本發(fā)明涉及白屈菜紅堿在治療禽耐藥性大腸桿菌病上的應(yīng)用，具體涉及一種治療禽耐藥性大腸桿菌病的藥物。
背景技術(shù)：
禽大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌引起的局部或全身性感染的傳染病，其特征是引起雞的心包炎、氣囊炎、肝周炎、腹膜炎、滑膜炎、肉芽腫、腸炎、腦炎、皮下水腫、敗血癥等多種臨診病型，并且還常常與病毒和其它細(xì)菌性疾病并發(fā)，造成雞群死亡率高，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于大腸桿菌的抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血清型多，傳播途徑多，加之我國(guó)飼養(yǎng)環(huán)境普遍較差，病原污染嚴(yán)重，使得近年來(lái)該病的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的最嚴(yán)重的疾病之一。
隨著抗生素在禽大腸桿菌病預(yù)防和治療方面的廣泛、持續(xù)及不當(dāng)使用，大腸桿菌耐藥譜不斷擴(kuò)大，耐藥水平不斷提高，大腸桿菌耐藥及多重耐藥現(xiàn)象已十分嚴(yán)重，耐藥菌株增高、耐藥基因在細(xì)菌之間的傳播、耐藥菌株通過(guò)食物鏈和人與動(dòng)物的直接接觸傳染人、引起人和動(dòng)物疾病治療的失敗，這些危害對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類健康都是十分嚴(yán)重的。
白屈菜紅堿(chelerythrine，CHE)別名白屈菜赤堿、白屈菜季銨堿，是從飛龍掌血、白屈菜、博落回、血水草等植物中分離的異喹啉的苯并菲啶型類生物堿?？扇苡诼确隆⒓状?，易溶于乙醇等。國(guó)內(nèi)外對(duì)白屈菜紅堿的藥理活性研究表明，其具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、殺蟲、抗纖維化等多種藥理活性。大量試驗(yàn)結(jié)果表明，白屈菜紅堿具有廣泛的抗細(xì)菌和抗真菌作用，對(duì)大腸桿菌具有良好的抑菌活性。白屈菜紅堿在人用藥物臨床上已有使用，但在獸用禽藥領(lǐng)域，尚未見相關(guān)報(bào)道。
綜上所述，白屈菜紅堿在獸藥技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用拓寬了獸醫(yī)在臨床治療上的選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明的內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于將白屈菜紅堿應(yīng)用于治療禽耐藥性大腸桿菌病，并將白屈菜紅堿作為活性成分用于制備禽耐藥性大腸桿菌病的治療的藥物。藥物為以白屈菜紅堿為主要活性成分的藥物制劑，其含量為0.1-99％。白屈菜紅堿在藥物中存在形式為藥物原型或其藥學(xué)上可接受的鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等。
本發(fā)明公開了一種治療耐藥性禽大腸桿菌病的藥物，所述的藥物以白屈菜紅堿為主要活性成分，還可以包括臣藥和佐藥，如黃連、白頭翁、黃柏、白芍、郁金、黃苓等藥材的提取物或其中的代表成分，其余為藥物可接受的載體。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
血水草中白屈菜紅堿的提?。孩俳幔悍Q取適量的樣品，加入PH值為1的鹽酸水溶液，放入水浴槽中，在100℃條件下，提取30min，提取出血根堿和白屈菜紅堿。②分離：利用大孔吸附樹脂吸附分離血水草中的血根堿和白屈菜紅堿，用100％乙醇洗脫分離。
白屈菜中白屈菜紅堿的提取：取白屈菜粉末2g，加入料液比為1∶20的70％乙醇溶液，在700w超聲波功率條件下提取30min，利用大孔吸附樹脂吸附分離。
本發(fā)明所公開的藥物是由白屈菜紅堿與相應(yīng)的藥用輔料制成的所需劑型。涉及的中藥制劑可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括：片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、粉劑、溶液劑、注射劑等。
其中顆粒劑的制備方法為：取提取得到的白屈菜紅堿1份，糖粉3份，糊精1份，過(guò)80目篩，混合均勻，用80％酒精制成適宜的軟材，將軟材過(guò)14目篩制粒，于60℃下干燥，干燥后的顆粒用12目篩整粒，包裝即得。
注射劑的制備方法為：取風(fēng)干或曬干全草20克粗粉，加PH4的硫酸水溶液，煎煮2次，每次30分鐘。紗布過(guò)濾，合并濾液，濃縮至稠糖漿狀。緩緩滴加氫氧化鈉溶液至PH9-10，放置，濾取溶液中析出的棕黑 色沉淀，加乙醇使其溶解，用3號(hào)垂熔漏斗過(guò)濾，濾液加收乙醇后加PH4-5磷酸水溶液使總體積為100毫升，加苯甲酸1毫升，過(guò)濾，用2毫升安瓿灌封制為20％注射液，用100℃蒸氣滅菌30分鐘。
