本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，具體涉及一種西妥昔單抗與負(fù)載該物質(zhì)的膠原支架在制備修復(fù)脊髓損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：脊髓是中樞神經(jīng)的重要組成部分，主要功能是傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息同時也是許多簡單反射活動的低級中樞。脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)多見于砸傷、摔傷、交通事故、運(yùn)動性損傷和一些如地震及礦難等自然災(zāi)難中。脊髓損傷后通常表現(xiàn)為損傷節(jié)段以下的軀體丟失感覺與自主運(yùn)動功能，而與外周神經(jīng)不同，脊髓神經(jīng)元在損傷后很難自發(fā)再生進(jìn)入或跨越損傷區(qū)[NeumannS,BradkeF,Tessier-LavigneM,BasbaumAI.RegenerationofsensoryaxonswithintheinjuredspinalcordinducedbyintraganglioniccAMPelevation.Neuron.2002；34:885-93.；QiuJ,CaiCM,DaiHN,McAteeM,HoffmanPN,BregmanBS,etal.SpinalaxonregenerationinducedbyelevationofcyclicAMP.Neuron.2002；34:895-903.]。影響脊髓損傷后軸突再生的抑制因素主要包括以下兩類：首先，脊髓損傷后，星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞等膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生以致膠質(zhì)疤痕形成。研究表明，在脊髓損傷后幾天之內(nèi)損傷區(qū)周圍的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)硫酸軟骨素蛋白聚糖類(CSPGs)這類神經(jīng)再生抑制分子[FilbinMT.Recapitulatedevelopmenttopromoteaxonalregeneration:goodorbadapproach，PhilosTRSocB.2006；361:1565-74.]。CSPGs除了能以瘢痕的形式在空間上影響軸突再生，還能激活神經(jīng)元內(nèi)PKC信號通路繼而活化Rho來抑制神經(jīng)再生[SivasankaranR,PeiJ,WangKC,ZhangYP,ShieldsCB,XuXM,etal.PKCmediatesinhibitoryeffectsofmyelinandchondroitinsulfateproteoglycansonaxonalregeneration.Natureneuroscience.2004；7:261-8.]。此外，髓鞘來源的髓鞘相關(guān)蛋白同樣具有抑制神經(jīng)軸突再生的作用，其主要包括Nogo-A，MAG和OMgp等，這三種抑制分子均可以與NgR1識別結(jié)合，與配體結(jié)合后NgR1會進(jìn)一步招募p75、TROY和LINGO-1形成受體復(fù)合物，隨后抑制信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起RhoA磷酸化，細(xì)胞骨架重排最終軸突生長被抑制[HeZG,KoprivicaV.TheNogosignalingpathwayforregenerationblock.Annualreviewofneuroscience.2004；27:341-68.]。有研究表明髓鞘相關(guān)蛋白與其受體結(jié)合后，能引發(fā)胞內(nèi)鈣離子濃度提高，進(jìn)而激活表皮生長因子信號通路，表皮生長因子受體(EGFR)激活后活化Rho-Rac信號，導(dǎo)致軸突生長錐塌陷，從而抑制軸突再生[KoprivicaV,ChoKS,ParkJB,YiuG,AtwalJ,GoreB,etal.EGFRactivationmediatesinhibitionofaxonregenerationbymyelinandchondroitinsulfateproteoglycans.Science.2005；310:106-10.]。