǎn)，在打粉、混合、填充及貯存時應(yīng)將相對濕度控制在55％以下，以減少水分對藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性的影響。
4.3壓片工藝研究
4.3.1顆粒水分的選擇
顆粒水分影響片子質(zhì)量，含水量適當(dāng)?shù)念w粒可塑性大，所壓成的片劑的硬度較好，顆粒太濕，則易發(fā)生粘沖。通過試驗，顆粒中的水分控制在4.0～5.5％時，硬度較好，片面光潔，破碎度較好，合格率較高。
4.3.2硬度 在不同的壓力下，制得的片子硬度對崩解時間的影響很大，隨著片硬度的增加，崩解時間減慢。通過對不同硬度下制得的片子外觀和崩解時間結(jié)果，見表54-13
表54-13不同硬度下的外觀和崩解時間
由此可見，硬度為3～4kg時，崩解時間在40分鐘以內(nèi)，而且表面有光澤，因此確定硬度為3～4kg。
4.3.3壓片
根據(jù)上述研究結(jié)果，制成顆粒，干燥，混勻，調(diào)節(jié)片重為0.39g，硬度為3～4kg，壓制成1000片素片。
4.4包薄膜衣工藝研究
4.4.1薄膜包衣預(yù)混劑用量的選擇
取4.93kg的純化水，用攪拌漿攪拌形成旋渦，稱取薄膜包衣預(yù)混劑1.01kg加入到旋渦側(cè)壁配制成濃度為17％的包衣溶液，持續(xù)攪拌45分鐘，過60～80目篩待用。取本品素片(批號：20120901，平均片重為0.3915g)19.57kg，約50000片，放入高效包衣機中，升溫至40～60℃。用噴槍將包衣溶液噴入旋轉(zhuǎn)的高效包衣機內(nèi)，控制轉(zhuǎn)速為5～20rpm，片床溫度要求在38～45℃，壓縮空氣0.4～0.5Mpa，直至將包衣材料噴完。關(guān)掉熱風(fēng)，將轉(zhuǎn)速降至≤5。待片子冷卻后，關(guān)掉排風(fēng)。檢測外觀、水分≤4％。分別在包衣溶液噴去2.30kg、2.50kg、3.00kg、3.45kg、4.60kg、5.25kg和噴至包衣溶液用完時各取出樣品20片，分別記為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7，置烘箱50℃時恒溫干燥8小時，此時取各個樣品4片，用快速水分測定儀測得水分為3.5％。剩余的樣品對其進行外觀和崩解時限進行考察，結(jié)果見下表54-14。
表54-14不同用量薄膜包衣預(yù)混劑下的外觀和崩解時間
由上表中結(jié)果可知，50000片本品素片，在噴入濃度為17％的包衣溶液4.60kg及至噴完實驗用的包衣溶液后的樣品，外觀和崩解時限均符合要求。結(jié)合生產(chǎn)成本等因素，選取噴濃度為17％的包衣溶液4.60kg為最佳，4.60kg包衣溶液里含17％薄膜包衣預(yù)混劑，即782.8g，折合成處方量1000片來計算，薄膜包衣預(yù)混劑用量應(yīng)為15.66g。
4.4.2包衣工藝
取適量的水，用攪拌漿攪拌形成旋渦，稱取將薄膜包衣預(yù)混劑加入到旋渦側(cè)壁配制成濃度為17％的包衣溶液，持續(xù)攪拌45分鐘，過60－80目篩待用。素片放入高效包衣機中，升溫至40－60℃。用噴槍將包衣溶液噴入旋轉(zhuǎn)的高效包衣機中，控制轉(zhuǎn)速為5－20rpm，片床溫度要求在38－45℃，壓縮空氣0.4－0.5Mpa，直至將包衣材料噴完。關(guān)掉熱風(fēng)，將轉(zhuǎn)速降至≤5。待片子冷卻后，關(guān)掉排風(fēng)。檢測外觀、水分≤4％，增重4.0％。
實驗例5：中試生產(chǎn)試驗
按照本發(fā)明優(yōu)選出的提取工藝、過濾、濃縮及干燥工藝、制劑成型工藝，進行中試規(guī)模的工藝試驗，共投料三批，按100倍處方量進行，三批中試產(chǎn)品檢測數(shù)據(jù)見表56-1、表56-2：
表56-1三批中試試驗數(shù)據(jù)
表56-2三批試制樣品檢驗結(jié)果