本發(fā)明公開的用于治療禽耐藥性大腸桿菌的藥物可用于耐藥性禽大腸桿菌的治療，大量體外抑菌試驗(yàn)和臨床治療試驗(yàn)表明，本發(fā)明公開的藥物對(duì)耐藥性禽大腸桿菌有明顯的抑制作用。不僅可以治療耐藥性禽大腸桿菌病，同時(shí)也對(duì)非耐藥性大腸桿菌病也有很好的療效。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例1 白屈菜紅堿的提取方法
血水草中白屈菜紅堿的提取方法。浸提：稱取適量的樣品，加入PH值為1的鹽酸水溶液，放入水浴槽中，在100℃條件下，提取30min，提取出血根堿和白屈菜紅堿。分離：利用大孔吸附樹脂吸附分離血水草中的血根堿和白屈菜紅堿，用100％乙醇洗脫分離。該方法污染少、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好，產(chǎn)品收率高、純度高，可適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
白屈菜中自屈菜紅堿的提取方法：取白屈菜粉末2g，加入料液比為1∶20的70％乙醇溶液，在700w超聲波功率條件下提取30min，利用大孔吸附樹脂吸附分離。白屈菜紅堿提取率較大。
具體實(shí)施例2 白屈菜紅堿的含量測(cè)定方法
按照高效液相色譜法測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1％磷酸溶液(25∶75)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為282nm；流速1.0ml/min；理論塔板數(shù)按白屈菜紅堿峰計(jì)算不得低于3000。
對(duì)照品溶液的制備：取白屈菜紅堿對(duì)照品10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
供試品溶液的制備：取本品10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
以下通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
具體實(shí)施例3 制劑制備方法
1.顆粒劑的制備：
取提取得到的白屆菜紅堿1份，糖粉3份，糊精1份，過(guò)80目篩，混合均勻，用80％酒精制成適宜的軟材，將軟材過(guò)14目篩制粒，于60℃一下干燥，干燥后的顆粒用12目篩整粒，包裝即得。
2.注射劑的制備：
注射劑：取風(fēng)干或曬干全草20克粗粉，加PH4的硫酸水溶液，煎煮2次，每次30分鐘。紗布過(guò)濾，合并濾液，濃縮至稠糖漿狀。緩緩滴加氫氧化鈉溶液至PH9-10，放置，濾取溶液中析出的棕黑色沉淀，加乙醇使其溶解，用3號(hào)垂熔漏斗過(guò)濾，濾液加收乙醇后加PH4-5磷酸水溶液使總體積為100毫升，加苯甲酸1毫升，過(guò)濾，用2毫升安瓿灌封制為20％注射液，用100℃蒸氣滅菌30分鐘。
根據(jù)治療方法的需要，本發(fā)明的中藥制劑可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、粉劑、溶液劑、注射劑等。
具體實(shí)施例4 對(duì)禽耐藥性大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)
1材料
1.1試驗(yàn)藥品
白屈菜紅堿供試液(本實(shí)驗(yàn)室自行提取)，本試驗(yàn)中白屈菜紅堿的起始濃度為5000μg/ml。1.2耐藥性禽大腸桿菌
由遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康養(yǎng)殖與評(píng)價(jià)中心分離鑒定，并經(jīng)耐藥性檢測(cè)，對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星、阿莫西 林、頭孢噻肟、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶鈉均有不同程度的耐藥
1.3培養(yǎng)基
肉湯培養(yǎng)基，稱取30g，加入1000ml蒸餾水，加熱煮沸，溶解分裝，成分：牛肉粉15g，蛋白胨10g，氯化鈉5g。PH值：7.0-7.4。購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
肉湯瓊脂培養(yǎng)基，稱取45g，加入1000ml蒸餾水，加熱煮沸，溶解分裝成分(g/L)：牛肉粉10g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂18g，磷酸氫二鉀2g。PH值：7.0-7.4。購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