目前EGFR抗體已經(jīng)用于臨床的藥物是Cetuximab，但是該藥物主要是用于臨床治療腫瘤疾病(如直腸癌，食道癌等)[MalikH,KhanAZ,BerryDP,CameronIC,PopeI,SherlockD,HelmyS,ByrneB,ThompsonM,PulferA,DavidsonB.Liverresectionratefollowingdownsizingchemotherapywithcetuximabinmetastaticcolorectalcancer:UKretrospectiveobservationalstudy.EurJSurgOncol.2015；41(4):499-505；TianX,ZhouJG,ZengZ,ShuaiT,YiLJ,MaL,WangY,CaoH,SongGM.Cetuximabinpatientswithesophagealcancer:asystematicreviewandmeta-analysisofrandomizedcontrolledtrials.MedOncol.2015；32(4):127.]，但未見有用于脊髓損傷修復(fù)的臨床報(bào)道。我們前期研制的神經(jīng)再生膠原支架除了具有良好的生物相容性之外，還根據(jù)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)纖維縱向有序生長的特點(diǎn)能夠引導(dǎo)神經(jīng)纖維有序延伸。通過大鼠及全橫斷脊髓損傷模型證實(shí)，神經(jīng)再生膠原支架能夠減少損傷面積擴(kuò)散，引導(dǎo)神經(jīng)纖維有序再生[HanQQ,SunWJ,LinH,ZhaoWX,GaoY,ZhaoYN,etal.LinearOrderedCollagenScaffoldsLoadedwithCollagen-BindingBrain-DerivedNeurotrophicFactorImprovetheRecoveryofSpinalCordInjuryinRats.TissueEngPtA.2009；15:2927-35.]。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供Cetuximab或負(fù)載Cetuximab的神經(jīng)再生膠原支架材料在制備具有如下(1)、(2)、(3)、(4)和(5)功能中至少一種的產(chǎn)品中的應(yīng)用：(1)修復(fù)脊髓損傷；(2)促進(jìn)神經(jīng)再生；(3)減少脊髓損傷部位膠質(zhì)細(xì)胞增生；(4)引導(dǎo)受損神經(jīng)纖維的有序再生；(5)引導(dǎo)脊髓損傷后內(nèi)源性的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元向損傷區(qū)的遷移。本發(fā)明所述的Cetuximab購自德國默克里昂制藥公司，商品規(guī)格為100毫克/20毫升/瓶)。本發(fā)明的再一個目的是提供具有如下(1)、(2)、(3)、(4)和(5)功能中至少一種的藥物，該藥物是負(fù)載了Cetuximab的神經(jīng)再生膠原支架材料：(1)修復(fù)脊髓損傷；(2)促進(jìn)神經(jīng)再生；(3)減少脊髓損傷部位膠質(zhì)細(xì)胞增生；(4)引導(dǎo)受損神經(jīng)纖維的有序再生；(5)引導(dǎo)脊髓損傷后內(nèi)源性的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元向損傷區(qū)的遷移。本發(fā)明所述藥物中的神經(jīng)再生膠原支架材料是通過如下方法而制備得到：a)將筋膜用體積百分濃度為1-1.5％的磷酸三丁酯溶液處理24-72h；b)再用含有0.5-1.5mol/LNaCl的25-100mmol/L、pH為7.6-8.5的Tris-HCl緩沖液處理24-72h；c)最后，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml緩沖液處理48-96h，得到所述有序膠原材料，即神經(jīng)再生膠原支架材料，其中，所述緩沖液為25-100mmol/LTris-HCl，pH為7-8。上述方法中，步驟a)中，所述磷酸三丁酯溶液的溶劑為PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液。所述筋膜在處理前還要去除內(nèi)層粘附的肌肉組織和外層粘附的脂肪。步驟b)和c)中，所述處理的溫度均為2-8℃，優(yōu)選是4℃。步驟c)中，所述神經(jīng)再生膠原支架材料還包括將其用濃度為0.5-1.5mol/L強(qiáng)堿溶液處理5-10min的步驟。