本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)領(lǐng)域和化妝品領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種通過(guò)水煎煮方式進(jìn)行提取后采用醇沉取上清液方式得到的肉蓯蓉上清混合物。此外，本發(fā)明還涉及所述方法提取得到的肉蓯蓉上清混合物的皮膚屏障修復(fù)作用，具體涉及該肉蓯蓉上清混合物在制備具有皮膚屏障修復(fù)作用的化妝品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚屏障功能包括物理性屏障，色素屏障，神經(jīng)屏障，免疫屏障作用以及其他與皮膚功能相關(guān)的諸多方面，而我們?cè)谌粘Ｉ钪兴f(shuō)的皮膚屏障大多指的是其物理性皮膚屏障。從細(xì)胞分化和組織形成的角度來(lái)看，皮膚的物理性屏障功能不僅依賴(lài)于表皮角質(zhì)層，而且依賴(lài)于表皮全層結(jié)構(gòu)；從生化組成和功能作用方面看來(lái)，表皮的物理性屏障結(jié)構(gòu)不僅和表皮的脂質(zhì)有關(guān)，也和表皮的各種蛋白質(zhì)、水、無(wú)機(jī)鹽以及其他代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。

現(xiàn)代皮膚科學(xué)認(rèn)為，皮膚外觀的健康舒適與屏障功能的完善密不可分，這也與傳統(tǒng)理論中“固表護(hù)衛(wèi)”的最重要健康觀不謀而合。皮膚屏障受損或功能失調(diào)，是損美性肌膚問(wèn)題的重要根因。皮膚屏障功能被破壞，表皮內(nèi)的水分會(huì)經(jīng)過(guò)角質(zhì)層丟失，使皮膚變得干燥，從而引起或加重一些皮膚疾病。許多皮膚病如老年性皮膚瘙癢癥、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、痤瘡以及干燥性皮膚等與皮膚屏障功能下降有關(guān)。

皮膚屏障主要由角化包膜和脂質(zhì)膜、中間絲聚合蛋白、角蛋白、角化橋粒、板層小體和角質(zhì)層角質(zhì)形成細(xì)胞間質(zhì)、緊密連接等一系列物質(zhì)/結(jié)構(gòu)組成，它能防止水分的丟失及阻止外界的侵害，維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。一部分表皮細(xì)胞從基底層開(kāi)始，經(jīng)過(guò)一系列生長(zhǎng)分化過(guò)程，最終會(huì)遷移至皮膚表面形成完全角質(zhì)化的細(xì)胞套膜，而這些正是表皮角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)的物質(zhì)基 礎(chǔ)。上述過(guò)程涉及的蛋白質(zhì)主要有兩類(lèi)：即細(xì)胞角蛋白(Keratin)和角蛋白中間絲相關(guān)蛋白(Keratin intermediate filaments-associated protein，KI-PAP)。這些重要的中間絲相關(guān)蛋白，包括，絲聚合蛋白(Filaggrin)，兜甲蛋白(Loricrin)，外皮蛋白(Involucrin)，角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷酰胺酶(Transglutaminase Keratinocyte，TGK)等等。中間絲相關(guān)蛋白是形成皮膚角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的異常表達(dá)都可能引起一系列以皮膚屏障功能損傷為特征的皮膚病癥。

皮膚屏障的完整性，同時(shí)還與角質(zhì)形成細(xì)胞的活力有關(guān)，有利用皮膚細(xì)胞的增值更新。

肉蓯蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)為列當(dāng)科肉蓯蓉屬多年生寄生性藥用植物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其具有抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力、抗疲勞等作用。肉蓯蓉生長(zhǎng)在極度干旱，炎熱的沙漠中，自然條件的長(zhǎng)期作用下，使之形成了一套適應(yīng)環(huán)境的體系。如肉蓯蓉葉片退化為鱗形，軀體富含水分形成肉質(zhì)，獨(dú)特的根部“吸器”。同時(shí)，在惡劣環(huán)境的刺激下，肉蓯蓉能產(chǎn)生某一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，保護(hù)機(jī)體生存。