經(jīng)過三批次中試生產(chǎn)的驗證，結(jié)果表明：糖寧通絡(luò)片的工藝是合理的、可行的。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明由苗藥秘方制成的治療糖尿病的中藥制劑降糖顯著，具有更好的治療效果。本處方來源于民間驗方，已有五十多年的使用歷史，是通過臨床實踐總結(jié)出的處方，具有固本養(yǎng)陰、化濁通脈、生津止渴之功效，尤其對于氣陰兩虛所致的糖尿病及并發(fā)癥具有明顯的降糖作用，并且該降糖作用不完全依賴于促進胰島B細胞分泌；另外，本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病具有一定程度的胰島保護作用，可以改善胰島素抵抗；其對正常SD大鼠不具降糖作用；此外，本發(fā)明的中藥制劑質(zhì)量安全可靠，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)及毒副作用。此外，本發(fā)明制成的片劑，只有崩解時間較短、硬度相對較好、外表光潔、可壓性佳、堆密度佳、減少水分對藥物性質(zhì)及穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
附圖說明
圖1是本發(fā)明治療糖尿病的中藥制劑的制備工藝流程圖；
圖2是科夭羅曲的制備工藝流程圖；
圖3是臨界相對濕度測定曲線圖；
圖4是大鼠空腹16小時后，給予葡萄糖溶液(灌胃，20g/100mL,3mL/只)，測定大鼠的空腹、1h、2h、3h血糖值結(jié)果曲線；
圖5是正常組對Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺病理改變示意圖；
圖6是模型組對Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺病理改變示意圖；
圖7是模型組對Ⅱ型糖尿病大鼠胰腺病理改變示意圖；
圖8是本發(fā)明的中藥制劑對Ⅱ型糖尿病大鼠體重的影響示意圖；
圖9是本發(fā)明的中藥制劑對2型糖尿病大鼠糖耐量的影響示意圖；
圖10是正常組大鼠胰腺的切片示意圖；
圖11是模型組糖尿病大鼠胰腺的切片示意圖；
圖12是二甲雙胍組對糖尿病大鼠胰腺的切片影響示意圖；
圖13是TNTL低劑量組對糖尿病大鼠胰腺的切片影響示意圖；
圖14是TNTL高劑量組對糖尿病大鼠胰腺的切片影響示意圖；
圖15是聯(lián)合用藥對2型糖尿病大鼠糖耐量的影響示意圖；
圖16是正常組大鼠的胰腺示意圖；
圖17是模型組大鼠的胰腺示意圖；
圖18是二甲雙胍+TNTL低劑量組聯(lián)合用藥對大鼠胰腺的影響示意圖；
圖19是正常+TNTL高劑量組對大鼠胰腺的影響示意圖；
圖20是臨界相對濕度測定曲線。
具體實施方式
實施例1：
科夭羅曲的制備方法：將藥材新鮮瓜蔞2g、新鮮雞血藤2g和新鮮垂盆草1g所組成的混合物經(jīng)壓榨取汁后，藥渣的干燥細粉再與麥粉2g、麩皮1g混合，加入藥汁和水?dāng)噭蛑瞥绍洸?，蒸透，保持溫度?2℃、濕度為50％，添加曲精發(fā)酵25天，取出，干燥，粉碎，即得。所述的新鮮瓜蔞也可以是瓜蔞子、瓜蔞皮和天花粉中的一種或幾種。
治療糖尿病的膠囊劑的制備方法：稱取科夭羅曲480g、車前草350g、仙鶴草335g和山銀花335g，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加8倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6倍量水煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.2的清膏，于溫度65℃、真空度0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，整粒，加入1.13g二氧化硅，混勻，裝入膠囊，即制得膠囊劑。服用方法：以生藥粉計，3g/次，每日服用3次，每日服用生藥粉計9-12g，飯前服用；以膠囊計：由于藥材投料量為1500g，出膏率為20.3％，因而計算干膏約304.5g，又輔料二氧化硅1.13g，總計305.63g，制成1000粒，每粒重0.3056g，即每粒相當(dāng)于生藥材1.5g，平均每粒重為0.30g，因此設(shè)計每次服用2-3粒(0.30干膏/粒)，每日3次，與每日服用9-12g生藥粉相當(dāng)，飯前服用。
性狀：本品為硬膠囊，內(nèi)容物應(yīng)為棕色至棕褐色的粉末，味苦。
實施例2：
