土貝母[Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet(Cucurbitaceae)]是一種傳統(tǒng)中藥，載于清代趙學(xué)敏氏所編《本草綱目拾遺》，藥用部分為其鱗莖。在古代用它來治療乳巖、乳癰、乳腺增生和瘰疬等各種疾患，臨床上顯示出明顯的散結(jié)毒、消癰腫效果。中醫(yī)用它來治療食道癌、胃癌等，其消除梗阻、減小腫塊、延長(zhǎng)生命效果顯著。
土貝母總皂苷(簡(jiǎn)稱總皂苷)由土貝母苷甲、苷乙和苷丙(簡(jiǎn)稱苷甲、苷乙、苷丙)組成，其標(biāo)志性成分土貝母苷甲的含量＞30％。苷甲、苷乙和苷丙是從土貝母塊莖中分離純化出的三種單體皂苷，其化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定(圖1)，其相對(duì)分子量分別為1318，1334和1364。三種土貝母皂苷中以苷甲的含量最高，苷乙和苷丙次之。上述土貝母皂苷均為具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的五環(huán)三萜類皂苷，酸水解后釋放出貝咢苷元(bayogenin)和四種糖：葡萄糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖。苷甲與苷乙化學(xué)結(jié)構(gòu)的唯一區(qū)別是：苷甲16位碳上連-H，而苷乙16位碳上連-OH。苷丙的的化學(xué)結(jié)構(gòu)與苷甲的區(qū)別是：苷丙A位碳上連-OH，苷甲A位碳上連-H；苷丙B位碳上連-OH，苷甲B位碳上連-O；苷丙C位碳上連-CH2O，苷甲C位碳上連-H。苷甲、苷乙水溶性和穩(wěn)定性都好。皂苷易容于水和85％(及以下)乙醇。
臭汗癥(bromhidrosis，osmidrosis)分小汗腺臭汗癥和大汗腺臭汗癥2型。①大汗腺臭汗癥：發(fā)生在大汗腺分布部位，即腋窩、乳暈、臍窩、陰部和肛門等處。以腋窩部的臭味最明顯，稱為腋臭。女性多于男性，與遺傳有關(guān)。其汗液可為黃、綠、紅或黑色。汗液經(jīng)皮膚表面的細(xì)菌主要是葡萄球菌的分解，產(chǎn)生不飽和脂肪酸而發(fā)出臭味。由于大汗腺到青春期才開始活動(dòng)，老年期逐漸退化，故腋臭主要見于青壯年。②小汗腺臭汗癥：常與多汗癥伴發(fā)，有全身性臭汗癥和局限性臭汗癥2種。全身性臭汗癥可 因衛(wèi)生習(xí)慣不良或食用大蒜、洋蔥、麝香而發(fā)生，亦有屬于生理性者。局限性臭汗癥以足部臭汗癥最常見，由于足部多汗使皮膚角質(zhì)層浸軟被細(xì)菌分解而發(fā)臭，稱為足臭。
發(fā)明概要
本發(fā)明涉及土貝母總皂苷(Bolbostemma total saponins)消除臭汗癥臭味的用途。本發(fā)明還涉及土貝母苷甲、苷乙、苷丙單獨(dú)，或其任何兩種或兩種以上組合物消除臭汗癥臭味的用途。本發(fā)明也涉及土貝母總皂苷，土貝母苷甲、苷乙、苷丙單獨(dú)，或其任何兩種或兩種以上組合物作為除臭劑與任何香料香精組成化妝品的用途。
一、本發(fā)明涉及的土貝母總皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)工藝
1、原料
1.1產(chǎn)地：陜西省大荔縣。
1.2選料：選擇飽滿、個(gè)大、紅棕色、質(zhì)堅(jiān)實(shí)、有亮光、半透明的土貝母塊莖，去除不飽滿、質(zhì)地輕、黑或暗黃色的塊莖及其他雜物。
1.3原料中苷甲含量的測(cè)定
按照我國(guó)藥典2010年版一部(P16)土貝母項(xiàng)下《含量測(cè)定》操作，水分測(cè)定依照藥典2010年版一部附錄(P52)IX H水分測(cè)定法第一法(烘干法)操作。
2、工業(yè)化生產(chǎn)工藝
2.1水提取
粉碎土貝母塊莖，過8mm圓孔工業(yè)篩，得土貝母粗粉。以6～12倍體積(倍數(shù)為水體積與土貝母質(zhì)量之比)的飲用水，保持一定壓力(0.02～0.10MPa)、溫度(100～120℃)，不回流或回流(回流提取效果更好)提取3次，每次提取時(shí)間分別為3h、2h、2h。合并提取液，過300目工業(yè)篩，回收濾液。減壓濃縮，回收濃縮液。
2.2大孔吸附樹脂分離
