用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法，用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒；包括非離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅱ、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑。本發(fā)明提供的試劑盒及使用該試劑盒的方法能夠在短時(shí)間內(nèi)能夠獲取多器官和組織的去細(xì)胞支架，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大部分結(jié)構(gòu)，從而再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究和運(yùn)用提供產(chǎn)品材料。
【專利說(shuō)明】用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒，具體涉及用于去除不同器官和組織抗原成分的試劑盒。本發(fā)明還設(shè)計(jì)使用所述試劑盒獲得多器官和組織支架的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近幾年去細(xì)胞組織工程發(fā)展迅速，目前多種組織來(lái)源的去細(xì)胞支架已成功運(yùn)用到在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，如皮膚，血管，神經(jīng)，小腸粘膜下層以及肝臟等。除了上述較成熟的去細(xì)胞組織外，許多動(dòng)物的全器官去細(xì)胞支架也已成功制備，比如心臟，肝臟，腎臟，肺臟，脊髓等，在組織器官移植需求緊張的現(xiàn)狀下，為異體移植打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。但是每種全器官或組織去細(xì)胞支架的制備方法復(fù)雜多樣，所用的試劑也較為雜亂，缺乏系統(tǒng)的整理。
[0003]程遠(yuǎn)等人公開了一種制備肝臟去細(xì)胞的試劑盒及其使用方法，盡管上述試劑盒依次利用溶栓液、灌注液1、I1、II1、IV依次對(duì)肝臟進(jìn)行灌注能夠制得去細(xì)胞肝臟支架，但是其試劑盒只能應(yīng)用于制備部分動(dòng)物的肝臟的去細(xì)胞支架，而且步驟比較繁瑣，并且由于方法和試劑的較為單一無(wú)法滿足其他器官和組織去細(xì)胞的要求，因此應(yīng)用范圍過(guò)于狹??；柴家科等人公開了無(wú)細(xì)胞毒性去細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備及應(yīng)用，在不利用洗滌劑的前提下提供了效果良好的去細(xì)胞方案，然而最終檢測(cè)可看出DNA殘留量很大，因此抗原性的增強(qiáng)勢(shì)必對(duì)其在體實(shí)用性產(chǎn)生巨大的影響。現(xiàn)有的去細(xì)胞方法以及去細(xì)胞試劑盒僅應(yīng)用于一種器官或組織，面向市場(chǎng)的范圍很狹小，商業(yè)價(jià)值較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提出了一種用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法。
[0005]用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒，包括非離子去垢劑1、離子去垢劑
1、離子去垢劑I1、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑。
[0006]所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚)，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ；
所述的離子去垢劑I采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ；
所述的離子去垢劑II采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ；
所述的等滲溶液的濃度為0.0lM的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；
所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；
所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；
所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液；
所述的組織疏松劑為由EDTA(乙二胺乙二酸)和胰酶溶于無(wú)菌等滲PBS配制，其中EDTA濃度為3.2%，胰酶濃度為4% ； 用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒的使用方法，
目標(biāo)對(duì)象為神經(jīng)組織，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑中I振蕩處理4?8h，然后置于高滲溶液中震蕩4?8h，核酸酶去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100?300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，振蕩速度的選擇與不同物種來(lái)源的組織有關(guān)，以振蕩速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷組織完整性為宜，例如人的脊髓去細(xì)胞振蕩速度為100rpm/min，振蕩時(shí)可以采取相似的速度。
[0007]目標(biāo)對(duì)象功能型復(fù)雜的全器官去細(xì)胞的流程，置于_80°C?-20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25_45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h，然后用PBS粉末配制的低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，核酸酶去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，上述有脈管系統(tǒng)的器官均灌注去細(xì)胞，肝臟以門靜脈灌注，腎臟以腎動(dòng)脈灌注，優(yōu)選的灌注速度為I?500ml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，灌注速度的選擇與不同物種來(lái)源的器官有關(guān)，以灌注速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷支架為宜，例如人腎臟的去細(xì)胞灌流速度為15ml/min，灌注時(shí)可以采用相似的速度。上述去垢劑第一次灌注時(shí)，會(huì)使器官?gòu)耐咙S色變成乳白色，去垢劑第二次灌注時(shí)，逐漸會(huì)使器官變成透明。
[0008]目標(biāo)對(duì)象為功能單一的全器官的去細(xì)胞的流程，置于_80°C?-20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25°C?45°C的等滲無(wú)菌PBS緩沖溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次,每次持續(xù)20分鐘,用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min,非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h,核酸酶去除劑處理30min?60min,等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架上述有脈管系統(tǒng)的器官均灌注去細(xì)胞，心臟以冠狀動(dòng)脈灌注，胰腺以膽管灌注，肺臟以肺動(dòng)脈灌注。優(yōu)選的灌注速度為I?500ml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，灌注速度的選擇與具體的動(dòng)物器官以及種類有關(guān)，以灌注速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷支架為宜，例如豬胰腺的去細(xì)胞灌流速度為6ml/min。經(jīng)去垢劑灌注后，器官會(huì)變透明。