本發(fā)明所述藥物的制備方法，包括如下步驟：1)使神經(jīng)再生膠原支架材料吸收Cetuximab，得到含有Cetuximab的神經(jīng)再生膠原支架材料；2)對步驟1)中得到的含有Cetuximab的神經(jīng)再生膠原支架材料進(jìn)行孵育，得到所述功能神經(jīng)再生膠原支架材料，即所述藥物。上述制備方法中，步驟1)中，所述使神經(jīng)再生膠原支架材料吸收Cetuximab具體可按如下步驟操作：將長度為4-6mm、直徑為2-3mm神經(jīng)再生膠原支架材料浸泡在20-50μL、5μg/μL的Cetuximab溶液中，使其充分吸收Cetuximab。所述神經(jīng)再生膠原支架材料吸收Cetuximab的量主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)動物的體重而定的。上述制備方法中，步驟2)中，所述孵育是在0-10℃下孵育20-30min，具體可在0℃下孵育20-30min。本發(fā)明通過將EGFR(表皮生長因子受體)Cetuximab(西妥昔單抗)應(yīng)用于大鼠的小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)在髓鞘蛋白抑制條件下，Cetuximab能有效促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲伸長的作用。本發(fā)明具體通過將神經(jīng)再生膠原支架材料與EGFRCetuximab進(jìn)行復(fù)合后移植到犬T8脊髓全橫斷損傷模型之中，通過九個月的恢復(fù)和觀察，我們的研究證明移植復(fù)合EGFRantibody(表皮生長因子受體抗體)得到的功能神經(jīng)再生膠原支架能夠更好地促進(jìn)神經(jīng)纖維再生進(jìn)入損傷區(qū)，并能明顯減少損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕及其抑制分子CSPG的沉積。同時移植功能神經(jīng)再生膠原支架組的犬在損傷后能自發(fā)引導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元向損傷區(qū)遷移，這些進(jìn)入損傷區(qū)的神經(jīng)元包括運(yùn)動和感覺神經(jīng)元，它們在損傷區(qū)內(nèi)能實(shí)現(xiàn)很好的髓鞘化，并能產(chǎn)生功能性的突觸結(jié)果，為受損脊髓的功能性再生提供了中繼的角色。另外，移植功能神經(jīng)再生膠原支架組的犬術(shù)后表現(xiàn)出明顯優(yōu)于空白對照和移植單純神經(jīng)再生膠原支架組犬的運(yùn)動功能恢復(fù)，這也表明本研究中的移植功能神經(jīng)再生膠原支架治療策略具有更好的修復(fù)效果及良好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明通過犬全橫斷脊髓損傷模型發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生膠原支架材料除了作為支架引導(dǎo)神經(jīng)再生的作用，移植膠原支架材料后脊髓損傷部位的膠質(zhì)瘢痕相關(guān)的標(biāo)志物GFAP或CSPGs明顯減少，這說明神經(jīng)再生膠原支架除了為神經(jīng)再生提供支撐和方向上的引導(dǎo)外，還可以明顯抑制膠質(zhì)瘢痕的形成。同時，在該研究中，我們還證明，通過將EGFRCetuximab復(fù)合神經(jīng)再生膠原支架后移植到脊髓損傷區(qū)域能在髓鞘抑制分子Nogo存在的情況下有效促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生。此外，拮抗EGFR信號還能調(diào)動大量內(nèi)源性的神經(jīng)前體細(xì)胞及(或)神經(jīng)元自發(fā)遷移進(jìn)入到損傷區(qū)域，并能有效地再髓鞘化及形成功能性的突出聯(lián)系。綜上所述，本研究中以EGFRCetuximab與膠原支架材料復(fù)合形成的功能神經(jīng)再生膠原支架在未來臨床脊髓損傷修復(fù)的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。附圖說明圖1為實(shí)施例1中體外小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)絲、髓鞘蛋白存在下的小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)絲和EGFRCetuximab+髓鞘蛋白存在下的小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)絲的形態(tài)和長度圖。