2.2.1大孔吸附樹脂NKA-9(苯乙烯骨架型)對(duì)于總皂苷有較好的吸附和解吸性能。樹脂柱的徑高比為1∶7。
2.2.2上樣液：水提取濃縮液(相當(dāng)于土貝母生藥含量150～300g/L)。
2.2.3上樣量：NKA-9樹脂(干重)∶土貝母生藥(干重)＝1∶0.5～1.0。
2.2.4上樣流速：1.5BV/h。
2.2.5洗脫：先用6～10BV的蒸餾水洗脫，然后用4～8BV 15～30％乙醇洗脫，洗脫流速為3BV/h。再以3～4BV的70～90％乙醇洗脫，洗脫流速為1～2BV/h。薄層層析法(按《中國(guó)藥典》2010年版第一部，土貝母項(xiàng)下的[鑒別]進(jìn)行操作，定性檢測(cè)洗脫液是否含苷甲。開始洗脫液為褐色，洗至終點(diǎn)時(shí)，洗出液澄清透明，微黃。
2.2.6收集、合并70～90％乙醇洗脫液中苷甲檢測(cè)陽(yáng)性部分。回收乙醇，減壓濃縮并噴霧干燥，得干燥細(xì)粉。
2.2.7檢測(cè)：總皂苷含量采用5％香草醛冰醋酸溶液-脫水硫酸為顯色劑，90℃加熱顯色，分光光度法在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；苷甲含量按照我國(guó)藥典2010年版一部(P16)土貝母項(xiàng)下《含量測(cè)定》操作；大孔吸附樹脂殘留物或裂解物采用頂空進(jìn)樣，氣相色譜法測(cè)定苯、二甲苯、苯乙烯、二苯乙烯、烷烴類等。有機(jī)溶劑殘留量按照我國(guó)藥典2010年版二部(附錄VE，附錄31-32)所載氣相色譜法檢測(cè)。
2.2.8檢測(cè)結(jié)果：產(chǎn)品中總皂苷含量＞75％；苷甲含量＞30％；未檢出大孔吸附樹脂殘留物；未檢出殘留有機(jī)溶劑(乙醇)。
3、土貝母總皂苷的穩(wěn)定性
土貝母總皂苷的無(wú)菌水溶液室溫保存1.5年、75％乙醇溶液室溫保存2年，其組成無(wú)明顯改變、活性無(wú)明顯降低。
二、本發(fā)明涉及的土貝母總皂苷消除臭汗癥臭味的用途
以下列舉觀察案例，以資作為土貝母總皂苷可消除腋臭癥、足臭癥和全身性臭汗癥臭味，而又不影響汗液正常分泌的證據(jù)。
1、土貝母水煎劑、土貝母乙醇冷浸提取液用于腋臭癥、足臭癥的初步觀察
1.1土貝母粗粉100g，加飲用水，武火煮沸，文火煎1h，冷卻，過濾，濾液，得濾液100ml左右。
1.2土貝母粗粉100g，60％加乙醇，冷浸3次，每次8h，過濾并回收濾液，得濾液100ml左右。
1.3每日沐浴后，以棉球或紗布蘸取土貝母水煎劑濾液或土貝母乙醇冷浸濾液，均勻并充分涂布于臭汗癥患者的腋窩、足掌、足趾部皮膚。
1.4結(jié)果
腋臭癥4例、足臭癥6例臭味明顯減輕。上述兩種濾液的應(yīng)用均對(duì)皮膚無(wú)任何刺激，無(wú)過敏表現(xiàn)，也不影響汗液的正常分泌。
2、土貝母總皂苷用于腋臭癥、足臭癥的初步觀察
2.1材料
土貝母總皂苷噴霧干燥細(xì)粉，公司自制，配制成10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的土貝母總皂苷水溶液和75％乙醇溶液。
2.2觀察對(duì)象
腋臭癥10例(男4，女6)，足臭癥男10例，20～50歲
2.3使用方法
2.3.1局部涂抹：全身沐浴后，根據(jù)臭汗癥的嚴(yán)重程度(輕、中、重)，分別選用10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的土貝母總皂苷水溶液或75％乙醇溶液，以棉球或紗布蘸取，均勻涂布于腋窩、足掌、足趾部皮膚。
2.3.2局部噴灑：全身沐浴后，根據(jù)臭汗癥的嚴(yán)重程度(輕、中、重)，分別選用10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的總皂苷水溶液或75％乙醇溶液，局部涂抹或噴灑于腋窩、足掌、足趾部皮膚。
3、結(jié)果
腋臭癥(7/10)、足臭癥(6/10)臭味消失，其余腋臭癥(3/10)、足臭癥(4/10)的臭味明顯減輕。輕度腋臭癥、足臭癥人群涂布1次后，如能保持衛(wèi)生，可維持1～3日無(wú)臭或臭味減輕，即便是重度臭汗癥人群，涂 布1次，在夏季也可維持1～2日無(wú)臭或臭味減輕。土貝母總皂苷的應(yīng)用對(duì)皮膚無(wú)任何刺激，無(wú)過敏表現(xiàn)，也不影響汗液的正常分泌。
土貝母苷甲、苷乙、苷丙單獨(dú)，或其任何兩種或兩種以上組合物，顯示類似效果。
