專利名稱：焦磷酸測序法檢測k-ras基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測序法檢測K-RAS基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
抗表皮生長因子受體的單克隆抗體(如西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗等)可與表達(dá)于正常細(xì)胞和多種癌細(xì)胞表面的EGF受體特異性結(jié)合，并競爭性阻斷EGF和其他配體，如a轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-a )的結(jié)合。分別是針對(duì)EGF受體的IgGl和IgG2單克隆抗 體，兩者特異性結(jié)合后，通過對(duì)與EGF受體結(jié)合的酪氨酸激酶(TK)的抑制作用，阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生。吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，該酶通常表達(dá)于上皮來源的實(shí)體瘤。對(duì)于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨礙腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移和血管生成，并增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。K-ras基因定位于人類染色體12p，編碼一種具有GTP酶活性的小G蛋白，是表皮生長因子受體(EGFR)功能信號(hào)的下游分子，在膜受體到腺苷環(huán)化酶信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用?，F(xiàn)有的研究顯示，90%的K-ras基因突變位于2號(hào)外顯子的第12和13密碼子位點(diǎn)，其中第12位密碼子(約82%)是結(jié)直腸癌中最常見的突變位點(diǎn)，這種K-ras基因催化活性區(qū)的突變，導(dǎo)致Ras蛋白不依賴EGFR/HER受體激活而持續(xù)活化。此時(shí)EGFR抑制劑或單克隆抗體雖然阻滯EGFR激活信號(hào)的下傳，但是KRAS突變不依賴上游EGFR信號(hào)的持續(xù)激活，使得下游信號(hào)仍處于激活狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)對(duì)EGFR抑制劑或單克隆抗體的拮抗作用，即不敏感。根據(jù)上述遺傳藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，美國食品及藥品監(jiān)督管理局(FDA)在2009年修改靶向藥物的使用說明，其中明確闡述了抗表皮生長因子受體的單克隆抗體藥效與K-RAS基因密切相關(guān)性，并要求使用該類藥物前進(jìn)行K-RAS基因突變檢測以幫助醫(yī)生判斷適用人群。而我國食品及藥品監(jiān)督管理局(SFDA)也于同年召開靶向藥物基因檢測聽證會(huì)，且于2010年發(fā)布的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》中明確指出K-ras基因檢測的必要性。綜上所述，對(duì)K-RAS基因第2號(hào)外顯子第12號(hào)密碼子以及13號(hào)密碼子多態(tài)性進(jìn)行分型檢測可預(yù)測患者對(duì)抗表皮生長因子受體的單克隆抗體的反應(yīng)性，為臨床醫(yī)生給結(jié)直腸癌制定藥物治療方案提供依據(jù)。開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測K-RAS基因多態(tài)性的試劑盒將為抗表皮生長因子受體的單克隆抗體的臨床個(gè)體化治療起到積極的推動(dòng)作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容
K-RAS基因(SEQ ID NO. I)多態(tài)性是影響抗表皮生長因子受體的單克隆抗體能否使用的最主要因素。本發(fā)明提供一種臨床檢測使用抗表皮生長因子受體的單克隆抗體生物標(biāo)志物的用藥基因K-RAS多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
所述焦磷酸測序法檢測K-RAS基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物
(1)擴(kuò)增引物
K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子上游引物5’ -TGA CTG AAT ATAAAC TTG TGG TAG TTG -3’ (SEQ ID NO. 2)；
K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子下游引物5’ - TCG TCC ACA AAA TGA TTC TGA A -3’ (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5’進(jìn)行生物素標(biāo)記；
(2)測序引物
K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子測序引物5’ - CTT GTG GTA GTT GGAGCT -3’ (SEQ ID NO. 4)；
在實(shí)際應(yīng)用中，可以對(duì)上述引物作適當(dāng)改變，只要保證設(shè)計(jì)的引物與上述引物同源性達(dá)95%以上即可；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。所述應(yīng)用上述試劑盒檢測K-RAS基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟
(1)DNA 提??；
(2)聚合酶鏈反應(yīng)
配制 50 ill PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 5 u I, dNTP 3. 0 yl，上游引物 I yl，下游引物I U 1，rTaql yl，水37. 0 yl，模板2. 0 iU ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95
V5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30S,50°C 30S,72°C 30S，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；再在72°C保持7min,最終保持在4 V，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。本發(fā)明試劑盒對(duì)K-ras基因檢測的第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子目標(biāo)序列:野生型GG T GG CGT (SEQ ID NO. 5)和突變型NNNNCGT (SEQ ID NO. 6);擴(kuò)增出的片段長為91bp。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥基因進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于臨床上抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥方案制定的基因檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發(fā)明K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)、13號(hào)密碼子均為野生型焦磷酸測序結(jié)果；圖2為本發(fā)明K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子為突變型、13號(hào)密碼子為野生型焦磷酸測序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)上述試劑盒及檢測方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :
K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子上游引物5’ -TGA CTG AAT ATAAAC TTG TGG TAG TTG -3’ (SEQ ID NO. 2)；
K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子下游引物5’ - TCG TCC ACA AAATGA TTC TGA A -3’ (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5’進(jìn)行生物素標(biāo)記；
K-RAS第2號(hào)外顯子12號(hào)密碼子、13號(hào)密碼子測序引物5’ - CTT GTG GTA GTT GGAGCT -3’ (SEQ ID NO. 4)；
I. DNA提取
I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識(shí)處打勾V ; (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對(duì)應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識(shí)做好標(biāo)記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I.14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出；
I.15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I.16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；
I.17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I.18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；
I. 20在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側(cè)放風(fēng)干；
I. 21目測沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標(biāo)清樣本唯一性編號(hào)，并用透明膠帶纏繞保護(hù)；
1.24保存核酸標(biāo)本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應(yīng)
2.I在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制50 Ul PCR擴(kuò)增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
IOxPCRbiiffer5 鄭I
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測K-ras基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物 (1)擴(kuò)增引物上游引物5’ - TGA CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG -3’ ；下游引物5’ - TCG TCC ACA AAA TGA TTC TGA A-3，；其中，下游引物的5’進(jìn)行生物素標(biāo)記； (2)測序引物:5，-CTT GTG GTA GTT GGA GCT -3’。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測K-RAS基因多態(tài)性多態(tài)性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提??； (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 ill PCR 擴(kuò)增體系，包含10 X PCR buffer 5 u I, dNTP 3. 0 yl，上游引物 I yl，下游引物Iu 1，1^&(11111，水37111，模板2.0111 ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95 V5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30S, 50°C 30S, 72°C 30S，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；再在72°C保持7min,最終保持在4°C，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測抗表皮生長因子受體的單克隆抗體個(gè)體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法。具體是指K-ras基因第2號(hào)外顯子第12號(hào)密碼子以及13號(hào)密碼子多態(tài)性。試劑盒包含如SEQIDNO.3—4所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量對(duì)K-ras基因突變進(jìn)行檢測，從而達(dá)到對(duì)抗表皮生長因子受體的單克隆抗體(如西妥昔單抗、尼妥珠單抗、帕尼單抗等)用藥實(shí)現(xiàn)安全合理有效的個(gè)體化給藥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102796815SQ201210230460
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者周宏灝 申請(qǐng)人:周宏灝