圖2為實(shí)施例2中脊髓損傷修復(fù)的神經(jīng)再生膠原支架(A)；及其與EGFR抗體復(fù)合后準(zhǔn)備移植時的形態(tài)(B)。圖3為實(shí)施例3中(A)犬T8脊髓全橫斷模型建立；(B)術(shù)中電生理監(jiān)測犬T8脊髓全橫斷模型質(zhì)量。圖4為實(shí)施例3中Masson染色觀察各組膠原性瘢痕沉積情況，其中，放大區(qū)域的標(biāo)尺為100μm。圖5為實(shí)施例3中CSPG染色觀察各組反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)瘢痕沉積情況，其中上側(cè)含黃色框的圖片內(nèi)標(biāo)尺為500μm，下側(cè)放大圖的標(biāo)尺為50μm。圖中的“Chondroitinsulfate/GFAP”為“硫酸軟骨素/膠質(zhì)纖維酸性蛋白”。圖6為實(shí)施例3中NF蛋白在各組的表達(dá)情況，其中左側(cè)含黃色框的圖片內(nèi)標(biāo)尺為500μm，右側(cè)放大圖的標(biāo)尺為50μm，圖中的“GFAP/NF/DAPI”為“膠質(zhì)纖維酸性蛋白/神經(jīng)絲蛋白/細(xì)胞核熒光染料DAPI”。圖7為實(shí)施例3中新生神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj-1、成熟神經(jīng)元標(biāo)志物Map2以及神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物Nestin蛋白在各組的表達(dá)情況，其中A、B和C內(nèi)含有中文標(biāo)注的圖片內(nèi)標(biāo)尺為500μm，下側(cè)放大圖的標(biāo)尺為50μm。圖8為實(shí)施例3中運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)志物5-HT、感覺神經(jīng)元標(biāo)志物TH在移植功能神經(jīng)再生膠原支架組中的具體表達(dá)情況(A和C)和在三組中表達(dá)量的比較(E)；B和D表示在移植功能神經(jīng)再生膠原支架組損傷區(qū)內(nèi)5-HT和TH神經(jīng)纖維的再髓鞘化；F表示功能性突觸標(biāo)志物SYN在各組中的表達(dá)。其中，A、C和F中的標(biāo)尺表示500μm,B和D中的標(biāo)尺表示50μm。圖9為實(shí)施例3中術(shù)后行為學(xué)評分情況。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所用神經(jīng)再生膠原支架材料是本實(shí)驗(yàn)室自制，方法參照專利ZL200510098731.5，具體制備步驟如下：1)預(yù)處理筋膜：取新鮮帶有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去離子水沖洗3遍，用鑷子和手術(shù)刀分離出筋膜，盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織和外層的脂肪等組織；2)將預(yù)處理筋膜按如下步驟制備有序神經(jīng)再生膠原支架：(a)1％TnBP(磷酸三丁酯)溶液(50mMTris-HCl，pH＝8.0，體積百分比)中處理48h；(b)50mMTris-Clbuffer(pH＝8.0，含有1MNaCl)中處理48h；(c)1g胰蛋白酶/100ml(50mMTris-HCl緩沖液，pH＝8.0)中處理72h；(d)1MNaOH中處理5min，充分清洗直至中性，凍干，即得到有序膠原材料(LOCS絲)，命名為神經(jīng)再生膠原支架材料。所制備得到的神經(jīng)再生膠原支架材料顏色為白色，形狀可根據(jù)實(shí)際情況制備，具體可為片狀、管狀或纖維狀；神經(jīng)再生膠原支架保持了天然膠原纖維的結(jié)構(gòu)，其具有有序的粗糙表面結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的貼附；本發(fā)明采用有序神經(jīng)再生膠原支架。實(shí)施例1、EGFR(表皮生長因子受體)Cetuximab(西妥昔單抗)能促進(jìn)體外小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞在髓鞘蛋白抑制條件下的神經(jīng)絲伸長。