三、本發(fā)明涉及的土貝母總皂苷的安全性評(píng)估
以下列舉實(shí)驗(yàn)，以資作為評(píng)估土貝母總皂苷局部皮膚應(yīng)用安全的證據(jù)。
1、土貝母總皂苷的急性毒性試驗(yàn)
采用成年ICR健康小鼠，雌雄各半，常規(guī)方法做急性毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，土貝母總皂苷肌肉注射的半數(shù)致死量(LD50)為35.3mg/kg，腹腔注射的LD50為20.7mg/kg，灌胃的LD50為308.8mg/kg。
土貝母皂苷的標(biāo)志性成分土貝母苷甲肌肉注射的半數(shù)致死量(LD50)為40.28mg/kg，灌胃的LD50為315.80mg/kg。
2、土貝母總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的皮膚刺激性試驗(yàn)
委托湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，實(shí)施土貝母總皂苷實(shí)驗(yàn)兔的皮膚刺激性試驗(yàn)。按照國(guó)家GLP規(guī)范要求，取背部脫毛處理的檢疫合格實(shí)驗(yàn)兔8只，雌雄各半，按性別體重采用區(qū)段隨機(jī)方法分為完整皮膚組和破損皮膚組。每組4只，完整皮膚組在每只實(shí)驗(yàn)兔背部左側(cè)已去毛的完整皮膚上均勻涂布土貝母總皂苷75％乙醇溶液(20mg/ml)0.5ml，在每只實(shí)驗(yàn)兔背部右側(cè)已去毛的完整皮膚涂布溶劑75％乙醇0.5ml；破損皮膚組在每只實(shí)驗(yàn)兔背部左側(cè)已去毛的破損皮膚上均勻涂布土貝母總皂苷75％乙醇溶液(20mg/ml)0.5ml；在每只實(shí)驗(yàn)兔背部右側(cè)已去毛的破損皮膚均涂溶劑75％乙醇0.5ml。均用玻璃紙、兩層紗布和無(wú)刺激膠布固定，藥物接觸皮膚時(shí)間為4h，然后除去包裹物，并用溫水清潔給藥部位，每天按上法給藥一次，連續(xù)5天在同一部位給藥。給藥期在去除藥物后1h以及再次涂布前分別觀察及記錄每只實(shí)驗(yàn)兔給藥部位紅斑、水腫、色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄情況，以及其發(fā)生 和消退時(shí)間，并對(duì)紅斑及水腫進(jìn)行評(píng)分。末次涂布后，在去除藥物后30-60min，24、48和72h肉眼觀察并記錄涂敷部位有無(wú)紅斑和水腫等情況。
結(jié)果顯示，土貝母總皂苷完整皮膚給藥側(cè)、破損皮膚給藥側(cè)，75％乙醇完整皮膚對(duì)照側(cè)、破損皮膚對(duì)照側(cè)，涂布局部皮膚表面肉眼觀察均未見紅斑、水腫、糜爛、壞死，皮下組織亦未見水腫、壞死等變化。
結(jié)論：土貝母總皂苷((20mg/ml)，每天給藥1次(0.5ml/只)，同一部位連續(xù)給藥5天，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔皮膚無(wú)明顯刺激性反應(yīng)。
3、土貝母總皂苷給予豚鼠的主動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)
委托湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，實(shí)施土貝母總皂苷對(duì)豚鼠的主動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)。按照國(guó)家GLP規(guī)范要求，選取檢疫合格的體重300～400g的白色豚鼠18只，雌雄各半，分為3組，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和土貝母總皂苷組。實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行脫毛處理。在第0天、第7天和第14天，將75％乙醇、1％2，4-二硝基氯苯70％乙醇溶液和土貝母總皂苷75％乙醇溶液(20mg/ml)，分別涂在相應(yīng)的動(dòng)物左側(cè)背部脫毛區(qū)，0.5ml/只，玻璃紙和二層紗布覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，6h后用溫水去掉藥物。