目前關(guān)于肉蓯蓉的研究大多都集中在水提物醇沉部分的抗衰老和清除自由基的作用。尚未發(fā)現(xiàn)將肉蓯蓉進(jìn)行水提醇沉后，對(duì)上清液部分的研究。也就是說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)均未公開(kāi)本發(fā)明所述的肉蓯蓉上清混合物，該肉蓯蓉上清混合物是通過(guò)水煎煮方式進(jìn)行提取后采用醇沉取上清液得到的。意外地發(fā)現(xiàn)，該肉蓯蓉上清混合物作用于角質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)與皮膚屏障密切相關(guān)的蛋白(Involucrin以及Claudin-1)的表達(dá)情況得到改善，證實(shí)了該提取物的保護(hù)皮膚屏障的功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有皮膚屏障修復(fù)作用的肉蓯蓉上清混合物。按照本發(fā)明方法制備得到的肉蓯蓉上清混合物中糖含量范圍為23.37％-62.60％之間，蛋白質(zhì)含量范圍為15.74-35.57％。本發(fā)明中，我們主要檢測(cè)了肉蓯蓉上清混合物作用于角質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)與皮膚屏障密切相關(guān)的蛋白(Involucrin以及Claudin-1)的表達(dá)情況。研究證實(shí)這兩種蛋白的表達(dá)均提高， 進(jìn)一步證明本發(fā)明的肉蓯蓉上清混合物具有保護(hù)皮膚屏障的功效。

一方面，本發(fā)明提供了一種從肉蓯蓉提取得到肉蓯蓉上清混合物的方法，該方法包括以下步驟：

a)水浴條件下，加水煎煮提??；

b)濃縮后用有機(jī)溶劑沉淀；

c)取上清液，離心后得到肉蓯蓉上清混合物。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，從肉蓯蓉提取得到肉蓯蓉上清混合物的方法還包括在步驟a)之后進(jìn)行超濾的工藝。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，超濾能夠截留分子量在10000以上的分子。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟a)在80-100℃的條件下進(jìn)行。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟a)中肉蓯蓉原料與水的重量比為1:20至1:30。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟b)的有機(jī)溶劑是具有1-4個(gè)碳原子的低級(jí)醇。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟b)的有機(jī)溶劑是丙酮。

在本發(fā)明的另一方面，提供了通過(guò)本發(fā)明方法制備得到的肉蓯蓉上清混合物。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，以重量百分比計(jì)，本發(fā)明的肉蓯蓉上清混合物中糖含量范圍為23.37％-62.60％，蛋白質(zhì)含量范圍為15.74-35.57％。

在本發(fā)明的另一方面，提供了按照本發(fā)明方法制備得到的肉蓯蓉上清混合物可應(yīng)用于皮膚外用劑、保健食品和醫(yī)藥，尤其是可應(yīng)用于化妝品中，根據(jù)制劑的不同類(lèi)型添加不同的用量。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種具有皮膚屏障修復(fù)作用的化妝品，所述化妝品包含按照本發(fā)明方法制備得到的肉蓯蓉上清混合物以及化妝品領(lǐng)域可接受的賦形劑。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述化妝品還包含另一種具有皮膚屏障修復(fù)老作用的添加劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述化妝品選自：潔面乳、化妝水、乳液、膏霜、啫喱、面膜。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肉蓯蓉上清混合物在皮膚外用劑中的重量百分比為0.0001％-20％(w/w)，優(yōu)選的重量百分比為0.001％-10％(w/w)，更優(yōu)選的重量百分比為0.01％-5％(w/w)。

所述皮膚外用劑組合物是通常用于皮膚外部的所有成分的統(tǒng)稱(chēng)概念， 例如可以是化妝料組合物或藥學(xué)組合物。所述化妝料組合物中可以是基礎(chǔ)化妝料、面部妝容化妝料、身體用化妝料、頭發(fā)護(hù)理用化妝料等，對(duì)其劑型無(wú)特殊限制，根據(jù)不同目的可合理選擇。

所述化妝料組合物中根據(jù)劑型和目的的不同還含有不同的化妝品學(xué)層面允許的介質(zhì)或基質(zhì)賦形劑。

可以用于本發(fā)明皮膚外用劑組合物的化妝品、皮膚病學(xué)或藥學(xué)上可接受的賦形劑為水相、油相、凝膠、水包蠟型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相為一種或多種水溶性或分散性組分的混合物，其在室溫(25℃)下可以為液體、半固體或固體。賦形劑包括或可以為在水或水-醇賦形劑中的混懸液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠劑或凝膠劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的知識(shí)選擇合適的產(chǎn)品形式，其中包含的組分。