以新生7天大鼠的小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞(分離培養(yǎng)方法：將動物浸入75％乙醇中浸泡2-5min。在超凈臺中，斷頭，分離出小腦，取出放入預(yù)冷的PBS中，仔細(xì)地剔除血管和腦膜。彎剪剪碎，加DMEM高糖培養(yǎng)液，并用鈍頭粗口滴管輕輕吹打直到組織團(tuán)塊消失。然后用高溫高壓滅菌的400目尼龍膜過濾，離心1000rpm，5min，棄上清，按20000-30000個細(xì)胞每孔接種到含20％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的48孔板內(nèi)，培養(yǎng)于提前鋪被有200ng髓鞘蛋白(提取方法采用非連續(xù)性蔗糖密度梯度離心法。具體為從成年大鼠中取得脊髓，在0.3M蔗糖溶液中勻漿破碎，然后鋪到密度梯度為1.23和0.85M蔗糖濃度上。樣品于75000g離心45min。在0.85/1.23M蔗糖分界處收集提取的鞘蛋白片段。粗提取物用滲透壓休克洗兩次，重懸于0.32M蔗糖溶液中，成鋪到0.85M蔗糖溶液，離心，于0.32/0.85M蔗糖分界處收集鞘蛋白，除去多余的蔗糖，鞘蛋白按1：1比例溶解于DMEM培養(yǎng)基，勻漿后放-80℃?zhèn)溆?的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，處理組加入5μg的Cetuximab，培養(yǎng)24h后檢測神經(jīng)絲的伸長情況。其中，小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)絲免疫熒光染色步驟如下：(1)吸凈孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1-2次。(2)固定：4％多聚甲醛，室溫，20min后，用PBS洗3次(3)封閉：100％FBS，室溫1h后，用PBS洗1次(4)一抗孵育：用抗βⅢTubulin(1:500，購自Millipore公司，貨號05-559)，4℃，過夜，后用PBS洗3次(5)二抗孵育：按說明稀釋熒光二抗(購自invitrogen公司，貨號分別為：Alexa488DonkeyAnti-MouseIgG(H+L)；CA21202s；Alexa594DonkeyAnti-RabbitIgG(H+L)，A21207)于37℃孵育40min，后用PBS洗3次(6)核襯染：50μg/mlHoechst33342(購自sigma公司)，10min，PBS洗3次(7)顯微鏡下觀察，照相。相應(yīng)測試結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出：與對照組和髓鞘蛋白組相比，處理組(即髓鞘蛋白+EGFR抗體)在具抑制蛋白存在的情況下，Cetuximab能有效促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)絲伸長的作用。實(shí)施例2、制備含EGFR(表皮生長因子受體)Cetuximab(西妥昔單抗)的脊髓損傷功能神經(jīng)再生膠原支架材料：將用牛筋膜所制備得到的有序神經(jīng)再生膠原支架材料(長度為5mm，直徑為2mm)浸泡在含30μL、濃度為5μg/μL(含150μgCetuximab)的Cetuximab液體(購自德國默克里昂制藥公司，商品規(guī)格為100毫克/20毫升/瓶)中，使其全部被神經(jīng)再生膠原支架吸收，冰上孵育30min即制備得到含EGFRCetuximab的脊髓損傷功能神經(jīng)再生膠原支架材料。相應(yīng)的形態(tài)如圖2所示，圖2(A)為有序神經(jīng)再生膠原支架的形態(tài)圖；圖2(B)為含EGFRCetuximab的脊髓損傷功能神經(jīng)再生膠原支架的形態(tài)圖，從圖2可看出：有序神經(jīng)再生膠原支架束經(jīng)功能化后可塑形的形態(tài)。實(shí)施例3、用含EGFRCetuximab的脊髓損傷功能神經(jīng)再生膠原支架材料治療5mm犬T8脊髓全橫斷損傷：1)制備5mm犬T8脊髓全橫斷損傷模型，并移植功能膠原支架材料至損傷區(qū)域：首先制備犬脊髓T8全橫斷損傷模型(如圖3A所示)，選擇6只1周歲左右的比格犬，體重在7～9公斤左右，麻醉后，磁共振定位脊髓T8段，打開T7-T9椎板暴露脊髓組織，將T8段經(jīng)游離全橫斷5mm，制作犬急性T8全橫斷損傷模型；然后將制備好的功能神經(jīng)再生膠原支架材料橋接在損傷區(qū)域之內(nèi)。再進(jìn)行無縫連接。