[0009]目標(biāo)對(duì)象為結(jié)締組織，由于自身結(jié)構(gòu)致密的特點(diǎn)，處理時(shí)間、去垢劑濃度較上述其他組織有所增加，具體步驟如下:置于-80°C?-20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，該過(guò)程可以根據(jù)組織的致密程度適當(dāng)重復(fù)，沖洗完全后在離子去垢劑中振蕩處理4?48h，然后置于低滲溶液中震蕩4?48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4?48h，然后放入低滲溶液中震蕩4?48h，核酸酶去除劑處理60min?120min，無(wú)菌等滲PBS沖洗6?24h，即可制備得到上述組織去細(xì)胞支架。在無(wú)菌條件下取出目標(biāo)組織后，試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100?300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，振蕩速度的選擇與具體的動(dòng)物有關(guān)，以振蕩速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷組織完整性為宜。例如兔的軟骨制備的振蕩速度為150rpm/min,振蕩時(shí)可以采取相似的速度。
[0010]對(duì)于需要灌注法去細(xì)胞器官，離體前對(duì)器官灌注疏栓液；
本發(fā)明提供的試劑盒及使用該試劑盒的方法能夠在短時(shí)間內(nèi)能夠獲取多器官和組織的去細(xì)胞支架，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大部分結(jié)構(gòu)，從而再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究和運(yùn)用提供產(chǎn)品材料。更為重要的是本發(fā)明可有效便捷的獲取各個(gè)靶向器官和組織細(xì)胞外優(yōu)質(zhì)基質(zhì)蛋白和各類細(xì)胞因子，為相關(guān)疾病治療、美容整形以及健康保健方面等提供原料獲取方法。其中的非離子去垢劑(Triton X-100)能夠破壞脂質(zhì)與脂質(zhì)及脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用，有效地破壞細(xì)胞膜；離子去垢劑(SDS，DOC)能夠有效地破壞蛋白與蛋白之間的相互作用。凍融過(guò)程可以通過(guò)形成細(xì)胞內(nèi)冰晶破壞細(xì)胞膜從而有效地使細(xì)胞溶解，而低滲(高滲)溶液可以使細(xì)胞皺縮破壞細(xì)胞膜進(jìn)而溶解細(xì)胞，再結(jié)合能夠?qū)Ｒ恍缘厮庥锌乖缘暮怂岬暮怂崦?，最終可以獲得良好的去細(xì)胞支架。(上面有提到的幾類去細(xì)胞試劑都要講)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明中實(shí)施例1豬心臟去細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖2為本發(fā)明中實(shí)施例1豬心臟去細(xì)胞支架的HE圖片；
圖3為本發(fā)明中實(shí)施例1豬心臟去細(xì)胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖4為本發(fā)明中實(shí)施例1豬心臟去細(xì)胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖；
圖5為本發(fā)明中實(shí)施例1豬肝臟去細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖6為本發(fā)明中實(shí)施例1豬肝臟去細(xì)胞支架的HE圖片；
圖7為本發(fā)明中實(shí)施例1豬肝臟去細(xì)胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖8為本發(fā)明中實(shí)施例1豬肝臟去細(xì)胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖；
圖9為本發(fā)明中實(shí)施例1豬脊髓去細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖10為本發(fā)明中實(shí)施例1豬脊髓去細(xì)胞支架的HE圖片；
圖11為本發(fā)明中實(shí)施例1豬脊髓去細(xì)胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖12為本發(fā)明中實(shí)施例1豬脊髓去細(xì)胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖；
圖13為本發(fā)明中實(shí)施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)圖；
圖14為本發(fā)明中實(shí)施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架的HE圖片；
圖15為本發(fā)明中實(shí)施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架的SEM (掃描電鏡)；
圖16為本發(fā)明中實(shí)施例1牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架的DNA含量前后比較柱狀圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此，本發(fā)明可運(yùn)用任何不同物種來(lái)源的具有細(xì)胞成分的組織和器官結(jié)構(gòu)。
[0013]如圖1、圖2、圖3、圖4所示，豬心臟去細(xì)胞實(shí)施例1.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0014]離體將心臟經(jīng)升主動(dòng)脈用疏栓液沖出殘留血液，置于_80°C的低溫冰箱12?4h，12h后在25°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑6h，核酸酶去除劑處理30min，等滲溶液沖洗2h，灌注速度為lml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行；制備得到的豬心臟細(xì)胞細(xì)胞支架，心臟脫細(xì)胞支架外觀透明包膜完整保留了心臟的形態(tài)肉眼可見心臟內(nèi)脈管系統(tǒng)，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0015]豬心臟去細(xì)胞實(shí)施例2.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為3%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0016]離體將心臟經(jīng)升主動(dòng)脈用疏栓液沖出殘留血液，置于_40°C的低溫冰箱30h，30h后在30°C的等滲無(wú)菌PBS緩沖溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑40min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑15h，核酸酶去除劑處理45min，等滲溶液沖洗15h，灌注速度為200ml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行；制備得到的豬心臟細(xì)胞細(xì)胞支架，心臟脫細(xì)胞支架外觀透明包膜完整保留了心臟的形態(tài)肉眼可見心臟內(nèi)脈管系統(tǒng)，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0017]豬心臟去細(xì)胞實(shí)施例3.