預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑及制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】的新型抗病毒生物制劑，具體是涉及一種預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑及制備方法。本發(fā)明為球蛋白類(lèi)病毒進(jìn)入/融合抑制劑。其作用在病毒入侵靶細(xì)胞的第一階段，阻斷了病毒對(duì)細(xì)胞的感染，從而達(dá)到預(yù)防和控制病毒的效果。使用一種活性酸酐來(lái)修飾一種分離和純化的蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸，從而使其具有阻斷人呼吸道合胞病毒RSV進(jìn)入和感染靶細(xì)胞的功能。
【專(zhuān)利說(shuō)明】預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】的新型抗病毒生物制劑，具體是涉及一種預(yù)防和控 制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑及制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道合胞病毒Respiratory Syncytial Virus (RSV)是一種含包膜的非節(jié)段負(fù) 鏈RNA病毒，于1956年被發(fā)現(xiàn)。其屬于副粘病毒科，肺病毒屬。RSV的基因組長(zhǎng)15kb，共表 達(dá)11種蛋白，包括3個(gè)跨膜蛋白，F(xiàn)、G和SH，2個(gè)非糖基化的基質(zhì)蛋白M和M2，3個(gè)衣殼蛋白 N、P、L及2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS2。其中G蛋白和F蛋白參與了呼吸道合胞病毒（RSV) 的進(jìn)入和膜融合過(guò)程。并且，G蛋白和F蛋白也是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的主要表位。G蛋白具有高 度變異性，而且被高度糖基化，這是RSV容易逃避宿主免疫攻擊的一個(gè)重要原因。RSV分為 A、B兩個(gè)亞型，同一亞型的RSV G蛋白基因核苷酸及氨基酸序列同源性可達(dá)90%以上。A、B 兩型交替流行，部分年份以A型流行為主，部分年份以B型流行為主，有些年份呈共流行。
[0003] RSV廣泛流行于世界各地，是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見(jiàn)的病原微生物之一。 幾乎所有的3歲兒童都經(jīng)歷過(guò)1次或多次RSV感染。RSV感染可以引起鼻炎、中耳炎、支氣 管炎和肺炎。RSV要感染新生兒以及3歲以下的兒童，以及對(duì)免疫力較弱的老年人也能夠感 染。根據(jù)世界衛(wèi)生組(WHO)官方數(shù)據(jù)，目前每年全世界范圍有大約160000人由于感染RSV 而死亡。有1. 4到6. 2萬(wàn)65歲以上的老人需要住院治療。RSV感染的顯著特征是前次感染 在人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體不能提供永久保護(hù)。在人的整個(gè)生命過(guò)程可被RSV重復(fù)感染。RSV還 是引起流行性喘憋性肺炎(簡(jiǎn)稱(chēng)流喘肺炎)的主要病原。每隔數(shù)年就會(huì)爆發(fā)流行一次喘憋性 肺炎，造成數(shù)十萬(wàn)人發(fā)病，數(shù)萬(wàn)人住院，并造成死亡。在氣候溫和地區(qū)，其爆發(fā)流行主要集中 在雨季。在我國(guó)，RSV感染具有顯著的特征。在南方，RSV流行高峰主要在炎熱的夏季，而北 方主要發(fā)生在寒冷的冬季。RSV感染在我國(guó)不但有散發(fā)流行，而且還曾引起數(shù)次大規(guī)模流 行。