術(shù)中電生理檢測體感誘發(fā)電位和動作電位的消失來檢測全橫斷的模型質(zhì)量(如圖3B所示)，從圖3B可得出：.手術(shù)前，所有實(shí)驗(yàn)犬的左右后肢脛神經(jīng)的運(yùn)動誘發(fā)電位及其體感誘發(fā)電位均能正常檢測到，而在實(shí)施完成T8全橫斷損傷實(shí)驗(yàn)后，上述各種電生理活動均消失，無法被檢測到，證實(shí)T8全橫斷損傷模型質(zhì)量可靠。2)術(shù)后九個月后經(jīng)形態(tài)學(xué)染色(如圖4所示)、免疫熒光染色(如圖5-圖8所示)和行為學(xué)評分(如圖9所示)等多項(xiàng)檢測綜合評價移植功能膠原支架材料對犬脊髓全橫斷損傷后的修復(fù)效果：a)膠原性瘢痕沉積染色：術(shù)后九個月將犬處死后，迅速將脊髓取出，于4％多聚甲醛固定液中固定48小時，分別在20％和30％的蔗糖中進(jìn)行沉糖脫水。然后以O(shè)CT(opti-mumcuttingtemperaturecompound、一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，常作為冰凍切片包埋劑)包埋組織進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為15μm；隨后將切片進(jìn)行Masson染色鑒定膠原性瘢痕組織的沉積情況；具體步驟如下：(1)取出切片晾干；(2)依次用自來水和蒸餾水清洗；(3)用Regaud蘇木精染液或Weigert蘇木精液染核5-10min；(4)充分水洗，若過染可鹽酸酒精分化；(5)蒸餾水洗；(6)用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色5-10min；(7)以體積分?jǐn)?shù)為2％的冰醋酸水溶液浸洗片刻；(8)1％磷鉬酸水溶液分化3-5min；(9)不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)或光綠液染色5min；(10)以體積分?jǐn)?shù)為0.2％的冰醋酸水溶液浸洗片刻；(11)先用體積分?jǐn)?shù)為95％的酒精水溶液和無水酒精清洗后，再用二甲苯透明中性樹膠封固從圖4可得知：移植了單純神經(jīng)再生膠原支架材料組和功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬損傷處的膠原性瘢痕的沉積量要相對比空白對照組(control組)低，說明移植支架材料或功能支架材料均能一定程度降低膠原性瘢痕組織的沉積。b)免疫熒光染色檢測反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌的抑制分子CSPG表達(dá)：術(shù)后九個月，我們對犬脊髓切片進(jìn)行免疫熒光染色，以確定損傷處的反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CSPGs的沉積。做法如下：(1)將切片用PBS洗一遍后，用山羊血清封閉液封閉20-40min；(2)吸去山羊血清，PBS洗兩遍，將切片周圍的水用吸水紙擦凈；(3)加入200μL左右混合了來源于小鼠的anti-CSPG抗體(1:200)和來源于兔的anti-GFAP(1:500)的一抗于切片組織上，使液體完全覆蓋脊髓組織；(4)4℃下孵育過夜；(5)PBS洗凈兩三遍；(6)按照二抗說明書稀釋的熒光二抗(購自invitrogen公司，貨號分別為：Alexa488DonkeyAnti-MouseIgG(H+L)，CA21202s；Alexa594DonkeyAnti-RabbitIgG(H+L),A21207)，室溫孵育1小時，注意避光操作；(7)PBS洗兩遍，避光自然晾干；(8)滴加含DAPI的封片劑后，封上蓋玻片，顯微鏡下觀察，照相。從圖5可得知：無論是移植單純神經(jīng)再生膠原支架材料組還是移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬，其GSPG的表達(dá)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白對照組(control組)犬的表達(dá)量；該結(jié)果說明我們的有序神經(jīng)再生膠原支架材料能夠明顯抑制膠質(zhì)瘢痕的沉積及其抑制分子CSPG的表達(dá)，是一種非常好的可用于脊髓損傷后修復(fù)的生物支架材料。c)免疫熒光染色檢測神經(jīng)絲蛋白NF表達(dá)：術(shù)后九個月，我們對犬脊髓切片進(jìn)行神經(jīng)絲蛋白NF免疫熒光染色以確定再生進(jìn)入損傷區(qū)的神經(jīng)纖維的數(shù)量和密度。