一種肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，該結(jié)合疫苗為多價(jià)肺炎球菌多糖與兩種或兩種以上的載體蛋白經(jīng)連接體而成的結(jié)合疫苗，其中，連接體為磁性納米微球。該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法將多價(jià)肺炎球菌多糖與兩種或以上的載體蛋白分別與納米微球經(jīng)偶聯(lián)而成。本發(fā)明提供的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗制備工藝簡(jiǎn)單，采用納米微球?yàn)檫B接物的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗能夠增強(qiáng)小鼠Thl型免疫應(yīng)答，以及多糖特異性抗體的免疫持效性、特異性和親和性，此外還可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生輪狀病毒抗體；具備兩種疫苗的預(yù)防效果；因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗，具體說，是涉及一種肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗疫苗及其制備方法， 屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] -、微生物對(duì)人體的危害及應(yīng)對(duì)措施
[0003] 微生物通常是指那些個(gè)體體積直徑一般小于1mm的生物群體，它們結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大 多是單細(xì)胞，還有些甚至連細(xì)胞結(jié)構(gòu)也沒有，我們身邊無時(shí)無刻不存在著微生物，通常會(huì)借 助顯微鏡或者電子顯微鏡才能看清它們的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；其中，致病微生物是指能夠引起人 類、動(dòng)物和植物的病害，具有致病性的微生物。一種病原體的致病性有賴于它的侵襲宿主并 在體內(nèi)繁殖和抵御宿主抵抗力而不被其消滅的能力。微生物致病性有種屬特征，致病能力 強(qiáng)弱的程度稱為毒力。感染性疾病的成立并非由微生物的毒力單方面決定，還要視宿主的 健康情況與免疫功能狀態(tài)。一般而言，毒力強(qiáng)的微生物感染未曾免疫過的機(jī)體，能引起病理 損害出現(xiàn)顯性感染等，而正常機(jī)體卻能抵抗許多低毒微生物（如條件致病菌）的損害，但當(dāng) 宿主抵抗力降低時(shí)則可對(duì)這些微生物易感而致病。病原體的毒力與宿主抵抗力兩者之間的 較量，引出感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，由于病原體和宿主之間適應(yīng)程度不同，雙 方抗衡的結(jié)局各異，產(chǎn)生各種不同的感染譜，即感染過程的不同表現(xiàn)。致病性是對(duì)特定宿主 而言，有的只對(duì)人類有致病性，有的只對(duì)某些動(dòng)物，而有的則屬人畜共患性微生物。而此時(shí) 宿主通常只能通過自身的免疫系統(tǒng)來對(duì)抗微生物的感染，死亡率非常高，致使各研究學(xué)者 研究出了疫苗來對(duì)抗致病性微生物對(duì)人體的侵害。
[0004] 而疫苗又分為治療性和預(yù)防性兩種，通過治療性疫苗治療疾病，并通過預(yù)防性疫 苗保護(hù)人體不受致病性微生物的侵害。通過接種預(yù)防性疫苗來預(yù)防疾病是人類在一個(gè)多世 紀(jì)的臨床實(shí)踐中，證明是行之有效的手段。經(jīng)過多年的努力，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)開發(fā)出各種不同的 疫苗用以預(yù)防，諸如細(xì)菌、病毒和真菌等，感染造成的各種疾病，極大地提高了人類的健康 水平。生物技術(shù)的不斷發(fā)展，促進(jìn)了疫苗品種的多樣化。今天，用以預(yù)防病毒導(dǎo)致的傳染病 有滅活病毒技術(shù)開發(fā)出來的疫苗，如乙腦疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等；用減毒病毒 技術(shù)開發(fā)出來的減毒活疫苗，如輪狀病毒疫苗、口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、 腮腺炎病毒疫苗、風(fēng)疹病毒疫苗和水痘疫苗等。預(yù)防細(xì)菌性傳染病的有用蛋白和多糖等生 物大分子純化技術(shù)開發(fā)出來的細(xì)菌類疫苗，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素及 其亞細(xì)胞組分、流行性腦膜炎球菌多糖和23價(jià)肺炎球菌多糖等。用基因重組蛋白技術(shù)開發(fā) 出來的疫苗，如乙肝表面抗原（預(yù)防乙型肝炎）、人類乳頭狀類病毒顆粒病毒（預(yù)防子宮頸 癌）等。用半化學(xué)結(jié)合技術(shù)開發(fā)出來的預(yù)防腦膜炎和肺炎的細(xì)菌疫苗，如流行性嗜血桿菌 b型多糖-蛋白結(jié)合疫苗、7價(jià)或10價(jià)肺炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗以及4價(jià)腦膜炎球菌 多糖-蛋白結(jié)合疫苗。由此可見，醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，是疫苗產(chǎn)品不斷發(fā)展的原動(dòng)力，通 過對(duì)生物技術(shù)的不斷改進(jìn)，能夠開發(fā)出更多的新型疫苗產(chǎn)品來應(yīng)付不同的傳染病對(duì)人類健 康的挑戰(zhàn)。
[0005] 二、結(jié)合疫苗概述
[0006] 多糖是病原菌中的一種重要免疫有效成分，有菌體多糖（0PS)和莢膜多糖（CPS) 之分。當(dāng)病原體侵入機(jī)體后，它們作為免疫原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。但是，多 糖分子屬于T細(xì)胞不依賴性抗原（Ti-Ag)，免疫原性較弱，接種嬰幼兒后免疫效果尤其不 理想，而目前許多危害嚴(yán)重的疾病如流感嗜血桿菌（Hib)引起的腦膜炎、E.Coli 0 157:H7 引起的小兒出血性腹瀉脫水等在嬰幼兒中高發(fā)且臨床無有效的治療辦法，病死率高（王燕 等，結(jié)合疫苗概述[J]，微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2000, 28(1) :60-63)。為了提高多糖疫苗的 免疫原性，國(guó)外于本世紀(jì)20年代初興起了多糖和蛋白的化學(xué)結(jié)合疫苗，即綴合疫苗，結(jié)合 (以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類）疫苗采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上制備成多 糖-蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫 苗、腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等，短短幾十年其發(fā)展相當(dāng)迅速，已取得顯著 成果。
[0007] 三、肺炎球菌的危害及其流行病學(xué)研究
[0008] 由肺炎球菌（肺鏈）所引起的感染是全世界發(fā)病率和死亡率的主要起因。肺炎、 發(fā)熱性菌血癥和腦膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常見表現(xiàn)形式，而呼吸道內(nèi)的細(xì)菌擴(kuò) 散可導(dǎo)致中耳感染、竇炎或復(fù)發(fā)性支氣管炎。與侵入性疾病相比，非侵入性的表現(xiàn)形式通常 不那么嚴(yán)重，但更多見。由于抗生素耐藥性傳染病的擴(kuò)散，以及肺炎球菌肺炎經(jīng)常在流感感 染之后出現(xiàn)，肺炎球菌疾病在流感期間發(fā)作的可能性進(jìn)一步增加。
[0009] 由肺炎鏈球菌引發(fā)的疾病已成為全球一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。肺炎球菌已成為 全球兒童的頭號(hào)殺手。我國(guó)肺炎的病死率為16. 4%，其中50歲以上中老年人及1歲以下 嬰幼兒分別高達(dá)28. 6 %和22. 0%。我國(guó)肺炎球菌在健康兒童中的攜帶率較高，資料統(tǒng)計(jì)顯 示，在北方地區(qū)健康兒童中的攜帶率為24. 2%，南方地區(qū)為31. 3%。而所述病是導(dǎo)致5歲以 下兒童死亡的重要原因。主要原因在于嬰幼兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育尚不完善，免疫力較弱。并 且年齡越小的嬰兒，免疫力越弱。肺炎球菌大約有90種血清型（菌株），我國(guó)的統(tǒng)計(jì)資料 顯示肺炎球菌感染菌株前幾個(gè)血清型依次為：5、6、19、23、14、2、4型。據(jù)一項(xiàng)收集了 860株 肺炎球菌分離株的研究顯示，有109株（12. 7% )表現(xiàn)為血清群6,在中國(guó)肺炎球菌血清型 6的紅霉素耐藥性達(dá)100%，其中的6A、6B和6C型分別為62株（56. 9%)、38株（34. 9% ) 和 9 株（8.2% )。
[0010] 從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，以上病原體擁有一個(gè)細(xì)胞表面莢膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS)或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)殼，或者兩者兼有，其功能是 幫助病原體感染宿主。莢膜多糖能夠屏蔽細(xì)菌細(xì)胞表面功能成分免于被宿主免疫系統(tǒng)識(shí) 另IJ，防止補(bǔ)體系統(tǒng)被細(xì)菌表面蛋白激活和免疫細(xì)胞吞噬，如果細(xì)菌被吞噬，莢膜多糖能夠防 止細(xì)菌被殺滅。大多數(shù)病原菌中，不同的菌株表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的莢膜多糖和脂多糖，產(chǎn)生多種 不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎和腦膜炎是由已知的90種血清型中的很大一部 分菌株感染所導(dǎo)致的。
[0011] 由此可見，大多數(shù)細(xì)菌多糖類疫苗必需含有多種不同種類的細(xì)菌多糖以提高致病 菌株覆蓋率，優(yōu)化和選擇包含何種細(xì)菌或者血清型多糖在疫苗中是一個(gè)非常復(fù)雜的流行病 學(xué)問題。一旦明確何種多糖抗體具有保護(hù)作用，則可用這種多糖作為免疫原來生產(chǎn)疫苗。