所述的組合物可以包括水相，該水相可以含有水或水與至少一種親水性有機(jī)溶劑的混合物，所述的親水性有機(jī)溶劑諸如醇，尤其是含有2-5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈低級(jí)一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。

當(dāng)發(fā)明的組合物為乳液形式時(shí)，該組合物還可以任選包含表面活性劑。

所述的組合物還可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烴的樹(shù)脂和/或硅氧烷樹(shù)脂?？梢詫⒕酆衔锶苡诨蚍稚⒂诨瘖y品可接受的賦形劑中并且任選與增塑劑合并。

本發(fā)明的組合物還可以包含油相，所述的油相含有在室溫(25℃)下為液體的油溶性或油分散性組分和/或在室溫下為油狀或蠟狀的物質(zhì)，如蠟、半固體、樹(shù)膠及其混合物。該油相還可以含有有機(jī)溶劑。

通常在室溫下為液體，合適的油性物質(zhì)包括：來(lái)源于動(dòng)物的基于烴的油，如全氫化角鯊烯；基于烴的植物油，如液體的C4-10脂肪酸的甘油三酯類(lèi)，例如庚酸或辛酸甘油三酯類(lèi)，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鱷梨油、辛酸/癸酸甘油三酯類(lèi)、霍霍巴油；礦物 或合成來(lái)源的直鏈或支鏈烴類(lèi)，例如液體石蠟及其衍生物、凡士林；合成酯類(lèi)和醚類(lèi)，特別是脂肪醇的酯類(lèi)，例如肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、異硬脂酸異硬脂醇酯；羥基化酯類(lèi)，例如乳酸異硬脂醇酯、羥基硬脂酸辛酯、羥基硬脂酸辛酯、羥基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯類(lèi)、辛酸酯類(lèi)和癸酸脂類(lèi)；多元醇酯類(lèi)，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二異壬酸酯和季戊四醇酯類(lèi)；含有C12-26的脂肪醇類(lèi)，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烴的氟油和/或氟硅油，硅油，在室溫下為液體或半固體的揮發(fā)性或非揮發(fā)性的直鏈或環(huán)狀聚甲基硅氧烷，例如環(huán)狀聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任選包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。

本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含常用于化妝品領(lǐng)域中的任何組分。這些組分包括防腐劑、水相增稠劑(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠劑、芳香劑、親水性和親脂性活性劑及其混合物。

本發(fā)明的組合物還可以包含另外的顆粒相，所述的顆粒相可以為化妝品組合物中使用的顏料和/或珠光劑和/或填充劑。

顏料可以存在于組合物中，合適的無(wú)機(jī)顏料包括氧化鈦、氧化鋯和氧化鈰以及氧化鋅、氧化鐵和鐵藍(lán)；合適的有機(jī)顏料包括鋇、鍶、鈣和鋁色淀和碳黑。

珠光劑可以存在于組合物中，合適的珠光劑包括涂覆了氧化鈦、氧化鐵或天然顏料的云母。

填充劑可以存在于組合物中，合適的填充劑包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鋅、云母、高嶺土、尼龍粉末、聚乙烯粉末、特氟龍、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷樹(shù)脂微珠。

本發(fā)明組合物的油相可以包含一種或多種蠟、樹(shù)膠或其混合物。蠟包括基于烴的蠟、氟蠟和/或硅氧烷蠟，并且可以來(lái)源于植物、礦物、動(dòng)物和/或合成來(lái)源。合適的蠟包括蜂蠟、巴西棕櫚蠟、小燭樹(shù)蠟、石蠟、微晶蠟、 地蠟；合成蠟包括聚乙烯蠟、含有C16-45的硅氧烷蠟。樹(shù)膠一般為聚二甲基硅氧烷或羧甲基纖維素鈉或提取物類(lèi)，并且半固體物質(zhì)一般為基于烴的化合物，如羊毛脂及其衍生物。

可以將本發(fā)明的組合物配制成任何合適的產(chǎn)品形式。這類(lèi)產(chǎn)品形式包括，但不限于氣溶膠型噴霧劑、霜?jiǎng)?、乳液、固體、液體、分散體、泡沫、凝膠、化妝水、摩絲、軟膏、粉劑、貼劑、潤(rùn)發(fā)油、溶液、手按泵型噴霧劑、棒狀物、面膜和濕紙巾?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的各種方法便利地用于制備或作為化妝品、皮膚病學(xué)或藥物局部施用產(chǎn)品。

