伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法及其藥效活性成分的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法及其藥效活性成分，屬于藥物活性成分篩選【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法以下步驟：1)成分的提?。禾崛∫霖惸钢械母鞣N成分；2)多成分配合：將上述得到的各種成分進(jìn)行組合，得到至少一種組合物；3)油水分布系數(shù)的測定：分別測定上述各種成分和組合物中組分的油水分布系數(shù)；4)活性成分的追蹤：將上述得到的油水分布系數(shù)做為活性評價(jià)指標(biāo)，與標(biāo)準(zhǔn)油水分布系數(shù)進(jìn)行對比檢測。該方法既考慮了活性成分在體內(nèi)的吸收、分布情況，又考慮到了藥物活性成分之間相互作用的情況，是一種很好的藥效活性成分的追蹤檢測方法。
【專利說明】伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法及其藥效活性成分

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物活性成分篩選的方法，特別是涉及一種伊貝母藥效活性成分 的追蹤檢測方法及其藥效活性成分。

【背景技術(shù)】
[0002] 中藥是中醫(yī)學(xué)經(jīng)幾千年臨床實(shí)踐的產(chǎn)物，其療效毋庸置疑，但由于中藥成分的多 樣性和作用機(jī)制的復(fù)雜性，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研宄一直是科研工作者研宄的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0003] 迄今為止，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研宄主要是運(yùn)用植物化學(xué)逐步分離、藥理活性示蹤 的模式。這種研宄模式取得了一定的成果，但是，在研宄過程中也發(fā)現(xiàn)許多中藥或植物藥往 往是粗提物有效，但隨著逐步分離純化，有效部位的活性越來越弱，最后甚至得不到有活性 的單體成分。這給中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研宄造成了極大的困擾。這一現(xiàn)象說明中藥起效的 物質(zhì)基礎(chǔ)并不是單一成分對單個靶點(diǎn)的作用，而往往是多成分及其間相互作用后共同作用 于生物體的結(jié)果。因此，多成分及其間相互作用對于中藥藥效的發(fā)揮具有重要的影響，而通 過傳統(tǒng)的對中藥化學(xué)成分進(jìn)行逐一的單獨(dú)分離，再進(jìn)行藥效追蹤的方法有一定的局限性。
[0004] 伊貝母（BulbusfritillariaePallidiflorae)為百合科植物新疆貝母或伊犁貝 母的干燥鱗莖，主要分布于新疆伊犁河流域。由于伊犁貝母產(chǎn)量高，生物堿的含量在同類貝 母中相對較高，抗病力強(qiáng)和藥材價(jià)格低廉，特別是其祛痰和鎮(zhèn)咳等生理活性較川貝母略強(qiáng)， 近年來倍受人們的關(guān)注。
[0005] 而本發(fā)明人就在伊貝母的活性成分研宄過程中發(fā)現(xiàn)了類似情況，中藥伊貝母表現(xiàn) 了很強(qiáng)止咳療效，但是通過植化分離得到的主要單體物質(zhì)西貝素卻比伊貝母總提取物的活 性弱很多，說明傳統(tǒng)的對中藥化學(xué)成分進(jìn)行逐一的單獨(dú)分離，再進(jìn)行藥效追蹤活性成分的 方法并不適合伊貝母。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種伊貝母藥效活性成分 的追蹤檢測方法，該藥效追蹤檢測方法能夠很好的找到伊貝母中具有較強(qiáng)止咳效果的活性 成分。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：
[0008] 一種伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，包括以下步驟：
[0009] 1)成分的提?。禾崛∫霖惸钢械母鞣N成分，所述成分為單一物質(zhì)的單體和/或至 少兩種物質(zhì)組成的混合物；
[0010] 2)多成分配合：將上述得到的各種成分進(jìn)行組合，得到至少一種組合物；
[0011] 3)油水分布系數(shù)的測定：分別測定上述各種成分和組合物中組分的油水分布系 數(shù)；