[0012] 中國(guó)生物技術(shù)集團(tuán)成都生物制品研究所生產(chǎn)的23價(jià)肺炎球菌疫苗是選取了 23種 最常見的致病菌（1，2,3,4,5,6B，7F，8,9N，9V，10A，11A，12F，14,15B，17F，18C，19A，19F，20， 22F，23F，33F)，分別發(fā)酵培養(yǎng)并分離提純肺炎球菌莢膜上的各型多糖，按等比例混合制成 疫苗。細(xì)菌的多糖是一種胸腺非依賴性抗原，這種抗原與胸腺依賴性抗原的主要區(qū)別在于 前者不需要T淋巴細(xì)胞的輔助來產(chǎn)生抗體。臨床使用證明，莢膜多糖制作的疫苗明確有效， 并在多個(gè)國(guó)家廣泛使用。但是這類多糖疫苗存在以下問題：（1)在幼小動(dòng)物或嬰幼兒體內(nèi) 只能產(chǎn)生微弱的免疫反應(yīng)，甚至不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)隨年齡的增長(zhǎng)而增強(qiáng)；（2)產(chǎn)生 低親和力的抗體；（3)只產(chǎn)生短暫的免疫反應(yīng)，不具備反復(fù)接種時(shí)的免疫記憶和免疫增強(qiáng) 效應(yīng)；(4)容易產(chǎn)生免疫耐受；（5)普通的佐劑對(duì)這種抗原不易起到免疫增強(qiáng)的作用，23價(jià) 多糖疫苗對(duì)于侵入型肺鏈感染的保護(hù)率為50-70%，而且只能用于2歲以上的人群接種，而 肺炎的高峰發(fā)病年齡為6-12月齡；(6)具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的多糖是T細(xì)胞獨(dú)立型2類的免疫 原，沒有T細(xì)胞的參與，它們是無法誘導(dǎo)免疫記憶效應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是IgM和 IgG2,不能夠有效地激活補(bǔ)體系統(tǒng)。
[0013] 半化學(xué)結(jié)合技術(shù)（也稱結(jié)合技術(shù)）開發(fā)疫苗的方法是從20世紀(jì)80年 代出現(xiàn)的開發(fā)細(xì)菌疫苗的技術(shù)。John Robbins通過將流行性嗜血桿菌b型 (Haemophilusinfluenzaetype b, Hib)莢膜多糖（Polyribosylribitolphosphate, PRP), 用共價(jià)鍵的形式連接到蛋白載體（破傷風(fēng)類毒素）合成出了流行性嗜血桿菌b型多糖 PRP-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗（PRP-TT)，在免疫動(dòng)物后，能夠產(chǎn)生殺菌的保護(hù)性抗體，從而 開創(chuàng)了新一代細(xì)菌疫苗開發(fā)技術(shù)。特別有意義的是，對(duì)于年齡小于2歲的嬰幼兒來說，由 于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，多糖對(duì)于嬰幼兒是屬于一種非T細(xì)胞依賴性抗原，不能夠刺激機(jī) 體如成人一樣產(chǎn)生長(zhǎng)效的針對(duì)于所述多糖來源的細(xì)菌特異性保護(hù)IgG抗體。因此，多糖對(duì) 于小于2歲的嬰幼兒是一種半抗原，不能夠作為疫苗來接種小于2歲的兒童。當(dāng)將細(xì)菌多 糖以共價(jià)鍵的形式連接到蛋白載體，如破傷風(fēng)類毒素 （Tetanus Toxoid，TT)，由于蛋白質(zhì)是 一種T細(xì)胞依賴性抗原，能夠?qū)⒐矁r(jià)鍵連接的多糖轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴性抗原，從而刺激機(jī) 體產(chǎn)生針對(duì)于所述多糖的特異性IgG抗體，保護(hù)機(jī)體不受細(xì)菌的感染。流行性嗜血桿菌b 型多糖-破傷風(fēng)類毒素（PRP-TT)結(jié)合疫苗開發(fā)的成功，開創(chuàng)了一個(gè)開發(fā)細(xì)菌疫苗的技術(shù) 平臺(tái)，即將細(xì)菌多糖，如莢膜多糖、0-特異性多糖（O-specificpolysaccharide)、或寡聚糖 (Oligosaccharide),以共價(jià)鍵連接到蛋白載體上而制成的結(jié)合疫苗?；谶@一概念的成 功，醫(yī)學(xué)生物研究界通過采用同一種化學(xué)合成方法開發(fā)出了不同細(xì)菌的結(jié)合疫苗；同樣也 用不同的合成技術(shù)開發(fā)出同一種細(xì)菌的結(jié)合疫苗。
[0014] 莢膜多糖能夠屏蔽細(xì)菌細(xì)胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，防止 補(bǔ)體系統(tǒng)被細(xì)菌表面的蛋白激活和免疫細(xì)胞吞噬。如果細(xì)菌被免疫細(xì)胞吞噬，莢膜多糖也 能夠避免細(xì)菌被殺滅。莢膜多糖是腦膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作為疫苗對(duì)較大的 兒童有一定的保護(hù)力。然而，莢膜多糖對(duì)2歲以下嬰幼兒、老年人以及B細(xì)胞免疫缺陷的人 群免疫效果差，接種劑不能達(dá)到抗體保護(hù)水平，且抗體很快消失。所述多糖疫苗與其它多糖 疫苗一樣，屬T細(xì)胞非依賴性抗原，具有年齡相關(guān)的免疫原性，且不誘生T細(xì)胞依賴性的加 強(qiáng)應(yīng)答。通過將多糖與某種蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，可使多糖轉(zhuǎn)化成T細(xì)胞依賴性抗原，從而刺激 嬰幼兒的T細(xì)胞依賴性抗體的合成，并可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，同時(shí)還能提高免疫球蛋白（IgG)的 抗體比例。這種多糖結(jié)合疫苗不僅能夠保護(hù)嬰幼兒（2歲以下兒童），還能夠大大地增強(qiáng)抵 抗力差的病人對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。1980年，JohnRobbins 用溴化氰來隨機(jī)活化Hib莢膜多糖，然后，將己二酰二肼（Adipic Dihydrazide，ADH)作 為連接物（linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法將衍化后的多糖共價(jià)鍵地連接到 載體蛋白破傷風(fēng)類毒素上，合成出了流行性嗜血桿菌b型多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗 (PRP-TT)。由于在每個(gè)多糖鏈上有多個(gè)活化點(diǎn)，蛋白載體上同樣的有多個(gè)連接點(diǎn)，形成的 結(jié)合物是一種多糖和蛋白交叉連接的大分子，平均分子量約為5X106Da。1980年，Harold Jennings在美國(guó)專利4356170里，陳述了用牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA)為 載體，將腦膜炎球菌的A，C群多糖通過還原胺法共價(jià)鍵地連接到BSA上，合成出了流行性腦 膜炎多糖-BAS結(jié)合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分別在美國(guó)專利4673574 和4902506里，描述了用變異無毒株白喉毒素197 (Cross reaction material subl97, CRM197)作為載體蛋白，以還原胺法合成了流行性嗜血桿菌b型寡聚糖-變異無毒株白喉毒 素197 (HbOC-CRM197)結(jié)合疫苗。具體的方法是用高碘酸鈉氧化Hib莢膜多糖，產(chǎn)生在兩末 端為醒基的寡聚糖，通過還原劑氰基硼氫化鈉（sodiumcyanoborohydride)，將寡聚糖共價(jià) 鍵連接到蛋白載體上。形成分子量約為90kDa的脂多糖結(jié)合物，制成了含有30%的多糖和 每一個(gè)蛋白上帶有6個(gè)糖分子的結(jié)合疫苗。隨后，美國(guó)默克（Merck，Sharpe and Dohme)以 巰基化學(xué)方法，用純化的奈瑟氏腦膜炎B群菌株（Neisseria meningitidis groups B)細(xì)菌 表面蛋白復(fù)合物（outer membrane protein complex，OMP)作為蛋白載體，合成出流行性嗜 血桿菌b型多糖-細(xì)菌表面蛋白復(fù)合物（PRP-0MP)結(jié)合疫苗。運(yùn)用這些合成技術(shù)，先后開 發(fā)出了三種現(xiàn)已廣泛用于臨床接種的流行性嗜血桿菌b型結(jié)合疫苗，即PRP-TT、PRP-HbOC 和PRP-OMP。Hib結(jié)合疫苗的成功為開發(fā)其它細(xì)菌結(jié)合疫苗提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)，隨后的 開發(fā)進(jìn)入了技術(shù)更為復(fù)雜的多價(jià)結(jié)合疫苗階段，其原因是某些傳染病，如肺炎球菌導(dǎo)致的 肺炎、流行性腦膜炎球菌所致的腦膜炎等，可由多種不同的血清型或菌株感染所致，并且各 血清型或菌株間由于細(xì)菌表面多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，其抗體沒有交叉免疫反應(yīng)，因此，接 種單一的血清型或菌株結(jié)合疫苗，無法保護(hù)被接種人體免于其它血清型或菌株的感染。由 于這個(gè)原因，合成和配制多價(jià)結(jié)合疫苗來擴(kuò)大疫苗的保護(hù)覆蓋率成為開發(fā)的主要目標(biāo)。
[0015] 通過多年的努力，用結(jié)合技術(shù)開發(fā)出了多種覆蓋率廣的多價(jià)結(jié)合疫苗。細(xì)菌莢膜 多糖-蛋白結(jié)合疫苗最早出現(xiàn)在20世紀(jì)30年代，Goebel和Avery將3型肺炎球菌多糖連 接到馬血清球蛋白上，產(chǎn)生的偶聯(lián)物能在動(dòng)物身上產(chǎn)生多糖專一的抗體，同時(shí)提供相應(yīng)的 免疫保護(hù)。1987年，世界上第一個(gè)多糖蛋白結(jié)合疫苗，B型流感嗜血桿菌（HiB)多糖-破傷 風(fēng)類毒素（TT)結(jié)合疫苗被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。默克公司、輝瑞公司和諾華公司相繼開 發(fā)了 HiB多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗和流行性腦膜炎多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗，并 成功上市。2000年，美國(guó)惠氏（Wyeth)公司成功開發(fā)并上市了 7價(jià)肺炎球菌多糖-CRM197結(jié) 合疫苗，是由7個(gè)不同的肺炎球菌血清型多糖分別共價(jià)鍵連接到CRM197蛋白載體上，混合 配制而成的一種多價(jià)疫苗，用以預(yù)防小兒肺炎，所述7個(gè)血清型肺炎球菌涵蓋了北美和歐 洲90%以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株。2006年，Sanofi Pasteur開發(fā)出了 4價(jià)腦膜 炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗，用于預(yù)防4種流行性腦膜炎球菌群，即A，C，Y，W135， 所致的腦膜炎。2009年，GlaxoSmithKline (GSK)也開發(fā)出了一種10價(jià)肺炎球菌多糖-蛋 白質(zhì)結(jié)合疫苗，用以預(yù)防10種肺炎球菌血清型所導(dǎo)致的肺炎。所述疫苗運(yùn)用了三種蛋白質(zhì) 作為蛋白載體，其中最主要的載體是蛋白_D(Protein D，H))，有8個(gè)血清型多糖是用這個(gè) 蛋白作為載體。蛋白-D是用非可分型的流行性嗜血桿菌的基因重組方法表達(dá)出來的無酯 化表面蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，有潛在的預(yù)防非可分型的流行性嗜血桿菌感 染所致的急性中耳炎，其他還有破傷風(fēng)類毒素和白喉內(nèi)毒素作為作為載體，被分別用作血 清型18C和19F的結(jié)合疫苗的蛋白載體。從以上結(jié)合疫苗產(chǎn)品的設(shè)計(jì)，可以看出，結(jié)合疫苗 的開發(fā)從單價(jià)疫苗過渡到技術(shù)上更為復(fù)雜的多價(jià)疫苗，提高了細(xì)菌疫苗的覆蓋率。