科夭羅曲的制備方法：將藥材新鮮瓜蔞2g、新鮮雞血藤2g和新鮮垂盆草1g所組成的混合物經(jīng)壓榨取汁后，藥渣的干燥細粉再與麥粉2g、麩皮1g混合，加入藥汁攪勻制成軟材，蒸透，保持溫度為26℃、濕度為65％，添加曲精發(fā)酵30天，取出，干燥，粉碎，即得科夭羅曲。
治療糖尿病的片劑的制備方法：稱取科夭羅曲400g、車前草300g、仙鶴草400g和山銀花400g，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加10倍量水，浸泡120分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加10倍量水煎煮2小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.3的清膏，于溫度75℃、真空度0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，加入片劑相應(yīng)的輔料，即得片劑1000粒。服用方法：每日3次，每次2粒，每粒重0.15g，飯前服用。
實施例3：
科夭羅曲的制備方法：將藥材新鮮瓜蔞2g、新鮮雞血藤2g和新鮮垂盆草1g所組成的混合物經(jīng)壓榨取汁后，藥渣的干燥細粉再與麥粉2g、麩皮1g混合，加入藥汁攪勻制成軟材，蒸透，保持溫度為18℃、濕度為45％，添加曲精發(fā)酵20天，取出，干燥，粉碎，即得科夭羅曲。
治療糖尿病的顆粒劑的制備方法：稱取科夭羅曲500g、車前草400g、仙鶴草300g和山銀花300g，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加6倍量水，浸泡90分鐘，煎煮1小時，過濾，取濾液備用；藥渣加8倍量水煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.2的清膏，于溫度55℃、真 空度0.08Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，加入顆粒劑相應(yīng)的輔料，即得顆粒劑1000粒。服用方法：每日3次，每次2粒，每粒重0.15g，飯前服用。
實施例4：
治療糖尿病的滴丸的制備方法：稱取實施例1中制備的科夭羅曲550g、車前草350g、仙鶴草300g和山銀花300g，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加10倍量水，浸泡120分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加10倍量水煎煮2小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.3的清膏，于溫度75℃、真空度0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，加入滴丸相應(yīng)的輔料，即得滴丸劑。服用方法：每日3次，每次2-3粒，每粒重0.3g，飯前服用。
實施例5：一種治療糖尿病的片劑：
處方：
科夭羅曲400g 車前草300g 仙鶴草400g 山銀花400g
制成1000個制劑單位
其中，所述的科夭羅曲為苗族習(xí)用藥材，由貴州道地藥材新鮮瓜蔞和新鮮冬瓜皮以9：1的重量比混合糯米粉經(jīng)曲制進行經(jīng)曲制進行酵解而成。
具體的說，所述的科夭羅曲通過以下方法制備而成：稱取原料藥新鮮瓜蔞和新鮮冬瓜皮，壓榨取汁，備用；將藥渣干燥后，粉碎成細粉，將該藥渣細粉按照藥渣細粉：糯米粉＝9：1的重量配比與糯米粉混勻，加入藥汁，同時加水?dāng)噭蛑瞥绍洸?，蒸透，保持溫度?8～26℃、濕度為45％～65％，添加曲精發(fā)酵16～30天(夏季16～25，冬季20～30，春秋16～30)，取出，粉碎，干燥，即得。
制備方法：稱取處方量科夭羅曲(由新鮮瓜蔞全株和新鮮雞血藤、垂盆草經(jīng)曲制進行酵解而成。)、車前草、仙鶴草和山銀花，加8倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2小時，過濾，藥渣加6倍量水煎煮1小時，過濾，合并濾液，濃縮至相對密度為1.2～1.3(測定溫度60℃)的清膏，65～75℃減壓干燥。干膏粉碎，過100目篩，加羧甲基淀粉鈉、預(yù)膠化淀粉及微晶纖維素，制粒，取出濕顆粒于65～75℃干燥，干顆粒用二號篩整粒后，加入潤滑劑混合均勻，壓片，包薄膜衣，即得片劑。服用方法：口服。一次3-4片，一日3次；飯后服用或遵醫(yī)囑。每片重0.4g