[0012] 4)活性成分的追蹤：將上述得到的油水分布系數(shù)做為活性評價(jià)指標(biāo)，與標(biāo)準(zhǔn)油水 分布系數(shù)進(jìn)行對比檢測。符合預(yù)定油水分布系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的成分或組合物即為伊貝母藥效活性 成分。
[0013] 本發(fā)明的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，以油水分布系數(shù)做為活性評價(jià)指 標(biāo)，既考慮了活性成分在體內(nèi)的吸收、分布情況，又可將單一成分或多種成分總體做為考察 對象，還可針對不同成分之間的組合進(jìn)行考察，考慮到了藥物活性成分之間相互作用的情 況，是一種很好的藥效活性成分的追蹤檢測方法。
[0014] 在其中一個實(shí)施例中，所述油水分布系數(shù)的測定方法為：將各種成分或組合物加 入油相與水相的混合溶液中，使其溶解并在油相和水相之間分配穩(wěn)定后，測定該成分或組 合物中組分在油相中的濃度和在水相中的濃度，按照下式計(jì)算其油水分布系數(shù)：
[0015] 油水分布系數(shù)=lg(CQ/Cw)
[0016] 其中A為在油相中的濃度，Cw為在水相中的濃度。
[0017] 在其中一個實(shí)施例中，所述油相為水飽和的正辛醇，所述水相為正辛醇飽和的水。 以水飽和的正辛醇做為油相，由于正丁醇與生物膜整體的溶解度參數(shù)接近，因此能夠較好 的模擬生物體內(nèi)情況，獲得更加準(zhǔn)確的活性追蹤效果。
[0018] 在其中一個實(shí)施例中，所述標(biāo)準(zhǔn)油水分布系數(shù)為-1至2。當(dāng)油水分布系數(shù)在此范 圍內(nèi)，該成分或組合物具有較好的活性。
[0019] 在其中一個實(shí)施例中，所述各種成分為：西貝素、伊貝母總黃酮。
[0020] 在其中一個實(shí)施例中，所述西貝素濃度的檢測方法為：吸取油相或水相溶液，以高 效液相色譜法測定該溶液中的西貝素含量，所述高效液相色譜法的測定條件如下：
[0021] 固定相：C18反相硅膠柱；
[0022] 流動相：乙腈：0. 005-0. 02%三乙胺水溶液的體積比為55-65 : 35-45,流速為 0. 8-1. 2ml/min；
[0023]ELSD檢測器：漂移管溫度為65-75°C，氮?dú)饬魉贋?. 3-1. 7L?min-1。
[0024] 本發(fā)明還公開了一種采用上述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法得到的伊 貝母藥效活性成分，為西貝素和伊貝母總黃酮組合得到的組合物。
[0025] 本發(fā)明的伊貝母藥效活性成分，是采用上述的以油水分布系數(shù)做為評價(jià)指標(biāo)得到 的活性成分，二者配合，其止咳效果比單用西貝素和單用伊貝母總黃酮效果的直接疊加還 要好，具有協(xié)同的效果。
[0026] 在其中一個實(shí)施例中，所述伊貝母總黃酮通過以下方法制備得到：將伊貝母粉碎， 加入體積百分比為80-99%的乙醇，回流提取，過濾后得到濾液，回收濾液得到稠浸膏，往該 稠浸膏中加入蒸餾水懸浮稠浸膏，再用HC1調(diào)pH值至2-4,靜置8-12小時(shí)，用乙酸乙酯萃 取，萃取液回收溶劑后即得伊貝母總黃酮。
[0027] 在其中一個實(shí)施例中，所述西貝素和伊貝母總黃酮的重量份比為1:1-7。將西貝素 與伊貝母總黃酮以該重量份比相配合，具有較好的止咳效果。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0029] 本發(fā)明的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，分別測定伊貝母中的各種成分和 組合物的油水分布系數(shù)，以其油水分布系數(shù)做為活性評價(jià)指標(biāo)，對伊貝母中的活性成分進(jìn) 行追蹤。既考慮了活性成分在體內(nèi)的吸收、分布情況，又考慮到了藥物活性成分之間相互作 用的情況，是一種很好的藥效活性成分的追蹤檢測方法。特別是，該方法能夠?qū)⒁霖惸钢刑?取得到的多種成分，以及多成分之間的組合作為一個整體進(jìn)行檢測，顧及到藥物成分之間 可能發(fā)生的相互作用，可以更加準(zhǔn)確和全面的對藥效活性成分進(jìn)行追蹤檢測。該方法做為 一種全新的研宄思路，能夠在中藥藥效的研宄中發(fā)揮重要的作用。