本發(fā)明的皮膚外用劑組合物可以包括一種或多種下列成分：抗過(guò)敏劑、抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、著色劑去色素劑、潤(rùn)膚劑、乳化劑、表皮脫落劑、成膜劑、香料、保濕劑、昆蟲(chóng)驅(qū)避劑、潤(rùn)滑劑、藥物活性劑、增濕劑、耐光劑、防腐劑、護(hù)膚劑、皮膚滲透增強(qiáng)劑、防曬劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、增稠劑、粘度調(diào)節(jié)劑、維生素或其任意組合。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明肉蓯蓉上清混合物的提取工藝流程圖。

圖2顯示了本發(fā)明肉蓯蓉上清混合物對(duì)表皮細(xì)胞活力影響的結(jié)果。

圖3顯示了本發(fā)明肉蓯蓉上清混合物對(duì)皮膚屏障修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但是，應(yīng)該明白，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另有說(shuō)明，所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。

本發(fā)明實(shí)施例中使用的儀器設(shè)備如下：

SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司。

85-2型恒溫磁力攪拌器：上海思樂(lè)儀器有限公司。

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。

N-1100D-WD真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本EYELA公司。

UV260可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本Shimadzu。

GL-21M低溫高速離心機(jī)：上海離心機(jī)研究所有限公司。

Labconco大型冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司。

Edwards小型冷凍干燥機(jī)：英國(guó)Edwards公司。

全波長(zhǎng)雙板多功能儀(酶標(biāo)儀)：美國(guó)BMG Labtech公司Novostar

細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo serial II

以下實(shí)施例1-6描述了本發(fā)明涉及的肉蓯蓉上清混合物的制備方法并對(duì)制備工藝進(jìn)行考察。所述肉蓯蓉產(chǎn)自甘肅或新疆。

實(shí)施例1

取肉蓯蓉鱗莖500g，水浴溫度80℃提取，肉蓯蓉藥材與每次加水量的比例為1:20,提取物濃縮至3-5L，超濾，收集分子量約10000以上的截留液，濃縮后，加入有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇等低級(jí)醇，丙酮)攪拌進(jìn)行沉淀，靜置，沉淀離心，4℃過(guò)夜，離心取上清液。

實(shí)施例2

取肉蓯蓉鱗莖500g，水浴溫度80℃提取，肉蓯蓉藥材與每次加水量的比例為1:30，提取物濃縮至3-5L，超濾，收集分子量約10000以上的截留液，濃縮后，加入有機(jī)溶劑(甲醇，乙醇等低級(jí)醇，丙酮)攪拌進(jìn)行沉淀，靜置，沉淀離心，4℃過(guò)夜，離心取上清液。

實(shí)施例3

取肉蓯蓉鱗莖500g，水浴溫度80℃提取，肉蓯蓉藥材與每次加水量的比例為1:50，提取物濃縮至3-5L，超濾，收集分子量約10000以上的截留液，濃縮后，加入有機(jī)溶劑(甲醇，乙醇等低級(jí)醇，丙酮)攪拌進(jìn)行沉淀，靜置，沉淀離心，4℃過(guò)夜，離心取上清液。

實(shí)施例4

取肉蓯蓉鱗莖500g，水浴溫度100℃提取，肉蓯蓉藥材與每次加水量的比例為1:20，提取物濃縮至3-5L，超濾，收集分子量約10000以上的截留液，濃縮后，加入有機(jī)溶劑(甲醇，乙醇等低級(jí)醇，丙酮)攪拌進(jìn)行沉淀，靜置，沉淀離心，4℃過(guò)夜，離心取上清液。

實(shí)施例5

取肉蓯蓉鱗莖500g，水浴溫度100℃提取，肉蓯蓉藥材與每次加水量的比例為1:30，提取物濃縮至3-5L，超濾，收集分子量約10000以上的截留液，濃縮后，加入有機(jī)溶劑(甲醇，乙醇等低級(jí)醇，丙酮)攪拌進(jìn)行沉淀，靜置，沉淀離心，4℃過(guò)夜，離心取上清液。