本發(fā)明公開了一種治療糖尿病的中藥制劑及其制備方法，所述制備方法包括：按重量份計算，稱取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花，加6～10倍量水，浸泡30～120分鐘，煎煮1～2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6～10倍量水煎煮1～2小時，過濾；合并兩次濾液，濾過，濃縮，干燥，粉碎，加入輔料，制成相應(yīng)的中藥制劑，即得。
實施例6：一種治療糖尿病的片劑的制備方法：
活性成分處方：
科夭羅曲480g 車前草350g 仙鶴草335g 山銀花335g
稱取科夭羅曲、車前草、仙鶴草和山銀花，將車前草和仙鶴草切制成1.0cm段，加8倍量水，浸泡30分鐘，煎煮2小時，過濾，取濾液備用；藥渣加6倍量水煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，濾過，濃縮成60℃的相對密度為1.2的清膏，于溫度65℃、真空度0.1Mpa的條件下將清膏減壓干燥成干膏；粉碎，整粒，過100目篩，加入干膏總重1.67％的羧甲淀粉鈉，2.9％的預(yù)膠化淀粉，15.67％的微晶纖維素，用物料量55％的、且濃度為12％的淀粉漿為粘合劑制粒，取出濕顆粒于65～75℃干燥，干顆粒用二號篩整粒后，加入物料量0.16％的1：1的二氧化硅和硬脂酸鎂作潤滑劑混合均勻，壓成1000片，包薄膜衣，每片重0.4g，即得。服用方法：口服，一次3-4片，一日3次；飯后服用或遵醫(yī)囑。
實施例7：治療糖尿病的片劑的檢測方法：
(1)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取1.3g，加入10ml的甲醇超聲30分鐘過濾，取濾液5ml，加入少量的鎂粉，滴加12～14滴濃鹽酸，水浴1～2分鐘，溶液變?yōu)榧t紫色。
(2)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取3.8g，加95％乙醇50ml，回流提取2小時，濾過，濾液濃縮至5ml，作為供試品溶液。另取木犀草苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液3.5μl、對照品溶液1μl，分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7：3：1：1.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱10分鐘，放冷，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(3)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取2.6g，加95％乙醇50ml，回流提取2小時，濾過，濾液濃縮至10ml，作為供試品溶液。另取大車前苷對照品，加60％甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液2μl、對照品溶液2μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7：3：1：1.2)為展開劑，展開，展距為5cm，取出，在60℃加熱10分鐘，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
(4)取本品去包衣，研磨成細粉，稱取2.6g，加甲醇30ml，回流提取3小時，濾過，濾液濃縮至10ml，作為供試品溶液。另取異綠原酸A對照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液2μl、對照品溶液1μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7：3：1：1.2)為展開劑，展開，展距為5cm，取出，在60℃加熱10分鐘，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點。
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