[0016] 多糖蛋白綴合疫苗（結(jié)合疫苗）是目前最先進(jìn)的疫苗技術(shù)，在特異抗原上加上蛋 白質(zhì)載體，可增加其免疫原性。蛋白質(zhì)載體具有T細(xì)胞依賴特性，多糖蛋白綴合疫苗可將非 T細(xì)胞依賴性質(zhì)的多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性質(zhì)的抗原，激發(fā)機(jī)體的T輔助細(xì)胞產(chǎn)生一 系列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。莢膜多糖結(jié)合疫苗，在多糖上加蛋白載體，由非T細(xì)胞依賴性抗原變 為T細(xì)胞依賴性抗原，增加其免疫原性。結(jié)合疫苗接種后產(chǎn)生的抗體在質(zhì)量和數(shù)量上是一 代疫苗的400-1000倍，產(chǎn)生免疫保護(hù)更廣更強(qiáng)，保護(hù)時(shí)間更長(zhǎng)久，達(dá)到高效保護(hù)。2000年， 美國(guó)輝瑞公司第一個(gè)7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗上市；美國(guó)輝瑞公司開發(fā)嬰幼兒更有針對(duì)性的 7 (4、6B、9V、14、18C、19F和23F)價(jià)肺炎球菌蛋白疫苗，對(duì)5歲以下兒童也有效。莢膜多糖蛋 白結(jié)合疫苗，在多糖上加蛋白載體，由非T細(xì)胞依賴性抗原變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，可增加 其免疫原性，可用于6周齡以上的兒童。目前輝瑞公司正在中國(guó)注冊(cè)13價(jià)結(jié)合疫苗，增加 了 6個(gè)血清型（1，3, 5, 7F，6A，19A)。但是我國(guó)的資料顯示肺炎球菌感染菌株血清型依次為： 5、6、1、19、23、14、2、4,輝瑞7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗對(duì)我國(guó)常見致病菌型覆蓋率只有50%左 右，而13價(jià)結(jié)合疫苗的覆蓋率也僅有70%?；菔?價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗需要接種4針劑， 每針860元，價(jià)格昂貴，不利于推廣。13價(jià)疫苗估計(jì)其價(jià)格將更為昂貴。因此美國(guó)輝瑞公司 的7和13價(jià)結(jié)合疫苗不太適合我國(guó)大范圍的兒童肺炎預(yù)防。
[0017] 盡管13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗已經(jīng)上市，但是其中有幾個(gè)血清型的免疫效果相對(duì) 其他血清型較低，如3型。且隨著不同血清型的增加和同種載體蛋白的重復(fù)使用，使得載體 蛋白用量增多，其免疫原性反而降低。GlaxoSmithKline在開發(fā)10價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫 苗的設(shè)計(jì)中，選擇了蛋白-D為載體，其原因是基于二個(gè)方面的考慮。其一，是為了避免重復(fù) 使用已經(jīng)作為百白破疫苗組分的破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素作為載體。臨床試驗(yàn)表明，當(dāng) 多價(jià)肺炎結(jié)合疫苗與其他含有與蛋白載體相同組分的單價(jià)疫苗或多聯(lián)疫苗同時(shí)接種時(shí)，t匕 如Hib-TT、百白破-Hib多糖結(jié)合疫苗-IPV(滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗）-乙肝疫苗（簡(jiǎn)稱6聯(lián) 疫苗），多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性會(huì)受到抑制，特別是對(duì)用 破傷風(fēng)類毒素作為載體的血清型多糖免疫原性影響尤其明顯。原因是多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫 苗中作為載體的破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素總濃度過高，在同時(shí)接種含有百白破組分的聯(lián) 合疫苗時(shí)，如6聯(lián)疫苗，會(huì)造成所謂載體受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制效應(yīng)，降低了結(jié)合疫苗多糖部分的 免疫原性。SanofiPasteur的11價(jià)肺炎球菌多糖-TT和DT混合載體蛋白結(jié)合疫苗和Merck 的7價(jià)肺炎球菌多糖-0ΜΡ結(jié)合疫苗（PCV-0MP)，都是臨床試驗(yàn)結(jié)果不佳而導(dǎo)致產(chǎn)品開發(fā)失 敗的例子，原因就在與此。其二，是賦予蛋白載體以真正的保護(hù)性免疫原性功能。臨床試驗(yàn) 證明蛋白-D能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，有潛在的預(yù)防非可分型流行性嗜血桿菌感染 造成的急性中耳炎。GlaxoSmithKline的10價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗選擇蛋白-D作為載 體，使得蛋白載體產(chǎn)生的抗體具有臨床意義的保護(hù)作用，是結(jié)合疫苗技術(shù)開發(fā)過程上的一 大進(jìn)步。
[0018] 不過，非可分型的流行性嗜血桿菌實(shí)際臨床意義受到所述類細(xì)菌感染率低下的限 制，其感染導(dǎo)致的急性中耳炎發(fā)病率較低。但這些結(jié)合疫苗有一個(gè)共同點(diǎn)缺點(diǎn)，就是蛋白 載體沒有賦予免疫原性的保護(hù)功能，也就是說，盡管結(jié)合疫苗載體能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體， 但是，疫苗的設(shè)計(jì)者并沒有利用其抗體具有的保護(hù)性來預(yù)防傳染病，同時(shí)，也沒有確定其產(chǎn) 生的抗體是否達(dá)到保護(hù)性滴度水平。破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和白喉無毒變異株毒素等 傳統(tǒng)蛋白被選擇作為載體的主要原因，并不是因?yàn)樗鼈兊漠a(chǎn)生的抗體具有保護(hù)性，而是從 其安全性和能夠增強(qiáng)結(jié)合物中多糖的免疫原性來考慮。顯而易見，破傷風(fēng)類毒素和白喉類 毒素已經(jīng)是百白破三聯(lián)疫苗的二個(gè)組分，被常規(guī)接種；所以，結(jié)合疫苗中的破傷風(fēng)類毒素和 白喉類毒素載體是否能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生達(dá)到保護(hù)性抗體滴度并不重要，相反的，結(jié)合疫苗 中的多糖部分的抗體滴度才是疫苗設(shè)計(jì)者需要關(guān)注的主要問題。另外，一些正在開發(fā)中的 結(jié)合疫苗產(chǎn)品所用的載體，如E. coli所表達(dá)的基因缺失突變脫毒的重組銅綠假單胞菌外 毒素 A(rEPA)，E. coli所表達(dá)的基因缺失突變脫毒的重組霍亂毒素等也都是基于相同的考 量。
[0019] 新多糖結(jié)合疫苗的種類和型別在逐年增加，而可供選擇的載體蛋白種類較少，不 同疫苗重復(fù)使用載體蛋白較多。接種相同載體蛋白的不同結(jié)合疫苗可能會(huì)產(chǎn)生免疫抑制效 應(yīng)，導(dǎo)致不同疫苗之間免疫效果的相互影響。而且，多糖結(jié)合物的主要載體蛋白如TT等，其 本身作為疫苗已大范圍接種嬰幼兒，人群體內(nèi)原有的針對(duì)載體蛋白的高滴度特異性抗體可 能會(huì)抑制機(jī)體對(duì)結(jié)合疫苗中多糖的特異性免疫反應(yīng)。
[0020] 中國(guó)專利（ZL02159032.X)公開了一種多糖-蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，也是目前 制備多糖結(jié)合疫苗最常使用的技術(shù)之一。在所述技術(shù)中，以己二酸二酰肼（ADH)作為連接 劑結(jié)合多糖與蛋白。這種結(jié)合方式首先需要將多糖經(jīng)溴化氰活化，即在堿性條件下用溴化 氰作用于多糖分子上的羥基，形成氰酸酯，然后與ADH反應(yīng)；氰酸酯中的一個(gè)碳氧鍵斷裂， 與ADH-端的氨基發(fā)生加成反應(yīng)，從而將酯酰肼（AH)基團(tuán)導(dǎo)入多糖分子，形成多糖-AH衍 生物；多糖-AH衍生物在碳二亞胺（EDAC)的介導(dǎo)下與載體蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合物。這樣的 結(jié)合方式可減少多糖與載體蛋白結(jié)合的空間位阻，保留了多糖的抗原表位，同時(shí)避免了多 糖本身的溶解性，減少多糖與抗血清反應(yīng)的副作用。
[0021] 然而，上述傳統(tǒng)的多糖-蛋白結(jié)合技術(shù)存在著以下不足之處：⑴多糖-AH衍生物 會(huì)繼續(xù)與溴化氰活化的多糖反應(yīng)，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的結(jié)合效率； (2)EDAC在介導(dǎo)ADH衍化多糖與載體蛋白結(jié)合的同時(shí)，容易引起多糖與載體蛋白的自身交 聯(lián)，從而降低多糖-蛋白的結(jié)合效率；（3)多糖和載體蛋白均為大型生物分子，中間靠?jī)H有 6個(gè)碳原子長(zhǎng)度的ADH相連，多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)勢(shì)必會(huì)相互影響，使得多糖的一些重要抗 原表位易被蛋白質(zhì)所屏蔽，進(jìn)而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白結(jié)合疫苗的免疫原 性和抗體持效性仍有待進(jìn)一步提高，如多糖結(jié)合疫苗需要免疫三次才能產(chǎn)生免疫效果。這 些不足之處限制了多糖結(jié)合疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。
[0022] 四、納米微球在生物技術(shù)中的應(yīng)用及前景