具體染色步驟同b)中所述，所使用的一抗為鼠來源的anti-NF抗體(1:200)以及兔來源的anti-GFAP抗體(1:500)；從圖6可得知：移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬長入損傷區(qū)內(nèi)的神經(jīng)纖維數(shù)量明顯高于移植單純神經(jīng)再生膠原支架材料組及空白對照組(control組)，此外，移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的NF陽性纖維在損傷區(qū)內(nèi)可見較明顯的縱向有序排列，說明EGFR抗體復(fù)合神經(jīng)再生膠原支架材料能更好的引導(dǎo)受損神經(jīng)纖維的有序再生。d)免疫熒光染色檢測神經(jīng)前體細(xì)胞及神經(jīng)元向損傷區(qū)的遷移：術(shù)后九個月，我們對犬脊髓切片進(jìn)行神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、新生神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj-1以及成熟神經(jīng)元標(biāo)志物Map2的免疫熒光染色以確定再生進(jìn)入損傷區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞及神經(jīng)元的數(shù)量和密度；具體染色步驟同b)中所述，所使用的一抗分別為鼠來源的anti-Nestin抗體(1:200)、anti-Tuj-1抗體(1:200)、anti-Map2抗體(1:200)以及兔來源的anti-GFAP抗體(1:500)。結(jié)果顯示：移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬長入損傷區(qū)內(nèi)的新生的神經(jīng)元(圖7A)、成熟的神經(jīng)元細(xì)胞(圖7B)以及神經(jīng)前體細(xì)胞(圖7C)的數(shù)量明顯高于移植單純神經(jīng)再生膠原支架材料組及空白對照組(control組)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7D-7F)，說明EGFR抗體復(fù)合神經(jīng)再生膠原支架材料能更好的引導(dǎo)脊髓損傷后內(nèi)源性的神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元向損傷區(qū)的遷移。e)免疫熒光染色檢測損傷區(qū)內(nèi)的感覺和運(yùn)動神經(jīng)元及其髓鞘化以及損傷區(qū)內(nèi)功能性突觸的形成：術(shù)后九個月，我們對犬脊髓切片進(jìn)行運(yùn)動神經(jīng)元標(biāo)志物5-HT、感覺神經(jīng)元標(biāo)志物TH以及髓鞘蛋白標(biāo)志物MBP的免疫熒光染色以確定再生進(jìn)入損傷區(qū)的感覺和運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量及其髓鞘化的程度；具體染色步驟同b)中所述，所使用的一抗分別為鼠來源的anti-5-HT抗體(1:200)、anti-TH抗體(1:200)以及兔來源的anti-GFAP抗體(1:500)和anti-MBP抗體(1:200)。結(jié)果顯示：移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬長入損傷區(qū)內(nèi)的運(yùn)動神經(jīng)元(圖8A)和運(yùn)動神經(jīng)元(圖8C)的數(shù)量均顯著高于單純移植神經(jīng)再生膠原支架材料組及空白對照組(control組)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8E)。這些再生進(jìn)入損傷區(qū)的感覺和運(yùn)動神經(jīng)元的神經(jīng)纖維均能有效地髓鞘化(圖8B和8D)，上述結(jié)果說明EGFR抗體復(fù)合神經(jīng)再生膠原支架材料能更好的引導(dǎo)脊髓損傷后運(yùn)動和感覺神經(jīng)元的再生，并能實(shí)現(xiàn)再生神經(jīng)元的髓鞘化。