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0018]離體將心臟經(jīng)升主動(dòng)脈用疏栓液沖出殘留血液，置于_20°C的低溫冰箱48hl2?48h后在45°C的等滲無(wú)菌PBS緩沖溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑24h，核酸酶去除劑處理60min，等滲溶液沖洗24h，灌注速度為500ml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行；制備得到的豬心臟細(xì)胞細(xì)胞支架，心臟脫細(xì)胞支架外觀透明包膜完整保留了心臟的形態(tài)肉眼可見心臟內(nèi)脈管系統(tǒng)，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0019]如圖5、圖6、圖7、圖8所示，豬肝臟去細(xì)胞實(shí)施例1.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0020]置于-80°C的低溫冰箱12，12h后在25的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min，非離子去垢劑中灌注處理6h，然后在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min，核酸去除劑處理30min，等滲溶液沖洗2h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，灌注速度為lml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的豬肝臟細(xì)胞細(xì)胞支架，整體顏色透明，肉眼血管清晰可見，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0021]豬肝臟去細(xì)胞實(shí)施例2.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為5%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0022]置于-40°C的低溫冰箱20h，20h后在30°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑30min，非離子去垢劑中灌注處理15h，然后在低滲溶液中灌注組織疏松劑140min，核酸去除劑處理45min，等滲溶液沖洗15h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，優(yōu)選灌注速度為200/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的豬肝臟細(xì)胞細(xì)胞支架，整體顏色透明，肉眼血管清晰可見，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0023]豬肝臟去細(xì)胞實(shí)施例3.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的非離子去垢劑、低滲溶液、等滲溶液、組織疏松劑和核酸去除劑。
[0024]置于-20°C的低溫冰箱48h，48h后在45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑60min，非離子去垢劑中灌注處理24h，然后在低滲溶液中灌注組織疏松劑60min，核酸去除劑處理60min，等滲溶液沖洗24h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，灌注速度為500ml/min，所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的豬肝臟細(xì)胞細(xì)胞支架，整體顏色透明，肉眼血管清晰可見，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0025]如圖9、圖10、圖11、圖12所示，豬脊髓去細(xì)胞實(shí)施例1.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑1、高滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0026]置于-80°C的低溫冰箱lh，Ih后在25°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理4h，然后置于高滲溶液中震蕩4h，核酸去除劑處理30min，等滲溶液沖洗2h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的豬脊髓細(xì)胞細(xì)胞支架，整體顏色較原來(lái)組織透明，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0027]豬脊髓去細(xì)胞實(shí)施例2.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為6%的離子去垢劑1、高滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0028]置于-40°C的低溫冰箱1.5h，1.5h后在30°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次,每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理6h，然后置于高滲溶液中震蕩6h，核酸去除劑處理40min，等滲溶液沖洗15h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為200rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的豬脊髓細(xì)胞細(xì)胞支架，整體顏色較原來(lái)組織透明，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0029]豬脊髓去細(xì)胞實(shí)施例3.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的離子去垢劑1、高滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0030]置于_20°C的低溫冰箱2h，2h后在45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理8h，然后置于高滲溶液中震蕩8h，核酸去除劑處理60min，等滲溶液沖洗24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的豬脊髓細(xì)胞細(xì)胞支架，整體顏色較原來(lái)組織透明，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0031]如圖13、圖14、圖15、圖16所示，牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞實(shí)施例1.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的非離子去垢劑、溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑I1、低滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0032]置于-80°C的低溫冰箱lh，Ih后在25°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在非離子去垢劑中振蕩處理4h，然后置于低滲溶液中震蕩4h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4h，然后放入低滲溶液中震蕩4h，核酸酶去除劑處理60minmin，無(wú)菌溶液沖洗6h，即可制備得到上述組織去細(xì)胞支架。