[0004] 由于RSV感染人體后激發(fā)的集體免是不完全免疫、RSV A型和B兩亞型間的抗原 相關(guān)性只有25%，另外加之福爾馬林滅活疫苗免疫后能引起RSV疫苗誘導(dǎo)增強(qiáng)性疾病等原 因，目前并沒(méi)有有效的疫苗來(lái)預(yù)防RSV感染。FDA批準(zhǔn)治療RSV的藥物有病毒唑和帕利株單 抗。病毒唑在治療RSV上仍然存在很多爭(zhēng)議。例如其治療效果以及副作用的問(wèn)題。而帕利 株主要用在重病感染的嬰兒，如先天免疫缺陷等。所以目前也沒(méi)有一種有效的藥物來(lái)預(yù)防 RSV感染。鑒于此，目前研發(fā)一種有效、安全的藥物對(duì)預(yù)防RSV感染有很重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑及制 備方法。
[0006] 本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，包括活性酸酐和分離純化的蛋 白，所述每IOg蛋白用0. 02?0. 03mol的活性酸酐進(jìn)行修飾，所述蛋白至少包括賴(lài)氨酸和 /或精氨酸。
[0007] 所述分離純化的蛋白優(yōu)選為人血清白蛋白。
[0008] 所述人血清白蛋白可用β-乳球蛋白、雞血清蛋白0VA、兔血清蛋白R(shí)SA、豬血清白 蛋白PSA、冷水魚(yú)皮明膠G-FS、豬皮明膠G-PS代替。
[0009] 所述活性酸酐優(yōu)選為馬來(lái)酸酐（maleic anhydride,縮寫(xiě)為ML)。
[0010] 所述馬來(lái)酸酐可以用馬來(lái)酸酐衍生物、3-羥基-鄰苯二甲酸酐 (3-hydroxyphthalicanhydride，縮寫(xiě)為HP)及3-輕基-鄰苯二甲酸酐的衍生物、琥拍酸酐 (Succinic anhydride，縮寫(xiě)為 SU)代替。
[0011] 上述生物制劑的制備方法，包括如下步驟： (1) 、將活性酸酐溶于溶劑中得到飽和的酸酐溶液； (2) 、將分離純化的蛋白溶于pH8?9的0. I M磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為20mg/ mL的蛋白溶液； (3) 、將酸酐溶液分多次加入蛋白溶液中，每次加完后充分混勻，且調(diào)節(jié)pH至8?9。酸 酐在反應(yīng)體系中的終濃度為40?60mM ; (4) 、在溫度為20?30°C的條件下，靜置1-3小時(shí)，然后用pH 7?8的PBS溶液透析后 過(guò)濾除菌，即可制得成品。
[0012] 本發(fā)明為多肽蛋白類(lèi)病毒進(jìn)入/融合抑制劑，作用于病毒入侵靶細(xì)胞的第一階 段，阻斷了病毒對(duì)細(xì)胞的感染，從而達(dá)到預(yù)防和控制病毒的效果。使用一種活性酸酐來(lái)修 飾一種分離和純化的蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸，從而使其具有阻斷人呼吸道合胞病毒 RSV進(jìn)入和感染靶細(xì)胞的功能。
[0013] 酸酐修飾蛋白濃度測(cè)定。合成的酸酐修飾蛋白濃度按照BCA蛋白濃度分析試劑盒 的操作步驟測(cè)定，具體方法如下： 1、稀釋BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使終濃度為0, 25,125, 250, 500, 750,1000, 2000 μ g/mL，標(biāo)準(zhǔn) 品的稀釋與待測(cè)蛋白樣品溶液相同。
[0014] 2、分別將25 μ 1各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和25 μ 1待測(cè)樣品加入96孔圓底細(xì)胞板中，復(fù)孔對(duì) 照。
[0015] 3、制備反應(yīng)工作液，將ReagentA與ReagentB按50 :1比例混勻； 4、每孔200 μ 1反應(yīng)工作液，輕柔震蕩30s，混勻。
[0016] 5、37 °C孵育30 min，冷卻至室溫，680型酶標(biāo)儀測(cè)定0D562 nm吸光度。
[0017] 6、繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品濃度。
[0018] TNBS法及P-HPG法測(cè)定蛋白的酸酐修飾比率，及檢測(cè)正電荷氨基酸--賴(lài)氨酸和精 氨酸殘基的修飾率。
[0019] 采用2,4,6 -三硝基苯磺酸（TNBS)檢測(cè)修飾后蛋白中的賴(lài)氨酸殘基被相應(yīng)酸酐 修飾的比率。具體方法如下： 1、系列稀釋的待測(cè)酸配修飾蛋白樣品與陰性對(duì)照未修飾的蛋白各25 μ 1加入96孔圓 底細(xì)胞培養(yǎng)板中，空白對(duì)照孔加入25 μ 1/孔0. I M磷酸鈉溶液。