此外，通過對功能性突觸標(biāo)志物Synaptophysin(一抗為鼠來源的anti-SYN，1:200)的免疫熒光染色結(jié)果表明，移植單純神經(jīng)再生膠原支架材料組及空白對照組(control組)的犬在損傷區(qū)內(nèi)功能性突觸幾乎不能檢測到，而移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬損傷區(qū)內(nèi)的SYN陽性標(biāo)志橫跨整個損傷區(qū)均可被檢測到(圖8F)，說明EGFR抗體復(fù)合神經(jīng)再生膠原支架材料能具有更好的促進(jìn)脊髓損傷再生的效果。f)術(shù)后九個月犬的行為學(xué)評分：術(shù)后零至九個月，我們每月均對犬的行為學(xué)進(jìn)行評價，觀測器運(yùn)動功能的恢復(fù)情況。行為學(xué)評分采用Olby評分。在評估過程中，犬在一個開放的環(huán)境中自由移動，由兩名觀察者評分。評分分為0-14級，14分為功能正常，0分為功能完全喪失。觀察者為非本組實(shí)驗(yàn)人員，但熟悉評分細(xì)則，Olby評分標(biāo)準(zhǔn)如下：分?jǐn)?shù)行為0無任何后肢運(yùn)動或深度疼痛2無任何后肢運(yùn)動，但尾部自發(fā)運(yùn)動3后肢不能承重，僅有一個關(guān)節(jié)(髖關(guān)節(jié))運(yùn)動4后肢不能承重，多于一個關(guān)節(jié)運(yùn)動，運(yùn)動時間小于50％5后肢不能承重，多于一個關(guān)節(jié)運(yùn)動，運(yùn)動時間大于50％6后肢能承重，但承重時間小于10％7后肢能承重，但承重時間在10-50％之間8后肢能承重，承重時間大于50％9后肢100％承重，但肌力沒有完全恢復(fù)，步態(tài)錯誤時間大于90％10后肢100％承重，但肌力沒有完全恢復(fù)，步態(tài)錯時間在50-90％之間11后肢100％承重，但肌力沒有完全恢復(fù)，步態(tài)錯誤時間小于50％12肌力正常，但后肢步態(tài)混亂，錯誤時間大于50％13肌力正常，但后肢步態(tài)混亂，錯誤時間小于50％14正常步態(tài)行為學(xué)評分結(jié)果顯示：從術(shù)后第一月開始，移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬較對照組犬均具有顯著性改善(圖9，帶*標(biāo)志)，此外，自第三月開始，移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬較單純移植神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬表現(xiàn)出行為學(xué)優(yōu)勢(圖9，帶△標(biāo)志)，部分犬能夠偶爾后肢稱重站立并能邁步行走(圖9)。上述結(jié)果表明，移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料修復(fù)治療策略能顯著改善脊髓全橫斷后犬的運(yùn)動功能恢復(fù)。總之，我們將有序神經(jīng)再生膠原支架材料與EGFR抗體(表皮生長因子受體抗體)Cetuximab進(jìn)行復(fù)合后移植到犬T8脊髓全橫斷損傷模型之中，通過九個月的恢復(fù)和觀察，我們的研究證明移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料能夠更好地促進(jìn)神經(jīng)纖維再生進(jìn)入損傷區(qū)，并能明顯減少損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕及其抑制分子CSPG的沉積。同時移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬在損傷后能自發(fā)引導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元向損傷區(qū)遷移，這些進(jìn)入損傷區(qū)的神經(jīng)元包括運(yùn)動和感覺神經(jīng)元，它們在損傷區(qū)內(nèi)能實(shí)現(xiàn)很好的髓鞘化，并能產(chǎn)生功能性的突觸結(jié)果，為受損脊髓的功能性再生提供了中繼的角色。另外，移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料組的犬術(shù)后表現(xiàn)出明顯優(yōu)于空白對照和單純移植神經(jīng)再生膠原支架材料組組犬的運(yùn)動功能恢復(fù)，這也表明本研究中的移植功能神經(jīng)再生膠原支架材料的治療策略具有更好的修復(fù)效果及良好的臨床應(yīng)用前景。當(dāng)前第1頁1 2 3