末次給受試物致敏后14天，在激發(fā)接觸階段，將75％乙醇、0.1％2，4-二硝基氯苯70％乙醇溶液、土貝母總皂苷75％乙醇溶液(20mg/ml)，分別涂于相應(yīng)的動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū)，0.5ml/只，玻璃紙和二層紗布覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。6h后用溫水去掉藥物，即可比較觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，然后于24h、48h、72h再次觀察。觀察土貝母總皂苷對(duì)豚鼠主動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)。結(jié)果顯示，涂布1％2，4-二硝基氯苯的陽(yáng)性對(duì)照組，過敏反應(yīng)致敏反應(yīng)率為100％(6h)、100％(24h)、50％(48h)和16.7％(72h)，皮膚致敏性評(píng)價(jià)分別為極度致敏性(6h)、極度致敏性(24h)、中度致敏性(48h)和輕度致敏性(72h)；涂布75％乙醇的陰性對(duì)照組，過敏反應(yīng)6h、24h、48h和72h致敏反應(yīng)率均為0，皮膚致敏性評(píng)價(jià)均為無(wú)致敏性；涂 布土貝母總皂苷組，過敏反應(yīng)6h、24h、48h和72h致敏反應(yīng)率均為0，皮膚致敏性評(píng)價(jià)均為無(wú)致敏性。
結(jié)論：土貝母總皂苷(20mg/ml)對(duì)豚鼠未見明顯主動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)。
四、土貝母總皂苷作為除臭劑與任何香料香精組成化妝品的用途。
1、香水：10％～30％香精，0.2％～0.5％土貝母總皂苷，溶解于脫臭乙醇。
上述配方的香水，兼有除臭和散發(fā)香氣兩種作用，用來噴灑于衣襟、手帕及發(fā)際，散發(fā)出悅?cè)说南銡狻?/p>
2、古龍水：2％～5％香精，0.2％～0.5％土貝母總皂苷，溶解于脫臭乙醇和精制水。
上述配方的香水，兼有除臭和散發(fā)香氣兩種作用，可用于手帕、床巾等，散發(fā)出令清新、舒適、愉快的香氣。
3、花露水：除花露水本身的成分外，加0.5％～1.0％土貝母總皂苷。涂于蚊叮、蟲蛟之處，有止癢、消腫之效，涂在患痱子的皮膚上亦能止癢，且有涼爽、舒適之感。
4、化妝水：5％～15％香精，0.2％～0.5％土貝母總皂苷，加化妝水的其他成分。
上述配方的化妝水，兼有除臭和散發(fā)香氣兩種作用。因此，有臭汗癥或異常體味人群噴灑或涂抹這種化妝水后，渾身則隨風(fēng)散發(fā)出陣陣香精的幽香，而不是臭汗癥的臭味與化妝水的幽香混合所產(chǎn)生的帶有一股股異味的“香味”。
香精可選用單體香型或復(fù)合香型。單體香型，如玫瑰、茉莉、檀香、桂花......；復(fù)合香型，如香奈兒5號(hào)、美好......。
土貝母苷甲、苷乙、苷丙單獨(dú)，或其任何兩種或兩種以上組合物作為除臭劑與任何香型的香料香精組成化妝水或香水顯示類似效果。
附圖說明
圖1土貝母苷甲、苷乙和苷丙的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖
五、實(shí)施例
1、水劑和酊劑
土貝母總皂苷100g、200g、300g、400g分別加滅菌去離子水或75％醫(yī)用乙醇20000ml；得5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml總皂苷水溶液或總皂苷75％乙醇溶液，無(wú)菌分裝，每安瓶5ml。
上述配方土貝母總皂苷酊劑或水劑分別用于不同程度(輕、中、重)的臭汗癥患者。
土貝母苷甲、苷乙、苷丙單獨(dú)，或其任何兩種或兩種以上組合物與土貝母總皂苷同法配方組成酊劑或水劑。
2、粉劑
按0.5～2.0％土貝母總皂苷的比例，將其加入市售的各種爽身粉，賦予爽身粉以消除臭汗癥人群體臭的功能。
土貝母苷甲、苷乙、苷丙單獨(dú)，或其任何兩種或兩種以上組合物與土貝母總皂苷同法配方組成爽身粉。