[0030] 本發(fā)明的伊貝母藥效活性成分，是采用上述的以油水分布系數(shù)做為評價(jià)指標(biāo)得到 的活性成分，二者配合，其止咳效果比單用西貝素和單用伊貝母總黃酮效果的疊加還要好， 具有協(xié)同效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為西貝素與伊貝母總黃酮混合前后在Caco-2單層細(xì)胞模型中AP到BL方向 的吸收曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不對本發(fā)明造成任何限制。
[0033] 以下實(shí)施例中所用的的儀器和試劑如下：
[0034] Agilentl200高效液相色譜儀，含ELSD檢測器，美國Agilent公司。
[0035] YLS-8A誘咳引喘儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)設(shè)備站產(chǎn)品。
[0036] 對照品西貝素由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得（已采用UVJSjH及13CNMR等光譜方法確定 其結(jié)構(gòu)），其純度多99%。
[0037] 伊貝母總黃酮（其中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%)由本實(shí)驗(yàn)室自制。
[0038] 正辛醇、三乙胺和濃氨水（25% )均為分析純，購自廣州試劑廠。
[0039] 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18?22g，由廣東省醫(yī)學(xué)動物中心提供，合格證號 SCXK(粵）2008-00002。
[0040] 實(shí)施例
[0041] 一種伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，包括以下步驟：
[0042] 1)成分的提?。禾崛∫霖惸钢械母鞣N成分，得到西貝素和伊貝母總黃酮。
[0043] 1、西貝素的制備方法：將伊貝母粉碎，加入體積百分比為95%的乙醇，回流提取3 小時(shí)，提取3次，抽濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得到稠浸膏，往該稠浸膏中加入蒸餾水懸 浮稠浸膏，再用lmol/LNaOH調(diào)pH值至10,堿液用氯仿萃取3次，合并萃取液，真空干燥即 得伊貝母總生物堿，經(jīng)硅膠柱層析精制得到西貝素（采用UV、MS、iH及13CNMR等光譜方法 對該產(chǎn)物進(jìn)行了表征，確定其為西貝素）。
[0044] 2、伊貝母總黃酮的制備方法：將伊貝母粉碎，加入體積百分比為95%的乙醇，回 流提取3小時(shí)，提取3次，抽濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得到稠浸膏，往該稠浸膏中加入蒸 餾水懸浮稠浸膏，再用2mol/LHC1調(diào)pH值至3,靜置8-12小時(shí)（過夜），用乙酸乙酯多次 萃取，萃取液合并后真空濃縮，即得伊貝母總黃酮。
[0045] 2)多成分配合：將上述得到的西貝素和伊貝母總黃酮組合，得到組合物。
[0046] 3)油水分布系數(shù)的測定：分別測定上述單獨(dú)存在的西貝素及與伊貝母總黃酮混 合后西貝素的油水分布系數(shù)。
[0047] 1、試劑的配制。
[0048] 水溶液飽和的正辛醇及正辛醇飽和的水溶液：將正辛醇和水混合后，在振蕩器上 振蕩24h，使其相互飽和，靜置分層后，兩相分離，分別保存?zhèn)溆谩?br> [0049] 油水分布系數(shù)實(shí)驗(yàn)樣品配制：分別精密稱取西貝素、西貝素與伊貝母總黃酮的混 合物至于燒杯中，分別用正辛醇飽和水溶解，即得一定濃度的西貝素、西貝素與伊貝母總黃 酮混合物的水相溶液，分別精密移取上述2組水相溶液3mL置于10mL離心管中，精密加入 3mL水飽和的正辛醇，混合，用封口膜密封管口，將離心管置于恒溫水浴振蕩器中振蕩，溫度 為37°C，振蕩頻率為100r/min，平行操作3份。24h后取出離心管，4500r/min，離心lOmin， 使兩相分層，分別取油相（〇)和水相（W)，用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，0.45ym微孔濾膜濾過后 備用。
[0050] 2、油水分布系數(shù)的測定。
[0051] (1)色譜條件。
[0052]色譜柱：PhenomenexLunaC18 (250mmX4. 6mm, 5ym)。
[0053] 流動相：乙腈-0.01%三乙胺水溶液（60:40)，流速：1.0mL*min-1。
[0054]檢測器參數(shù)：漂移管溫度：70°C，氮?dú)饬魉伲?. 5L?min'