[0020] 2、25 μ 1/孔的0. I M四硼酸鈉 Na2B4O7與各待測(cè)樣品室溫混勻5min ;各孔加入10 μ 1的，TNBS，室溫混勻，5 min。
[0021] 3、加入 100 μ 1/孔的終止液（0. IM NaH2POJP I. 5mM Na2SO3),終止反應(yīng)，測(cè) 0D420 rim值，根據(jù)其與陰性對(duì)照蛋白OD值差異，計(jì)算賴(lài)氨酸的修飾率。
[0022] 4、賴(lài)氨酸修飾率 ％= [I- (0D420nm 樣品-0D450nm 空白）A0D420nm 陰性-0D450nm 空白）]Χ?οο。
[0023] 如圖1所示，表示不同酸酐以及不同濃度對(duì)HSA修飾的賴(lài)氨酸修飾率。利用終濃 度為2. 5、5、10、20、40和60 mM的3-羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)、馬來(lái)酸酐（ML)和琥珀酸酐 (SU)對(duì)人血清白蛋白進(jìn)行修飾。利用2,4,6 -三硝基苯磺酸（TNBS)跟修飾樣品反應(yīng)，利用 酶標(biāo)儀測(cè)量A420,計(jì)算賴(lài)氨酸修飾率。隨著酸酐濃度的升高，賴(lài)氨酸的修飾率也逐漸升高。 酸酐終濃度達(dá)到40 mM后，賴(lài)氨酸修飾率也逐漸達(dá)到平臺(tái)。
[0024] 采用p-HPG檢測(cè)合成的修飾蛋白末端的精氨酸殘基被相應(yīng)酸酐修飾的比率。具體 方法如下： 1、系列稀釋的待測(cè)酸配修飾蛋白樣品與陰性對(duì)照未修飾的蛋白各90 μ 1加入96孔圓 底細(xì)胞培養(yǎng)板中，空白對(duì)照孔加入90 μ L/孔0. IM磷酸鈉溶液，調(diào)節(jié)各孔溶液pH為9.0。
[0025] 2、10 μ L/ 孔 50 mM p-HPG，pH 9. 0,與各樣品室溫避光反應(yīng) 90 min。
[0026] 3、測(cè)0D340nm值，計(jì)算精氨酸的修飾率。
[0027] 4、精氨酸修飾率 ％=[l-(0D340nm 樣品-0D340nm 空白 V(0D340nm 陰性-0D340nm 空白）]Χ?οο。
[0028] 如圖2所示，表示不同酸酐以及不同濃度對(duì)HSA修飾精氨酸的酸修飾率。利用終 濃度為2. 5、5、10、20、40和60 mM的3-羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)、馬來(lái)酸酐（ML)和琥珀酸 酐（SU)對(duì)人血清白蛋白進(jìn)行修飾。利用p-HPG跟修飾樣品反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測(cè)量A340,計(jì) 算精氨酸修飾率。隨著酸酐濃度的升高，賴(lài)氨酸的修飾率也逐漸升高。酸酐終濃度達(dá)到40 mM后，精氨酸修飾率也逐漸達(dá)到平臺(tái)。
[0029] 培養(yǎng)RSV Long株和A2株病毒的培養(yǎng)。目前RSV Long株和A2株的擴(kuò)增主要在 HEp-2細(xì)胞系中進(jìn)行。具體的方法如下： 1、利用T75培養(yǎng)瓶接種HEp-2細(xì)胞，等細(xì)胞密度長(zhǎng)到70%-80%左右，去掉培養(yǎng)基。按照 MOI為0. 02的量加入病毒。
[0030] 2、補(bǔ)充 DMEM 培養(yǎng)基，10% FBS (Gibco)。在 37°C，5% CO2 溫育 30 分鐘。
[0031] 3、補(bǔ)加 DMEM 培養(yǎng)基，10% FBS (Gibco)到 15 ml。在 37°C，5% CO2 培養(yǎng) 5 天。
[0032] 4、擴(kuò)增病毒5天后，培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)90%的CPE，將T75的培養(yǎng)瓶猛烈震蕩15秒。
[0033] 5、將細(xì)胞渾濁液收集在50ml離心管，5000RPM離心10分鐘取上清，分裝后 于-80°C保存。
[0034] 6、進(jìn)行病毒低度的測(cè)定： i、鋪500 μ? HEp-2細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為0.8 X IO5個(gè)，37°C，5% CO2培 養(yǎng)24小時(shí)。