[0023] 納米材料是指晶粒尺寸小于100納米的單晶體或多晶體，獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)和表 面或界面等效應(yīng)，使其具備了許多優(yōu)異的或全新的性能，它正日益受到人們的重視。例如納 米材料對(duì)藥物研究領(lǐng)域的不斷滲透和影響，已經(jīng)引發(fā)了藥物領(lǐng)域一場(chǎng)深遠(yuǎn)的革命。藥物是 人類用于抵御和預(yù)防疾病的重要物質(zhì)，長(zhǎng)期以來，藥物的研究開發(fā)已經(jīng)為臨床提供了許多 的治療手段，為患者帶來了許多益處。但是，現(xiàn)有藥物仍存在著許多問題，如藥物無法在循 環(huán)系統(tǒng)內(nèi)滯留并達(dá)到有效濃度、無法到達(dá)特定的治療目標(biāo)、無法通過血腦屏障、無法在某個(gè) 局部形成較高濃度而同時(shí)又不產(chǎn)生毒副作用等（吳新榮.載藥納米微粒的應(yīng)用及研究進(jìn)展 [J].中國(guó)醫(yī)院藥物學(xué)雜志，2001，21 (3) : 171-173.)。磁性納米微球藥物載體是納米技術(shù)與 現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，由于它具有小尺寸效應(yīng)、良好的靶向性、生物相容性、生物降解性 和功能基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)，因此有望克服傳統(tǒng)藥物所帶來的這些缺陷。磁性納米微粒也可用于蛋 白質(zhì)和酶的純化、回收以及酶的固定化，操作簡(jiǎn)單，且提高酶的穩(wěn)定性。利用磁性納米微粒 進(jìn)行免疫分析，具有特異性好、分離快、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。使用磁性微球載體進(jìn)行介入治療， 在磁控血管內(nèi)進(jìn)行栓塞，則具有磁控導(dǎo)向、靶位栓塞等優(yōu)點(diǎn)。
[0024] 磁性納米微球在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用隨研究的深入日漸廣泛，具體有：
[0025] 1、固定化酶
[0026] 生物高分子例如酶分子等都具有很多官能團(tuán)，可以通過物理吸附、交聯(lián)、共價(jià)偶 合等方式將他們固定在磁性微粒的表面。用磁性納米微球固定化酶的優(yōu)點(diǎn)是：易于將酶 與底物和產(chǎn)物分離；提高酶的生物相容性和免疫活性；提高酶的穩(wěn)定性，且操作簡(jiǎn)單可降 低成本。Bendkiene等制備了殼聚糖磁性微球，用作固定化載體。酶被固定在這種載體上 之后，可以很容易地用磁性裝置從反應(yīng)的混合液中分離回收。國(guó)內(nèi)的研究者對(duì)這方面也 作了探索，丁小斌等采用分散聚合法，合成出Fe30V(St-MPE0) (St-苯乙烯，ΜΡΕ0-聚環(huán)氧 乙烷大單體）微球，所述微球具有兩親結(jié)構(gòu)，在大多數(shù)極性、非極性介質(zhì)中都具有良好的 溶脹性能，使得微球固載的化合物在多種介質(zhì)中都具有較高的活性（Ding XB，Wei L，Zhao HZ.Synthesis and characterization of aliphatic polycarbonatediols[J]. Applied Polymer Science, 2001，79 (3) :1847-1851)。所述磁性納米微球載體可望用于蛋白質(zhì)和酶 的純化、回收以及酶的固定化、細(xì)胞分離等領(lǐng)域。
[0027] 2、靶向藥物
[0028] 具有靶向性的藥物載體微球是指載藥微球能高選擇地分布于作用對(duì)象，從而增強(qiáng) 療效、減少副作用。最初的靶向藥物載體微球是根據(jù)臨床需要，通過選用對(duì)機(jī)體各種組織 或病變部位親和力不同的載體制作載藥微球，或?qū)慰寺】贵w與載體結(jié)合，以使藥物能夠 輸送到治療期望達(dá)到的特定部位。隨著人們對(duì)治療的要求越來越高，靶向定位也因受基質(zhì) 的限制而不能完全令人滿意，因此就出現(xiàn)了磁性納米微球載藥系統(tǒng)。這種系統(tǒng)在外加磁場(chǎng) 的作用下，通過動(dòng)（靜）脈注人到病變組織，把載體定向到病變部位（靶位），使所含藥物 得到定位釋放，集中到病變部位發(fā)生作用（A Paul,Alivisatos. Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay[J]· Science,2001，12(5):53-60)〇 德國(guó)的 Lubbe等完成了世界上第一例應(yīng)用磁性藥物靶向治療的臨床實(shí)驗(yàn)。在對(duì)14個(gè)晚期實(shí)體瘤患 者的磁靶向治療中，發(fā)現(xiàn)患者對(duì)磁性靶向藥物的耐受性很好。Lexion等也應(yīng)用磁性微球作 為藥物載體治療兔子的鱗癌（Lexion C，Arnold W, Klein RJ，et al.Locotegional cancer treatment with magnetic drug targeting[J]. Cancer Res,2000, 60(23):6641-6648), 國(guó)內(nèi)的陶凱雄等用阿霉素磁性蛋白微球治療鼠種植性胃腫瘤（陶凱雄，孫宏武，陳 道達(dá)，等.阿霉素磁性蛋白微球靶向治療鼠種植性胃腫瘤[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志， 2000, 17(1) :63-64))，郭軍等用平陽霉素磁性微球治療口腔領(lǐng)面部海綿狀血管瘤25例。此 夕卜，強(qiáng)磁場(chǎng)也具有抑癌作用（郭軍，李澄，吳漢江.平陽霉素磁性微球靶向治療口腔頜面部 海綿狀血管瘤25例臨床報(bào)告[J].南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，19(2):112-114))。徐慧顯 等用葡萄糖磁性微球固定化L-天冬酞胺酶來治療急性淋巴白血病，也取得了良好的治療 效果。這些結(jié)果都表明，隨磁場(chǎng)強(qiáng)度的提高磁性藥物在腫瘤部位的聚集增多，利用外加磁 場(chǎng)的磁導(dǎo)向作用，使藥物定點(diǎn)于靶部位，發(fā)揮集中、高效的抗腫瘤作用。正是由于磁性納米 微球的靶向性和表面結(jié)合的特異性載體，使人們有望利用它來追蹤和消滅正在轉(zhuǎn)移的癌細(xì) 胞，從而成為人體內(nèi)消滅癌細(xì)胞的"生物導(dǎo)彈"。但是，目前應(yīng)用磁性藥物治療的腫瘤多位于 體表或離體表較近，因此外加磁場(chǎng)的強(qiáng)度可以較弱，且易于控制，若治療深部器官或組織的 腫瘤，則需要進(jìn)一步優(yōu)化磁場(chǎng)強(qiáng)度、定位和藥物載體顆粒大小等。而要提高磁性微球的磁化 強(qiáng)度則有一定的難度，因?yàn)榇判晕⒘１砻娴陌矊訒?huì)大大降低其磁性能，另外，顆粒大小的 可控也是有待解決的一個(gè)問題。
[0029] 3、細(xì)胞分離和免疫分析
[0030] 如果磁性微粒表面引接具有生物活性的專一性抗體，在外加磁場(chǎng)的作用 下，利用抗體和細(xì)胞的特異性結(jié)合，就可以得到免疫磁性微球（Immunomagnetic microspheres，IMMS)或免疫磁性珠 （Immunomagnetic beads, IMBS)，利用它們可快速有效 地將細(xì)胞分離或進(jìn)行免疫分析。尤其是采用MBS對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞器表面所特有的抗原物質(zhì)進(jìn) 行分離時(shí)，具有簡(jiǎn)便快速、分離純度高、保留靶物質(zhì)活性等特點(diǎn)。Mccole等用MBS分離被肝 吸蟲感染過的成年牛外周血中的T淋巴細(xì)胞，分出的細(xì)胞純凈，用于肝吸蟲感染機(jī)制效果 良好。John用連有單抗的I麗S檢測(cè)沙門氏菌，整個(gè)檢測(cè)過程只需2-3h，靈敏度為103-104 菌體/ml，一定量血液和糞便的存在對(duì)分析無干擾，與凝集法和免疫熒光法相比，靈敏度提 高103倍。Glenn用MBS分離呼吸合包體病毒，結(jié)合酶聯(lián)免疫分析，減低了傳統(tǒng)管和微孔 分析中的擴(kuò)散和非特異性吸附，復(fù)合物的形成只需7min，而傳統(tǒng)微孔法則需120min。細(xì)胞 的分離技術(shù)還可用于癌癥的治療?？道^超等用物理吸附結(jié)合化學(xué)鍵共價(jià)結(jié)合的方法，將抗 人膀朧癌單克隆抗體連接到預(yù)先制備的聚苯乙烯磁性微球載體的表面，構(gòu)建了能特異地與 靶細(xì)胞結(jié)合并賦予其以磁響應(yīng)性的免疫磁性微球。結(jié)果表明，所構(gòu)建的IMMS可有效地和靶 細(xì)胞結(jié)合，用IMMS從動(dòng)物骨髓中分離癌細(xì)胞的初步實(shí)驗(yàn)表明，IMM可有效清除癌細(xì)胞，而骨 髓細(xì)胞僅有很少量的損失。免疫分析在現(xiàn)代生物分析技術(shù)中是一種重要的方法，它對(duì)蛋白 質(zhì)、抗原、抗體及細(xì)胞的定量分析發(fā)揮著巨大的作用。利用磁性納米微粒載體結(jié)合的抗原或 抗體進(jìn)行免疫分析，具有特異性高、分離快、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。景曉燕等采用無乳聚合法，在 醇一水體系中，以過二硫酸鉀為引發(fā)劑，在Fe304磁性流體粒子表面形成引發(fā)點(diǎn)，以丙烯酸 (AA)為穩(wěn)定劑，通過苯乙烯（ST)與丙烯酞胺共聚，制備出單分散的胺基磁性微球，所述微 球可直接、快速與抗體（抗原）蛋白質(zhì)交聯(lián)，避免了其它功能團(tuán)微球結(jié)合免疫試劑時(shí)需采用 蛋白質(zhì)為交聯(lián)劑的缺點(diǎn)（景曉燕，王君，李茹民，等.磁性功能高分子微球的制備研究[J]. 應(yīng)用科技，2000, 27 (1) : 16-17))。
[0031] 4、磁控檢塞
[0032] 在通常的介人治療過程中，會(huì)發(fā)生異位栓塞及梗死等現(xiàn)象，并引起嚴(yán)重的并發(fā)癥， 這是臨床上急需解決的棘手問題，而使用磁性微球載體的介人治療，在磁控血管內(nèi)進(jìn)行栓 塞則具有磁控導(dǎo)向、靶位栓塞等優(yōu)點(diǎn)，為解決以上難題提供了途徑。學(xué)者們著重在磁球粒 徑、磁控時(shí)間、磁場(chǎng)強(qiáng)度、磁性微球包裹材料（粗糙、攜帶正電荷、具有疏水特性）等方面 做了細(xì)致的研究。Minalnimura等運(yùn)用熱療和動(dòng)脈栓塞相結(jié)合的療法用于鼠肝癌模型的 研究。他們研制了 DM-MS動(dòng)脈導(dǎo)管局部給藥，外加500kHz的磁場(chǎng)。治療3d后，腫瘤增長(zhǎng) 率（栓塞-熱療組、單純栓塞組和對(duì)照組）分別為28%、124%和385% (Minalnimura T， Sato H, Kasaoka S, et al. Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepatic embolization using dextran magnetite incorporated microspheres in rats [J] · Int J Oncol，2000, 16 (6) :1153-1160)。此研究顯示 DM-MS 熱療和栓塞相結(jié)合療 法是一種抗腫瘤可行性療法，具有廣闊的研究和應(yīng)用前景。Goodwin等對(duì)阿霉素磁性微球 肝動(dòng)脈栓塞和藥物祀向?qū)鼓[瘤療法的毒性做了研究（Goodwin SC, Bittner CA, Peterson CL,et al.Single-dose toxicity study of hepatic intra-arterial infusion of doxorubicin coupled to a novel magnetically targeted drug carrier[J]. Toxical, 2001，60 (1) : 117-183)。他們建立的豬肝癌模型結(jié)果顯示阿霉素磁性微球低劑量 無毒副作用。只有當(dāng)磁性微球的含量> =75mg(含或不含阿霉素）靶區(qū)才有較好的效果， 肝癌細(xì)胞的壞死程度與栓塞程度成正比，阿霉素不能在全身自由循環(huán)而成功地被控制在靶 區(qū)?；菪褫x等用自制的聚甲基丙烯酸甲醋磁性微球?qū)ρ軆?nèi)栓塞進(jìn)行了探討，實(shí)驗(yàn)表明， 30-50um的PMMA磁性微球具有磁響應(yīng)能力強(qiáng)、磁控栓塞效果好、在高血流速情況下仍能實(shí) 現(xiàn)靶位栓塞等優(yōu)點(diǎn)，是一種較好的磁控血管內(nèi)栓塞材料（惠旭輝，高立達(dá)，何能前.聚甲基 丙烯酸甲酯磁性微球血管內(nèi)栓塞實(shí)驗(yàn)研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2001，22(10):928-929))。在磁 控栓塞中，磁性微球載體的大小是影響靶區(qū)定位最重要的因素。如果粒徑較小，則磁響應(yīng)性 弱，磁控度較差，不能用于高血流速或較大管徑血管內(nèi)的磁控栓塞。因此，與磁性微球在其 他方面的應(yīng)用有所不同，在磁控栓塞介人治療中，一般采用粒徑較大的磁性微球。