兩種培養(yǎng)基均經(jīng)121℃壓力蒸汽滅菌20min后放置4℃冰箱中保存待用。
1.4試驗(yàn)器材
有棉塞的無(wú)菌試管，1ml微量加樣器，酒精燈，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋，電子分析天平，平皿，三角錐瓶，移液管，燒杯，細(xì)菌涂布器，電爐等。
2方法
2.1供試菌液的制備：將活化的耐藥大腸桿菌菌種(共三株)分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日挑選單個(gè)菌落1-2個(gè)接種于2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱16-18h培養(yǎng)后取出，用移液管吸取0.5ml，用生理鹽水作10-1的梯度稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9四個(gè)滴度的菌液各0.1ml在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上攤開，再培養(yǎng)18-24h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，將供試菌液用培養(yǎng)液稀釋至104cfu/ml。
2.2抑茵試驗(yàn)：
2.2.1試管倍比稀釋法抑菌試驗(yàn)：
排列具棉塞的無(wú)菌試管，每列10管，各管均加入1.0ml培養(yǎng)基，用吸管吸取白屈菜紅堿供試藥液放入第1管，并反復(fù)吹勻；接著從第1管吸出1ml放入第2管同樣吹勻后吸出1ml放入第3管，依次逐管進(jìn)行稀釋到第8管，第10管不加白屈菜紅堿藥液，作為細(xì)菌對(duì)照組，第9管只加藥液，不加菌液，作為藥物對(duì)照組。第1-8及第10管各加入耐藥性禽大腸桿菌菌液0.5ml。37℃培養(yǎng)16-18h后觀察結(jié)果。如果試管澄清透明，搖勻后仍透明，認(rèn)為該管無(wú)菌生長(zhǎng)，若試管呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明有菌生長(zhǎng)。以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。試驗(yàn)重復(fù)2次，取其平均值。
3結(jié)果
37℃培養(yǎng)16-18h后觀察結(jié)果顯示，大腸桿菌菌液的試管全部清亮，所以另取3組試管重新測(cè)定，每組15支。37℃培養(yǎng)16-18h后觀察結(jié)果顯示，前13管大腸桿菌菌液的試管全部清亮，發(fā)現(xiàn)第14管以后試管出現(xiàn)渾濁，所以其MIC值為0.00625μg/ml。證明禽大腸桿菌對(duì)白屈菜紅堿敏感。
4結(jié)論
本試驗(yàn)結(jié)果顯示，白屈菜紅堿對(duì)耐藥性禽大腸桿菌有明顯的抑制作用。
具體實(shí)施例5 白屈菜紅堿的臨床治療試驗(yàn)
2014年3月份，我市周邊某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的6000只蛋雞(7月齡)，突然發(fā)病，病初有的雞沒(méi)有明顯癥狀就突然死亡，第2天，每天死亡少則十幾只，多則幾十只，7天死亡了237只，死亡率約為4％。發(fā)病雞體溫升高，精神沉郁，采食量飲水量下降。病雞不愿走動(dòng)，遠(yuǎn)離雞群。明顯下痢，糞便呈黃白色、黃綠色稀糞，有的混有多量粘液或混有血液。產(chǎn)蛋率下降。通過(guò)觀察病雞臨床癥狀、剖檢，初步判斷為大腸桿菌感染。用氟哌酸拌料給藥未見明顯療效。后經(jīng)化驗(yàn)室取病料分離鑒定，確診病原菌為大腸桿菌，且根據(jù)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行該大腸桿菌的耐藥性試驗(yàn)，結(jié)果如下：
發(fā)現(xiàn)分離出的大腸桿菌對(duì)氟哌酸、慶大霉素、多西環(huán)素、鹽酸環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿莫西林、頭孢曲松鈉、鹽酸林可霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、克林霉素、紅霉素、克拉霉素、替米考星、阿奇霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。取本發(fā)明所制的顆粒劑給雞飲水服用，使用方法為混飲，100克兌水200-400公斤，供集中飲用。連用7天后病情得到有效控制，10天后雞群趨于正常，2周后不見有雞死亡。共治療5300只雞，成活4953只，有效率達(dá)93.5％。