[0035] ii、將擴(kuò)增的RSV病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)サ艏?xì)胞培養(yǎng)基，然后每孔加入20〇μ1 系列稀釋的病毒液。
[0036] iii、將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 °C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，每15分鐘搖一次細(xì) 胞板。
[0037] iv、3小時(shí)后,將24孔板的病毒液吸走。然后按照每孔500 μ?加入含有0. 5%瓊脂 糖的DMEM，2% FBS，鋪板。置于室溫20分鐘后讓瓊脂糖凝固。
[0038] V、放在 37 °C，5% CO2 培養(yǎng) 5 天。
[0039] vi、5天后，每孔加入4%的多聚甲醛500 μ?固定細(xì)胞5小時(shí)。
[0040] vii、然后去掉瓊脂糖，用PBS洗一遍，加入2%的BSA封閉1小時(shí)。
[0041] viii、按照I :500稀釋?zhuān)靠准尤?00 μ? -抗（anti-RSV)，然后放在4°C過(guò)夜。
[0042] ix、倒掉一抗，然后用0. 05%吐溫PBS溶液洗3遍。按照I :500稀釋加入HPR標(biāo) 記的二抗(兔抗鼠)。室溫孵育1個(gè)小時(shí)。
[0043] X、用0. 05%吐溫PBS溶液洗3遍，利用4-CN顯色；數(shù)斑計(jì)算病毒低度。
[0044] 本發(fā)明制備的產(chǎn)品對(duì)RSV Long株和A2株抑制活性的檢測(cè)。利用以上擴(kuò)增的RSV 感染HEp-2,檢測(cè)ML-HSA對(duì)RSV Long株和A2的抑制活性，具體方法為： 1、鋪10〇μ1 HEp-2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為4X103個(gè)，37°C，5% CO2培養(yǎng) 24小時(shí)。
[0045] 2、MOI 0· 02的RSV Long株和A2病毒（50 μ?)分別與不同稀釋度的ML-HSA (50 μ?)進(jìn)行孵育，37°C，30min ;將孵育后的混合物加入預(yù)鋪的HEp-2細(xì)胞中，37°C，5% CO2培養(yǎng)， 培養(yǎng)5天。
[0046] 3、5天后用同仁化學(xué)的cck8試劑盒檢測(cè)，利用Compusyn L 0和SigmaPlot軟件進(jìn) 行計(jì)算抑制病毒的IC50。
[0047] 如圖3所示，不同酸酐以及不同濃度修飾后的HSA抗RSV Long株的活性。將不同 濃度的利用2. 5、5、10、20、40和60mM的3-羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)、馬來(lái)酸酐（ML)和琥 珀酸酐（SU)修飾的人血清白蛋白（圖中分別標(biāo)記為HP-HSA、ML-HSA和SU-HSA)加入HEp-2 細(xì)胞中，然后加入TCID90的RSV Long株，5天后測(cè)細(xì)胞活性計(jì)算各種修飾蛋白的抗病毒活 性(半抑制濃度IC50)。隨著對(duì)人血清白蛋白賴(lài)氨酸和精氨酸修飾率的提高，其抗RSV Long 株的活性也逐漸增強(qiáng)。
[0048] 如圖4所示，不同酸酐以及不同濃度修飾后的HSA抗RSV A2株的活性。將不同濃 度的利用2. 5、5、10、20、40和60 mM的3-羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)、馬來(lái)酸酐（ML)和琥珀 酸酐（SU)修飾的人血清白蛋白（圖中分別標(biāo)記為HP-HSA、ML-HSA和SU-HSA)加入都HEp-2 細(xì)胞中，然后加入TCID90的RSV A2株，5天后測(cè)細(xì)胞活性計(jì)算各種修飾蛋白的抗病毒活性 (半抑制濃度，IC50)。隨著對(duì)人血清白蛋白賴(lài)氨酸和精氨酸修飾率的提高，其抗RSV A2株 的活性也逐漸增強(qiáng)。