[0033] 也有報(bào)告指出，納米微球可作為DNA疫苗的載體蛋白和佐劑，但應(yīng)用于預(yù)防性多 糖和/或蛋白類疫苗未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0034] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種免疫原性更強(qiáng)的肺炎多 價(jià)結(jié)合疫苗。
[0035] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0036] -種肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其為多價(jià)肺炎球菌多糖與兩種或兩種以上的載體蛋白經(jīng) 連接體而成的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其中，連接體為磁性納米微球。
[0037] 作為一種優(yōu)選方案，該磁性納米微球的磁性微粒位于磁性納米微球的內(nèi)部為核， 高分子材料包裹于磁性微粒的外部。
[0038] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，磁性微粒為Fe304。
[0039] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，磁性納米微球粒徑為0. 1-10 μ m，優(yōu)選為0. 1-5 μ m。
[0040] 作為另一種優(yōu)選方案，高分子材料為生物高分子材料，選自殼聚糖、聚乙二醇、聚 乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA)中的一種或以上的混合 物；最佳為PLGA或PELA。
[0041] 作為另一種優(yōu)選方案，多價(jià)肺炎球菌多糖為多種肺炎球菌莢膜多糖，優(yōu)選為分離 提純血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖，該血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、6A、 6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。
[0042] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，多價(jià)肺炎球菌多糖與兩種載體蛋白的質(zhì)量比為（0. 5?2): 1，優(yōu)選為（〇. 5?1) :1，其中各載體蛋白間的質(zhì)量比優(yōu)選為1 :1。
[0043] 作為一種優(yōu)選優(yōu)選方案，該載體蛋白選自重組人輪狀病毒蛋白、白喉類毒素、破傷 風(fēng)類毒素、載體蛋白CRM197、嗜血流感桿菌表面蛋白HiD、百日咳Prn表面蛋白、百日咳Fha 抗原和/或肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0044] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，該載體蛋白中有一種為嗜血流感桿菌表面蛋白HiD或肺炎 球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0045] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，重組人輪狀病毒蛋白為P基因型輪狀病毒蛋白的部分氨基 酸序列或全序列，優(yōu)選為P基因型輪狀病毒毒株P(guān) [8]、P [4]、P [6]或P [11]中的一種；其中， P 基因型輪狀病毒毒株選自 P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5 或 P[6]G8 中 的一種。
[0046] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，P基因型P[8]的輪狀病毒毒株選自Wa、Ku、P、Y0、M0、 VA70、D、AU32、CH-32、CH-55、CHW2、CH927A、W161、F45、Ai-75、Hochi、Hosokawa、BR1054、 WT78或WI79毒株中的一種。
[0047] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，P基因型P[4]的輪狀病毒毒株選自DS-1、RV-5、S2、L26、 KUN、E210、CHW17、AU64、107E18、MW333 或 TB-Chen 毒株中的一種。
[0048] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，P基因型P[6]的輪狀病毒毒株選自M37、1076、RV-3、ST3、 SC2、BrB、McN13、US1205、MW023、US585 或 AU19 毒株中的一種。
[0049] 作為另一種進(jìn)一步優(yōu)選方案，重組人輪狀病毒蛋白選自VP8、VP4、VP8多肽鏈片 段、核VP8、VP4多肽鏈片段、VP8特異性抗原簇肽鏈或VP4特異性抗原簇肽鏈中的一種。
[0050] 作為另一種進(jìn)一步優(yōu)選方案，重組輪狀病毒蛋白是G血清型輪狀病毒的VP7蛋白 的部分氨基酸序列或全序列。
[0051] 作為另一種進(jìn)一步優(yōu)選方案，重組輪狀病毒蛋白是G血清型輪狀病毒的VP7蛋白 的部分氨基酸序列或全序列。
[0052] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，G血清型輪狀病毒毒株選自G1、G2、G3、G4、G9、G5、G8、G10 或G11血清型中的一種。
[0053] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述G血清型輪狀病毒毒株選自P [8]Gl、P [4]G2、P [8] G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5 或 P[6]G8 血清型中的一種。
[0054] 本發(fā)明的另一目的是提供該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法，具體是將多價(jià)肺炎球 菌多糖與兩種或以上的載體蛋白分別與磁性納米微球偶聯(lián)而成。
[0055] 作為一種優(yōu)選方案，該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法，具體包括以下步驟：
[0056] a)分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖；
[0057] b)分別制備并分離提純所選用的載體蛋白；
[0058] c)分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯(lián)成多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體；
[0059] d)再將多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體分別與多種載體蛋白偶聯(lián)結(jié)合；
[0060] e)分離純化步驟d)所得偶聯(lián)體成該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗原液。
[0061] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法，具體包括以下步驟：
[0062] a)分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖；
[0063] b)分別分離提純所選用的多種載體蛋白；
[0064] c)分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯(lián)成多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體，再經(jīng) 化學(xué)改性，從而將該多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體表面未與多糖反應(yīng)的-0H改性為-CH0 ; [0065] d)再將多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體分別與多種載體蛋白偶聯(lián)結(jié)合；
[0066] e)分離純化步驟d)所得偶聯(lián)體成該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗原液。
[0067] 作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，該制備方法還包括制備磁性納米微球，包括先制備納米磁 性粒子再制備磁性納米微球的過程；其中納米磁性粒子可通過化學(xué)共沉淀法、水熱法或溶 膠法熱解法制備，磁性納米微球可通過包埋法、單體聚合法或原位法制備，優(yōu)選為采用化學(xué) 共沉淀法制備納米磁性粒子再將納米磁性粒子與高分子材料經(jīng)快速膜乳化結(jié)合溶劑萃取 法和/或包埋法或單體聚合法制備磁性納米微球；最優(yōu)選為采用化學(xué)共沉淀法制備納米磁 性粒子再將納米磁性粒子與高分子材料經(jīng)快速膜乳化結(jié)合溶劑萃取法和/或包埋法制備 粒徑均一的磁性納米微球；其中磁性微粒優(yōu)選為Fe 304。
[0068] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，上述納米磁性離子的制備方法可可參照現(xiàn)有技術(shù)中Fe30 4 磁性納米微球的方法制備，具體可參見下述【具體實(shí)施方式】，并不作為本發(fā)明是否可實(shí)現(xiàn)的 關(guān)鍵因素。
[0069] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟a中多糖的分離純化工藝可根據(jù)所需的多糖及蛋白 種類根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行操作。