[0055] (2)標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取西貝素對照品儲備液0.1，0.2, 0. 4, 0. 8和1.OmL，用甲醇 稀釋并定容至5mL，制得濃度分別為20、40、80、160和200yg?ml/1的對照品溶液，分別進(jìn) 樣20yL(n= 3)，記錄峰面積，以西貝素峰面積對西貝素濃度回歸，得兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線： 回歸方程為Y= 8. 26X132X-30. 56,r= 0. 9996,其中X為西貝素的濃度，Y為西貝素的峰 面積，線性范圍為20-200yg?mL'
[0056] (3)測定：以上述色譜條件測定上述制得的油水分布系數(shù)實(shí)驗(yàn)樣品，并按照下式 計(jì)算其油水分布系數(shù)（lgPow):
[0057] 油水分布系數(shù)=lg(CQ/Cw)
[0058] 其中A為在油相中的濃度，Cw為在水相中的濃度。
[0059] 3、結(jié)果。
[0060] 測定結(jié)果如下表所示。
[0061] 表1油水分布系數(shù)測定結(jié)果
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 成分的提?。禾崛∫霖惸钢械母鞣N成分，所述成分為單一物質(zhì)的單體和/或至少兩 種物質(zhì)組成的混合物； 2) 多成分配合：將上述得到的各種成分進(jìn)行組合，得到至少一種組合物； 3) 油水分布系數(shù)的測定：分別測定上述各種成分和組合物中組分的油水分布系數(shù)； 4) 活性成分的追蹤：將上述得到的油水分布系數(shù)做為評價(jià)指標(biāo)，與標(biāo)準(zhǔn)油水分布系數(shù) 進(jìn)行對比檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，其特征在于，所述油 水分布系數(shù)的測定方法為：將各種成分或組合物加入油相與水相混合的混合溶液中，使其 溶解并在油相和水相之間分配穩(wěn)定后，測定該成分或組合物中組分在油相中的濃度和在水 相中的濃度，按照下式計(jì)算其油水分布系數(shù)： 油水分布系數(shù)=lg(Q/Cw) 其中A為在油相中的濃度，Cw為在水相中的濃度。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，其特征在于，所述油 相為水飽和的正辛醇，所述水相為正辛醇飽和的水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，其特征在于，所述標(biāo) 準(zhǔn)油水分布系數(shù)為-1至2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，其特征在于，所述各 種成分為：西貝素、伊貝母總黃酮。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法，其特征在于，所述西 貝素濃度的檢測方法為：吸取油相或水相溶液，以高效液相色譜法測定該溶液中的西貝素 含量，所述高效液相色譜法的測定條件如下： 固定相：C18反相硅膠柱； 流動相：乙腈：0.005-0. 02 %三乙胺水溶液的體積比為55-65 : 35-45,流速為 0. 8-1. 2ml/min ； ELSD檢測器：漂移管溫度為65-75°C，氮?dú)饬魉贋?. 3-1. 7L ? min-1。
7. 采用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的伊貝母藥效活性成分的追蹤檢測方法得到的伊貝 母藥效活性成分，其特征在于，該伊貝母藥效活性成分為西貝素和伊貝母總黃酮組合得到 的組合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的伊貝母藥效活性成分，其特征在于，所述伊貝母總黃酮通過 以下方法制備得到：將伊貝母粉碎，加入體積百分比為80-99%的乙醇，回流提取，過濾后 得到濾液，回收濾液得到稠浸膏，往該稠浸膏中加入蒸餾水懸浮稠浸膏，再用HC1調(diào)pH值至 2-4,靜置8-12小時(shí)，用乙酸乙酯萃取，萃取液回收溶劑后即得伊貝母總黃酮。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的伊貝母藥效活性成分，其特征在于，所述西貝素與 伊貝母總黃酮的重量份比為1:1-7。
【文檔編號】A61K31/4375GK104458964SQ201410790192
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】焦豪妍, 湯慶發(fā), 張現(xiàn)濤, 付曉春, 楊燕軍, 沈小鐘, 聶陽 申請人:廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院