實(shí)施例6

取肉蓯蓉鱗莖500g，水浴溫度100℃提取，肉蓯蓉藥材與每次加水量的比例為1:50，提取物濃縮至3-5L，超濾，收集分子量約10000以上的截留液，濃縮后，加入有機(jī)溶劑(甲醇，乙醇等低級(jí)醇，丙酮)攪拌進(jìn)行沉淀，靜置，沉淀離心，4℃過(guò)夜，離心取上清液。

實(shí)施例7：糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法對(duì)實(shí)施例1-6制備得到的肉蓯蓉上清混合物進(jìn)行糖含量測(cè)定。

苯酚-硫酸法是目前應(yīng)用最廣泛的測(cè)定糖含量的方法，其原理是在強(qiáng)酸條件下將待測(cè)的糖樣品水解成單糖，單糖在濃硫酸中脫水生成糠醛，進(jìn)而與苯酚形成黃色復(fù)合物，利用比色法可進(jìn)行測(cè)定，該方法特別適用于寡糖，多糖或糖復(fù)合物中糖含量的測(cè)定。

試劑：苯酚(分析純)，重蒸后配成50g/L(5％，w/v)水溶液；濃硫酸(分析純，d＝1.84g/cm³)；標(biāo)準(zhǔn)溶液(150μg/mL)：取已經(jīng)干燥的葡萄糖7.5mg，溶于水中，定溶至50mL。待測(cè)樣液配制成固含1％的溶液，并稀釋50倍。

測(cè)定時(shí)取上取濃度分別為0,30,60,90,120,150μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液0.2mL， 加5％苯酚0.4mL，振蕩后加濃硫酸2.0mL，振蕩，在室溫放置30min，以空白管(0#)為對(duì)照測(cè)定OD₄₉₀。

取0.2mL樣品，按標(biāo)準(zhǔn)液同樣方法測(cè)定OD₄₉₀。

結(jié)果如下表所示：

表1

實(shí)施例8：蛋白質(zhì)含量測(cè)定(凱氏定氮法)

對(duì)實(shí)施例1-6制備得到的肉蓯蓉上清混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。樣品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸錢(qián)。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量即刻得到氮的含量，再乘以相應(yīng)的換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。

結(jié)果如下表所示：

表2

通過(guò)表1-2中糖含量及蛋白質(zhì)含量的比較和分析，同時(shí)考慮到工業(yè)生產(chǎn)的可操作性以及成本經(jīng)濟(jì)性，我們選擇提取溫度為100℃，物料比為1:20，這一提取物做為研究對(duì)象，并對(duì)其皮膚屏障修復(fù)作用進(jìn)行檢測(cè)。

因此，在下面的實(shí)施例中取實(shí)施例4制備得到的肉蓯蓉上清混合物，制得1g/ml生藥濃度的樣品，其固體含量為11.38％。

做功效評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行配制，其母液濃度為1％，即10mg/ml。

實(shí)施例9：肉蓯蓉上清混合物的皮膚屏障作用

(1)肉蓯蓉上清混合物對(duì)表皮細(xì)胞活力的作用

在96孔板每孔加入50μl含0.2％生長(zhǎng)因子的細(xì)胞培養(yǎng)液，再用排槍加入150μl成纖維細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種量為8500個(gè)/孔，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸出150μl培養(yǎng)基，再加入含有肉蓯蓉上清混合物的培養(yǎng)基150μl/孔，使其終濃度為0.1mg/ml，0.3mg/ml，加入含有肉蓯蓉沉淀部分的培養(yǎng)基150μl/孔，使其終濃度為0.02mg/ml，0.1mg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)48h后重新按之前所述方法更換一次培養(yǎng)基，24h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗后，加入125μl 0.2mg/ml的XTT反應(yīng)液(含0.1％PMS，Sigma)，再培養(yǎng)2h后在酶標(biāo)儀上450nm處測(cè)定吸光度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2表明，肉蓯蓉上清混合物在濃度為0.1mg/ml和0.3mg/ml的條件下，分別使得表皮細(xì)胞活力分別增加了7.06％和13.34％。而肉蓯蓉沉淀部分在濃度為0.02mg/ml和0.1mg/ml的條件下，使得表皮細(xì)胞活力分別下降了15.71％和19.37％。從該結(jié)果可以看出，肉蓯蓉沉淀部分對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有一定的影響，因此在接下來(lái)考察對(duì)皮膚相關(guān)蛋白的影響實(shí)驗(yàn)中，我們著重對(duì)肉蓯蓉上清混合物進(jìn)行檢測(cè)。