[0070] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟b中的蛋白的制備及分離純化工藝可根據(jù)所需的多 糖及蛋白種類根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行操作。
[0071] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟c的具體操作為：在偶聯(lián)介質(zhì)反應(yīng)緩沖液中，室溫 下、pH4. 0-9. 0下，將步驟a所得多糖與磁性納米微球共反應(yīng)6-24小時(shí)得多糖-磁性納米 微球偶聯(lián)體，再通過25%戊二醛對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步改性，使得多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體表 面未與多糖反應(yīng)的-0H改性為-CH0 ;其中偶聯(lián)介質(zhì)優(yōu)選為PB、PBS或TBS，最佳為0. 1M TBS 溶液；反應(yīng)緩沖液的最佳pH為6 ;最佳反應(yīng)時(shí)間為12-16小時(shí)。
[0072] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟d的具體操作為：在偶聯(lián)介質(zhì)反應(yīng)緩沖液中，4°C、 pH4. 0-9. 0下，將步驟c所得經(jīng)化學(xué)改性的多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體與載體蛋白共反應(yīng) 12-24小時(shí)；其中偶聯(lián)介質(zhì)優(yōu)選為PB、PBS或TBS，最佳為0. 1M TBS溶液；反應(yīng)緩沖液的最 佳pH為6 ;最佳反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。
[0073] 作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，步驟e的分離純化是將偶聯(lián)結(jié)合物和未反應(yīng)的多糖和 載體蛋白分離純化，純化方法可用層析法或超濾法；可根據(jù)獲得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的 分子大小進(jìn)行分離純化，層析法優(yōu)選采用Superdex200凝膠過濾柱、Sepharose CL-4B或 S印harose CL-6B進(jìn)行；而超濾法是采用不同滯留分子量膜來分離結(jié)合物和未反應(yīng)物。 [0074] 該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗制劑可采用水劑或凍干劑。為了增強(qiáng)其免疫原性，可加入佐 齊IJ，常用的佐劑有鋁佐劑，如氫氧化鋁、磷酸鋁，本發(fā)明優(yōu)先選擇磷酸鋁。結(jié)合物的溶劑可為 0. 2氯化鈉溶液、1XPBS緩沖液或其它能夠穩(wěn)定多糖或者結(jié)合物的緩沖液。本發(fā)明的肺炎 多價(jià)結(jié)合疫苗各制劑的制備方法采用本【技術(shù)領(lǐng)域】的常規(guī)手段制備。其中，優(yōu)選在糖（例如 蔗糖或乳糖）存在下進(jìn)行凍干。
[0075] 本發(fā)明提供的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗可以以任何已有的途徑進(jìn)行免疫，包括真皮層或 皮膚給藥、肌肉給藥等形式。其中，所給予的量是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常識(shí)可以確定的。
[0076] 術(shù)語定義
[0077] 核VP8 :是輪狀病毒蛋白VP8中的一段具有和細(xì)胞表面含有唾液酸（sialic acid) 粘合功能的多肽鏈，通常含有160氨基酸殘基。
[0078] VP8多肽鏈片段：為任何分子量低于全長(zhǎng)VP8的多肽鏈。
[0079] VP4多肽鏈片段：為任何分子量低于全長(zhǎng)VP4的多肽鏈。
[0080] VP8特異性抗原簇鏈：全VP8多肽鏈含有多個(gè)抗原決定簇，通過基因重組的方法剪 切去不含重要的氨基酸，而保留含有特異性抗原簇的多肽鏈，分子量通常小于全長(zhǎng)VP8多 肽鏈。
[0081] VP4特異性抗原簇鏈：全VP4多肽鏈含有多個(gè)抗原決定簇，通過基因重組的方法剪 切去不含重要的氨基酸，而保留含有特異性抗原簇的多肽鏈，分子量通常小于全長(zhǎng)VP4多 肽鏈。
[0082] VP8融合蛋白：用基因重組方法，將VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽鏈融合表達(dá)， 以提高VP8在水溶液中的可溶性；或增強(qiáng)VP8的免疫原性。
[0083] NSP4蛋白：是非結(jié)構(gòu)性蛋白，具有腸毒素特性，分子量為28kDa，含有175個(gè)氨基 酸。
[0084] VP8-NSP4融合蛋白：用基因重組的方法，將VP8和NSP4多肽鏈融合表達(dá)，以提高 VP8在水溶液中的可溶性，同時(shí)使得融合蛋白具有刺激機(jī)體產(chǎn)生抗NSP4的保護(hù)性抗體。
[0085] 莢膜多糖片段：通過物理（如超聲波、微粒噴霧）、化學(xué)（如酸、堿、酶消化）等方法 將由細(xì)菌培養(yǎng)液中純化的多糖（稱全多糖或原始多糖）降解（depolymerization)所獲得 的多糖片段，分子量通常低于原始多糖。莢膜寡聚糖：通過物理（如超聲波、微粒噴霧）、化 學(xué)（如酸、堿、酶消化）等方法將由細(xì)菌培養(yǎng)液中純化的多糖（稱全多糖或原始多糖）降解 (depolymerization)所獲得的多糖片段，分子結(jié)構(gòu)中的單糖殘基通常低于10。不過單糖殘 基數(shù)量的定義有差異，有些文獻(xiàn)將多于10個(gè)少于20個(gè)單糖殘基的多糖鏈也成為寡聚糖。 [0086] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：
[0087] 1.該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗是含兩種或兩種以上不同載體蛋白的免疫綴合物，與現(xiàn)有 的肺炎球菌結(jié)合疫苗相比，其免疫原性更強(qiáng)，誘發(fā)的多糖抗體水平高于單載體結(jié)合物，可以 在更廣闊的人群中引起免疫應(yīng)答，尤其是嬰幼兒；可通過減少各載體劑量而避免載體表位 過載；可通過兩種載體增強(qiáng)輔助T細(xì)胞活性；
[0088] 2.由于兩種載體蛋白中具有保護(hù)性的蛋白抗原表位也會(huì)誘導(dǎo)比兩種蛋白混合注 射時(shí)更高的免疫反應(yīng)，相互協(xié)同作用，進(jìn)一步增進(jìn)了載體蛋白的免疫原性，增加了機(jī)體對(duì)多 糖的免疫反應(yīng)；另一種為佐劑作用載體蛋白，還可進(jìn)一步增強(qiáng)免疫原性，且具有一定的免疫 記憶；
[0089] 3.本發(fā)明首創(chuàng)的采用納米微球作為多糖與多載體蛋白的連接體，有效地避免在制 備過程中莢膜多糖和蛋白質(zhì)的自身偶聯(lián)，能夠提高結(jié)合產(chǎn)物的收率，并且利于產(chǎn)品的質(zhì)量 控制；可有效延長(zhǎng)莢膜多糖與載體蛋白之間的空間距離，減小了載體蛋白對(duì)莢膜多糖抗原 表位的空間屏蔽效應(yīng)，有利于提高莢膜多糖的免疫原性；
[0090] 4.該肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備過程中首創(chuàng)的將納米微球表面的-0H先與多糖進(jìn) 行偶聯(lián)反應(yīng)，再將偶聯(lián)體經(jīng)化學(xué)改性將未反應(yīng)-0H改性為-CH0在與載體蛋白中的-NH 2進(jìn) 行偶聯(lián)結(jié)合，較現(xiàn)有技術(shù)中的結(jié)合方法更為穩(wěn)定；
[0091] 5.其制備方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要，未顯著改變莢膜多糖和載體蛋 白的結(jié)構(gòu)特征。
[0092] 綜上述，本發(fā)明提供的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗制備工藝簡(jiǎn)單，采用納米微球?yàn)檫B接物 的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗能夠增強(qiáng)小鼠 Thl型免疫應(yīng)答，以及多糖特異性抗體的免疫持效性、 特異性和親和性，此外還可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生輪狀病毒抗體；具備兩種疫苗的預(yù)防效果；因此 具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0093] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的1H-NMR譜圖；
[0094] 圖2為本發(fā)明提供的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的多糖特異性抗體的免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)結(jié)果 示意圖；
[0095] 圖3為本發(fā)明提供的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的多糖特異性抗體的免疫持效性實(shí)驗(yàn)結(jié) 果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0096] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。以下所用試劑或設(shè)備均為 市售品種，如無特殊說明，均按照說明書操作，在此不做贅述。
[0097] 以下為結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0098] 實(shí)施例1
[0099] -、制備磁性納米微球
[0100] 1.取 2. 24gFeS04-7H20 和 3. 24gFeCl3-6H20 分別溶于 10mL 和 15mL 過濾除氧的 dddH20中，溶解后混合均勾，加入100mL過濾除氧的dddH20 ;
[0101] 2.在N2的保護(hù)下攪拌5min，一次性加入50mLlmol/LNa0H溶液，再調(diào)節(jié)溶液pH至 9-10,加快攪拌速度至200-250r/min，連續(xù)攪拌30min ;
[0102] 3.將反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移至65_70°C水浴中，繼續(xù)在N2的保護(hù)下攪拌陳化30min ;
[0103] 4.反應(yīng)完畢定容至100mL，顯微鏡下觀察磁性粒子合成情況；
[0104] 5.將400mgPLGA溶于lOmLEA溶劑中作為油相（0)，加入3mL上述磁性粒子溶液作 為內(nèi)水相^)，采用超聲細(xì)胞破碎儀（120W、60s)在冰水浴中進(jìn)行初乳化化制備初乳，再將 初乳倒入一定量含15g/LPVA和0.9% (c〇)NaCl的水溶液（外水相，W2)，磁力攪拌（300r/ min、2min)制備預(yù)復(fù)乳液（W/0/%)，再將預(yù)復(fù)乳倒入快速膜乳化的儲(chǔ)料罐中，以一定隊(duì)壓 力將其反復(fù)壓過SPG膜，得粒徑均一的納米微球復(fù)乳液滴。此外，未用完的納米微球可制成 凍干劑留用。