[0049] 利用馬來(lái)酸酐（ML)、琥珀酸酐（SU)及3-羥基-鄰苯二甲酸酐（HP)分別修飾的 β -乳球蛋白β-Lactoglobulin、牛血清蛋白BSA、雞血清蛋白OVA和人血清白蛋白HSA。并 檢測(cè)其對(duì)RSV A2株和Long株抑制活性效果。如表1所示，表1表示酸酐化蛋白抗RSV活 性的檢測(cè)。β-乳球蛋白β-Lactoglobulin、牛血清蛋白BSA、雞血清蛋白OVA和人血清白 蛋白HSA經(jīng)過(guò)MUSU和HP三種酸酐分別修飾后，均獲得了很好的抗RSV Α2株和Long株的 活性。
[0050] 表1酸酐化蛋白抗RSV活性的檢測(cè)

【權(quán)利要求】
1. 一種預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，其特征在于：包括活性酸酐和 分離純化的蛋白，所述每l〇g蛋白用0. 02?0. 03mol的活性酸酐進(jìn)行修飾，所述蛋白至少 包括賴(lài)氨酸和/或精氨酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，其特征在 于：所述活性酸酐為馬來(lái)酸酐或者馬來(lái)酸酐的衍生物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，其特征在 于：所述活性酸酐為3-羥基-鄰苯二甲酸酐或者3-羥基-鄰苯二甲酸酐的衍生物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，其特征在 于：所述活性酸酐為琥珀酸酐。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，其特 征在于：所述分離純化的蛋白為人血清白蛋白、￠-乳球蛋白、雞血清蛋白、兔血清蛋白、豬 血清白蛋白、冷水魚(yú)皮明膠或者豬皮明膠。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑，其特征在 于：生物制劑為凝膠制劑、膏劑或者噴劑。
7. -種預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑的制備方法，其特征在于：包括 如下步驟： (1) 、將活性酸酐溶于溶劑中得到飽和的酸酐溶液； (2) 、將分離純化的蛋白溶于pH 8?9的0.1 M磷酸鈉溶液中，得到蛋白終濃度為 20mg/mL的蛋白溶液； (3) 、將酸酐溶液分多次加入蛋白溶液中，每次加完后充分混勻，且調(diào)節(jié)pH至8?9,酸 酐在反應(yīng)體系中的終濃度為40?60mM ; (4) 、在溫度為20?30°C的條件下，靜置，pH 7?8的PBS溶液透析后過(guò)濾除菌，即可 制得成品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑的制備方法， 其特征在于：所述活性酸酐為馬來(lái)酸酐、馬來(lái)酸酐的衍生物、3-羥基-鄰苯二甲酸酐、3-羥 基-鄰苯二甲酸酐的衍生物或者琥珀酸酐；所述分離純化的蛋白為人血清白蛋白、0 -乳球 蛋白、雞血清蛋白、兔血清蛋白、豬血清白蛋白、冷水魚(yú)皮明膠或者豬皮明膠。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑的制備 方法，其特征在于：步驟（2)中，磷酸鈉溶液的pH為8. 5 ;步驟（3)中，每次加完后調(diào)節(jié)pH至 8. 5,酸酐在反應(yīng)體系中的終濃度為60mM ;步驟（4)中，在溫度為25°C的條件下，放置1小 時(shí)，pH 7. 4的PBS溶液在4°C透析后過(guò)夜，再用0. 45 y M微孔濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存，即可 制得成品。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的預(yù)防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制劑的制備方 法，其特征在于：步驟（1)中，所述溶劑為二甲基亞砜。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104353063SQ201410561005
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】姜世勃, 陸路, 孫志武, 王茜, 楊霞 申請(qǐng)人:太原錦波生物醫(yī)藥科技有限公司, 復(fù)旦大學(xué)