振蕩速度為lOOrpm/min，制備得到的牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架，整體顏色較原來(lái)組織透明，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0033]牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞實(shí)施例2.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為3%的非離子去垢劑、溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑I1、低滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0034]置于-60°C的低溫冰箱1.5h，1.5h后在30°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在非離子去垢劑中振蕩處理25h，然后置于低滲溶液中震蕩30h，在離子去垢劑II中再振蕩處理20h，然后放入低滲溶液中震蕩20h，核酸酶去除劑處理90min，無(wú)菌等滲PBS沖洗15h，即可制備得到上述組織去細(xì)胞支架，振蕩速度為200rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架，整體顏色較原來(lái)組織透明，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
[0035]牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞實(shí)施例3.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為10%的非離子去垢劑、溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1%的離子去垢劑I1、低滲溶液、等滲溶液和核酸去除劑。
[0036]置于_20°C的低溫冰箱2h，2h后在45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在非離子去垢劑中振蕩處理48h，然后置于低滲溶液中震蕩48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理48h，然后放入低滲溶液中震蕩48h，核酸酶去除劑處理120min，無(wú)菌等滲PBS沖洗24h，即可制備得到上述組織去細(xì)胞支架。振蕩速度為300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，制備得到的牛關(guān)節(jié)軟骨去細(xì)胞支架，整體顏色較原來(lái)組織透明，HE染色放大100倍無(wú)細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞核成分殘留，掃描電鏡檢測(cè)膠原纖維排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留，在DNA定量檢測(cè)中幾乎不含有DNA成分。
【權(quán)利要求】
1.用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒；其特征在于:包括非離子去垢劑、離子去垢劑1、離子去垢劑I1、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑； 所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX-ΙΟΟ，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ； 所述的離子去垢劑I采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ； 所述的離子去垢劑II采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%?10% ； 所述的等滲溶液的濃度為0.0lM的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌； 所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌； 所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌； 所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液； 所述的組織疏松劑為由EDTA和胰酶溶于無(wú)菌等滲PBS配制，以下為濃度為體積比，其中EDTA濃度為3.2%，胰酶濃度為4%。
2.用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒的使用方法，其特征在于: 目標(biāo)對(duì)象為神經(jīng)組織，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑中I振蕩處理4?8h，然后置于高滲溶液中震蕩4?8h，核酸酶去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架；所述振蕩速度為100?300rpm/min，各步驟均連續(xù)進(jìn)行； 目標(biāo)對(duì)象功能型復(fù)雜的全器官去細(xì)胞的流程，置于_80°C?-20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25-45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h,然后用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min,核酸去除劑處理30min?60min，等滲溶液沖洗2?24h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，所述灌注速度為I?500ml/min,各步驟均連續(xù)進(jìn)行，； 目標(biāo)對(duì)象為功能單一的全器官的去細(xì)胞的流程，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱12?48h，12?48h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min?60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6?24h,核酸去除劑處理30min?60min,等滲溶液沖洗2?24h,即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，所述灌注速度為I?500ml/min，各步驟均連續(xù)進(jìn)行； 目標(biāo)對(duì)象為結(jié)締組織，置于_80°C?_20°C的低溫冰箱I?2h，I?2h后在25°C?45°C的等滲溶液中解凍，用生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在離子去垢劑中振蕩處理4?48h，然后置于低滲溶液中震蕩4?48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4?48h，然后放入低滲溶液中震蕩4?48h，核酸去除劑處理60min?120min，無(wú)菌等滲PBS沖洗6?24h，即可制備得到上述組織去細(xì)胞支架；所述振蕩速度為100?300rpm/min，各步驟均連續(xù)進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK104288838SQ201410566192
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】倪金虎, 林賢豐, 張琪, 何佳怡, 陳蘊(yùn)繽, 陳家鑫 申請(qǐng)人:林賢豐