[0105] 或通過取Fe304磁性粒子與50mL與無水乙醇按等體積加入，超聲活化30min后， 置60°C水浴中，緩慢的滴加 lOmLPELA對(duì)磁性納米微球進(jìn)行-NH2末端改性且將PELA包裹在 Fe304磁性粒子外，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)10h，制成磁性納米微球；反應(yīng)完畢后，用50mL無 水乙醇洗漆3次，再用0. 01MPBS洗漆三次后，定容至50mL，顯微鏡下觀察磁珠改性情況，至 磁性納米微球表面-NH2末端改為-0H末端。
[0106] 二、肺炎球菌多糖的制備
[0107] 1.選取 24 種血清型（1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)的肺炎球菌培養(yǎng)；
[0108] 2.分別提純以上各種血清型肺炎球菌中抗原性強(qiáng)的莢膜多糖：肺炎球菌，滅活 后離心收集上清液，經(jīng)超濾濃縮，根據(jù)各肺炎球菌血清型特性分別加入適量（體積分?jǐn)?shù)為 70 %的）預(yù)冷乙醇，離心收集，得粗制多糖；將粗制多糖溶于乙酸鈉溶液中，然后按1 :2比 例以冷酚混勻，離心去除蛋白，反復(fù)酚提5-6次，收集上清，用蒸餾水透析，透析后液體加 2mol/L氯化鈣溶液，加入乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清，補(bǔ)加乙醇（終濃度80 %攪 拌），離心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗滌沉淀，脫水干燥后即為多價(jià)精制莢膜多糖，置-20°C 保存?zhèn)溆谩?br> [0109] 三、輪狀病毒載體蛋白的制備
[0110] 輪狀病毒載體蛋白的制備可參見現(xiàn)有技術(shù)中的多種重組蛋白的制備方法，本實(shí)施 例采用CN 101972475中提及的方法制備，可簡(jiǎn)化為以下步驟，具體參數(shù)不做贅述：
[0111] 1、建立輪狀病毒的cDNA庫(kù)
[0112] 選用的為Wa毒株VP8蛋白的VP4基因，擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)如下：sense引物 HWaVP4 P ET28 ：
[0113] 5, -TTACATATGGCTTCGCTCATTTATAG-3,，anti-sense 引物 AHWaVP4 P ET28 :
[0114] 5 ' -CCGGATCCCTAGTCTTCATTAACTTGTGCT-3 '。
[0115] 2、構(gòu)建pET28aWaVP8表達(dá)全長(zhǎng)VP8質(zhì)粒
[0116] 3、表達(dá)重組VP8蛋白
[0117] 1)將制得的pET28aWaVP8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)competent細(xì)胞中，接種細(xì)胞到 50 μ g/mL卡那霉素 LB培養(yǎng)皿，在37 °C下于C02培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。
[0118] 2)挑選出一個(gè)菌落，接種到10毫升含有50 μ g/mL的卡那霉素 LB培養(yǎng)液（1 %胰 蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%似(：1，？!17.5)中擴(kuò)增，在371：培養(yǎng)過夜。
[0119] 3)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接種到100毫升的50 μ g/mL卡那霉素 LB培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待吸 光度600nm的0D到達(dá)1. 0時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接種到6升到50 μ g/mL卡那霉素 LB培養(yǎng)液中，繼 續(xù)在37°C，搖速200rpm的搖床內(nèi)培養(yǎng)，待吸光度600nm的0D到達(dá)0. 6?0. 8時(shí)，加入0. 3mM 的IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)VP8表達(dá)。
[0120] 4)在相同的培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)4小時(shí)后，以4000g下，在10°C離心20分鐘后，收集 菌體。
[0121] 5)將細(xì)菌懸浮于20mL的1XPBS溶液，用法式壓濾壺（Frenchpress)破碎細(xì)菌后， 在lOOOOg下，在10°C離心30分鐘，丟棄上清液，收集沉淀的包涵體。在進(jìn)一步純化前，存儲(chǔ) 包涵體于-40°C。
[0122] 3、從包涵體中純化VP8蛋白
[0123] 1)稱取制備的VP8包涵體0. 5克（濕重），用清洗緩沖液（lOmMTris，lOOmM磷酸 鹽緩沖液，2Murea，pH8. 0)懸浮包涵體，在室溫下孵育30分鐘，以10, 000g離心10分鐘，收 集包涵體。重復(fù)以上步驟三次除去污染的雜蛋白。
[0124] 2)將包涵體沉淀溶于溶解緩沖液（lOmMTris-HCl，100mM磷酸鹽緩沖液，8M尿素， PH8.0)中，在冰上攪拌孵育1小時(shí)。以16, 000g離心30分鐘，收集上清液，丟棄不溶沉淀 物。
[0125] 3)用固定金屬離子親和層析色譜法（IMAC)純化His-tagged重組VP8蛋白。
[0126] 4)收集含有VP8的洗脫液，轉(zhuǎn)入透析袋中在含有20πιΜβ-巰基乙醇1和8M尿素的 TBS(pH4. 0)中透析，并逐漸降低尿素的濃度（即8,6,4,2，和說)，在41：中透析過夜。然后 在含有2πιΜβ -巰基乙醇的TBSpH5. 5溶液中透析兩次，最后在TBS溶液中透析。根據(jù)重組 VP8蛋白來源的毒株不同，來進(jìn)行最后透析。
[0127] 四、肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)的制備
[0128] 將PspA蛋白克隆至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)并分離純化，具體包括：
[0129] 1.目的基因的優(yōu)化和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0130] 在GenBank中獲取PspA基因序列（GI :193804931)并進(jìn)行優(yōu)化，加上His標(biāo)簽后 進(jìn)行全基因合成，將合成的序列經(jīng)Sac I和Nde I雙酶切后，定向克隆至同樣雙酶切的表 達(dá)載體pET-30a (+)中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21Star (DE3)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克 隆菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用Nde I和Sac I雙酶切鑒定，并送測(cè)序，將測(cè)序正確的重 組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-30a-rPspA。
[0131] 2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0132] 復(fù)蘇工程菌，以1 :100的比例接種2XLB培養(yǎng)基，在37°C，237r/min下擴(kuò)大培 養(yǎng)，當(dāng)菌體值約為12時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C誘導(dǎo)4h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE 分析離心收集誘導(dǎo)菌體，加入生理鹽水重懸洗滌2次，以1:10 (g/mL)的比例加入05mol/ LNaC15mmol/L咪唑20mmol/LPB(pH7. 4)的緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，8000Xg離 心40min，收集上清，于鎳離子層析柱中進(jìn)行純化，按說明書操作純化產(chǎn)物的及分析將載體 pET-30a(+)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21Star(DE3)全菌體（對(duì)照）和將上步純化樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉搖床輕微振蕩封閉2h ;加入His鼠源單抗 (1 : 800稀釋），4°C過夜；TBST清洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(l : 2000稀釋），室 溫孵育lh ;洗滌3次，DAB顯色。
[0133] 五、肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備
[0134] 1.多糖-磁性納米微球偶聯(lián)
[0135] 0. 1MTBS溶液緩沖液下，pH6. 0加入上述步驟制得的任一或多種莢膜多糖和磁性 納米微球，本實(shí)施例中采用13價(jià)莢膜多糖（1、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)， 莢膜多糖與磁性納米微球的質(zhì)量比為1: (〇. 5-1)，于室溫下反應(yīng)6-24小時(shí)；其中優(yōu)化的質(zhì) 量比為1: 1，于室溫下縮醛反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用透析袋充分透析，除去未反應(yīng)磁性 納米微球。
[0136] 2.偶聯(lián)體改性
[0137] 取步驟1多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體30mL，攪拌條件下緩慢滴加2mL25%戊二酸， 200r/min攪拌反應(yīng)6小時(shí)；反應(yīng)完畢后，用0. 01MPBS洗滌三次后，定容至30mL，顯微鏡下觀 察磁性納米微球改性情況，使得多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體表面未與多糖反應(yīng)的-0H改性 為-CH0 ;N2、4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0138] 3.與PspA載體蛋白和輪狀病毒蛋白共偶聯(lián)
[0139] 0. 1MTBS溶液緩沖液下，4°C、pH4. 0-9. 0下，將改性后的多糖-磁性納米微球分別 與輪狀病毒蛋白和PspA蛋白共反應(yīng)24小時(shí)（為保證足量的載體蛋白與磁性納米微球，采 用過量納米載體蛋白加入量，如質(zhì)量比采用多糖：磁性納米微球：PspA :輪狀病毒蛋白=1 : 1 ：2 ：2) 〇
[0140] 4.肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的分離純化
[0141] 用Superdex200凝膠過濾柱（2. 6cmX60cm)進(jìn)行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸 緩沖液（PH7. 4)，流速為3mL/min。收集對(duì)應(yīng)于多糖-磁性納米微球-雙載體蛋白的洗脫峰。