(2)肉蓯蓉上清混合物對(duì)跟皮膚屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在8孔板每孔加入500μl細(xì)胞培養(yǎng)液，再分別加入500μl角質(zhì)細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種量為1.83×104個(gè)/孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸出培養(yǎng)基，再加入含有肉蓯蓉上清混合物的培養(yǎng)基各1ml，使其終濃度為0.1mg/ml。藥物濃度已做過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)，對(duì)該細(xì)胞密度下的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)毒害作用。37℃5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。用丙酮固定細(xì)胞后，用單克隆抗體(一抗)分別處理每孔細(xì)胞12h后洗去，再用含有熒光集團(tuán)的二抗(sigma)染色2h。洗去后，最終用DAPI溶液襯染細(xì)胞核，洗去，并封片。

本發(fā)明中，我們主要檢測(cè)了肉蓯蓉上清混合物作用于角質(zhì)細(xì)胞后，細(xì) 胞內(nèi)兩個(gè)與皮膚屏障密切相關(guān)的蛋白(Involucrin以及Claudin-1)的表達(dá)情況，并證實(shí)了該提取物的保護(hù)皮膚屏障的功效。Involucrin(外皮蛋白)，是在角質(zhì)細(xì)胞再分化過(guò)程中角質(zhì)包膜形成的關(guān)鍵蛋白，而角質(zhì)包膜是角質(zhì)層內(nèi)細(xì)胞膜廣泛交聯(lián)后形成的堅(jiān)韌外膜，是表皮防御屏障功能的基礎(chǔ)，保障皮膚不受外界刺激物損傷故而外皮蛋白對(duì)皮膚維持正常的屏障功能非常重要；Claudin-1，是一種緊密連接蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的主要蛋白股骨架，在維持緊密連接特有的柵欄功能和屏障功能具有很重要的作用，調(diào)控皮膚內(nèi)水分及無(wú)機(jī)鹽的交換，并阻止其他物質(zhì)通過(guò)，維持皮膚內(nèi)在的穩(wěn)態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3表明，肉蓯蓉上清混合物在0.1mg/ml的條件下(XTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的無(wú)毒濃度)能夠明顯提高角質(zhì)細(xì)胞中與肌膚屏障功能密切相關(guān)的外皮蛋白和緊密連接蛋白的表達(dá)：Involucrin以及Claudin的含量。

取實(shí)施例1-6中制備的肉蓯蓉上清混合物，用于皮膚外用劑的制備。所述皮膚外用劑優(yōu)選為化妝品組合物，例如化妝水、精華液、乳霜等。所述黃精果膠類(lèi)多糖在皮膚外用劑中的重量百分比為0.0001％-20％(w/w)，優(yōu)選的重量百分比為0.001％-10％(w/w)，更優(yōu)選的重量百分比為0.01％-5％(w/w)。

以下是肉蓯蓉上清混合物在皮膚外用劑中的具體應(yīng)用的實(shí)施例，及其這些劑型的配方和制備方法。以下各表中“-”表示無(wú)添加。

以下實(shí)施例10-20中所使用的肉蓯蓉上清混合物均為實(shí)施例4制備得到的肉蓯蓉上清混合物，其生藥濃度為1g/ml；實(shí)施例3-13中各組分的單位均為重量百分比。

實(shí)施例10：面霜的制備

實(shí)施例11：乳液的制備

實(shí)施例12：?jiǎn)ㄠ闹苽?/p>

實(shí)施例13：化妝水的制備

實(shí)施例14：精華液的制備

實(shí)施例15：面膜的制備

實(shí)施例16：眼霜的制備

實(shí)施例17：氣霧(清潔泡)的制備

實(shí)施例18：噴霧的制備

實(shí)施例19：沐浴露的制備

實(shí)施例20：洗面奶的制備

以上實(shí)施例10-20中所述的肉蓯蓉上清混合物均經(jīng)過(guò)①穩(wěn)定性測(cè)試，將料體分別在-20℃、4℃、室溫、48℃、循環(huán)(連續(xù)變換四個(gè)溫度條件)放置12周，各料體的顏色和形態(tài)都保持穩(wěn)定；②皮膚安全性測(cè)試，證實(shí)對(duì)皮膚無(wú)刺激，不會(huì)引發(fā)紅斑、脫屑、刺痛及灼熱等不良反應(yīng)，可安心使用。