[0142] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析
[0143] 用1H-NMR進(jìn)行檢測(cè)所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，檢測(cè)結(jié)果見圖1。如圖1所示，與莢膜 多糖分子相比，綴合物在〇. 4-1. 4ppm處出現(xiàn)了特征峰，對(duì)應(yīng)于載體蛋白的脂肪鏈氨基酸殘 基。在7. 2ppm處出現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于載體蛋白的芳香族氨基酸殘基的特征峰。這表明莢膜多糖 分子成功地偶聯(lián)了輪狀病毒蛋白和PspA載體蛋白兩種載體蛋白。在6. 2ppm處出現(xiàn)了對(duì)應(yīng) 于琥珀酰亞胺的特征峰，這表明多糖結(jié)合疫苗的連接橋中含有琥珀酰亞胺。此外，5. 2、1. 6、 3. 6出線了 PELA的特征峰證明磁性納米微球PELA作為連接物。因此，莢膜多糖在結(jié)合兩種 載體蛋白前后，其結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。
[0144] 通過CL-4B即SEC-MALLS方法檢測(cè)多糖蛋白綴合物的分子量分布情況；通過免疫 雙擴(kuò)的方法使用不同的抗體血清確定多糖蛋白綴合物中的蛋白和多糖種類；通過蒽酮法檢 測(cè)多糖蛋白綴合物的多糖含量；Lowry法蛋白含量檢測(cè)多糖蛋白綴合物的總蛋白含量，再 通過計(jì)算得到綴合物的多糖蛋白結(jié)合比（Ratio);輪狀病毒蛋白、PspA蛋白濃度通過酶聯(lián) 免疫法檢測(cè)。結(jié)果表明：在所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗原液中，各物質(zhì)的濃度比約為：多糖：磁 性納米微球：PspA :輪狀病毒蛋白=1 :1 :1 :1)。
[0145] 對(duì)比例1
[0146] 本對(duì)比例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：制得的疫苗中無磁性納米微粒作為連接體， 而且通過現(xiàn)有技術(shù)中提及的方法將雙載體蛋白與多糖綴合而得。
[0147] 對(duì)比例2
[0148] 本對(duì)比例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：制得的疫苗中無 PspA載體蛋白，僅采用多 糖-磁性納米微粒-輪狀病毒載體蛋白為肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗。
[0149] 實(shí)施例2
[0150] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的載體蛋白為破傷風(fēng) 類毒素載體蛋白和PspA。
[0151] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析結(jié)果與實(shí)施例1所得結(jié)果存在理論誤差范 圍內(nèi)的一致性。
[0152] 實(shí)施例3
[0153] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的載體蛋白為輪狀病 毒載體蛋白和破傷風(fēng)類毒素載體蛋白。
[0154] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析結(jié)果與實(shí)施例1所得結(jié)果存在理論誤差范 圍內(nèi)的一致性。
[0155] 實(shí)施例4
[0156] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的載體蛋白為輪狀病 毒載體蛋白和嗜血流感桿菌表面蛋白HiD。
[0157] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析結(jié)果與實(shí)施例1所得結(jié)果存在理論誤差范 圍內(nèi)的一致性。
[0158] 實(shí)施例5
[0159] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的載體蛋白為載體蛋 白 CRM197 和 PspA。
[0160] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析結(jié)果與實(shí)施例1所得結(jié)果存在理論誤差范 圍內(nèi)的一致性。
[0161] 實(shí)施例6
[0162] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：連接體為PLGA磁性納米顆粒。
[0163] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析結(jié)果與實(shí)施例1所得結(jié)果存在理論誤差范 圍內(nèi)的一致性。
[0164] 實(shí)施例7
[0165] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：連接體為PEG磁性納米顆粒。
[0166] 制得的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的組成分析結(jié)果與實(shí)施例1所得結(jié)果存在理論誤差范 圍內(nèi)的一致性。
[0167] 疫苗評(píng)價(jià)
[0168] 以下采用免疫原性等疫苗常規(guī)效價(jià)的評(píng)估實(shí)驗(yàn)評(píng)估實(shí)施例1?7及對(duì)比例1?2 所得疫苗的免疫效果：
[0169] A.肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗免疫原性實(shí)驗(yàn)
[0170] 選取100只5周齡的雌性Blab/C小鼠，體重為15-22克。隨機(jī)分為10組，即實(shí)施 例1?7、對(duì)比例1?2和陽性對(duì)照組（Prevnar 13)，每組10只小鼠。腹腔注射，每只每次 注射為5微克，每周注射1次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法檢測(cè)小鼠血漿中 抗莢膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1
[0171] 表 1
[0172]

【權(quán)利要求】
1. 一種肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗為多價(jià)肺炎球菌多糖 與兩種或兩種以上的載體蛋白經(jīng)連接體而成的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其中，連接體為磁性納 米微球。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：所述磁性納米微球的磁性 微粒位于磁性納米微球的內(nèi)部為核，高分子材料包裹于磁性微粒的外部。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：高分子材料為生物高分子 材料，選自殼聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物 (PELA)中的一種或以上的混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：多價(jià)肺炎球菌多糖為多 種肺炎球菌莢膜多糖，優(yōu)選為分離提純血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖，所述血清型肺 炎球菌的血清型包括 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、 19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：多價(jià)肺炎球菌多糖與兩種 載體蛋白的質(zhì)量比為（0.5?2) :1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：所述載體蛋白選自重組人 輪狀病毒蛋白、白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，載體蛋白CRM197,嗜血流感桿菌表面蛋白HiD， 百日咳Prn表面蛋白，百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌表面蛋白A (rPspA)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗，其特征在于：所述載體蛋白中有一種為 嗜血流感桿菌表面蛋白HiD或肺炎球菌表面蛋白A (rPspA)。
8. 權(quán)利要求1?7任一所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于：將多價(jià)肺炎 球菌多糖與兩種或以上的載體蛋白分別與磁性納米微球經(jīng)偶聯(lián)而成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，具體包括以下 步驟： a) 分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖； b) 分別制備并分離提純所選用的多種載體蛋白； c) 分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯(lián)成多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體； d) 再將多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體分別與多種載體蛋白偶聯(lián)結(jié)合； e) 分離純化步驟d)所得偶聯(lián)體成所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗原液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，具體包括以下 步驟： a) 分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖； b) 分別分離提純所選用的多種載體蛋白； c) 分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯(lián)成多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體，再經(jīng)化學(xué) 改性，從而將所述多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體表面未與多糖反應(yīng)的-OH改性為-CHO ; d) 再將多糖-磁性納米微球偶聯(lián)體分別與多種載體蛋白偶聯(lián)結(jié)合； e) 分離純化步驟d)所得偶聯(lián)體成所述肺炎多價(jià)結(jié)合疫苗原液。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104208671SQ201410491364
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】艾智武, 劉昊智, 史晉, 吳克 申請(qǐng)人:武漢博沃生物科技有限公司