利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法及專用設(shè)備的制作方法
【專利摘要】利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法和專用設(shè)備，屬于組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該發(fā)明基于溶芯技術(shù)和細(xì)胞組裝技術(shù)，將各種細(xì)胞生長因子、抑制因子或藥物復(fù)合到可交聯(lián)/聚合的水凝膠材料中，從噴頭中擠出的絲狀水凝膠經(jīng)交聯(lián)/聚合、合成高分子復(fù)合、培養(yǎng)液洗滌處理后纏繞堆積在旋轉(zhuǎn)內(nèi)芯上，含不同類型種子細(xì)胞的水凝膠和粘附內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的水凝膠分別形成主體部分和血管、神經(jīng)系統(tǒng)，成形完畢后溶除內(nèi)芯并培養(yǎng)一段時(shí)間后得到具有螺旋狀血管和神經(jīng)的組織器官。本發(fā)明工藝簡單且易于成形血管和神經(jīng)系統(tǒng)，特別適用于成形傳統(tǒng)組織工程難以成形的具有內(nèi)腔的組織器官，制備的組織器官可貼敷于病損組織器官處或者直接移植體內(nèi)替換病損組織器官。
【專利說明】利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法及專用設(shè)備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法及專用設(shè)備，屬于組織工程領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 人體病損組織和器官的修復(fù)和替代是本世紀(jì)令人矚目的科學(xué)前沿，也是一項(xiàng)亟 需解決的科學(xué)難題。由于活體組織器官移植存在供體短缺以及免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)大等固有弊 端，難以成為解決該問題的有效途徑。據(jù)此，以提高此類疾患治療水平為目的的組織工程 (Tissue Engineering)應(yīng)運(yùn)而生，組織工程旨在體外構(gòu)建細(xì)胞和材料的三維結(jié)構(gòu)體，通過 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和訓(xùn)練后發(fā)展成具有和天然組織類似結(jié)構(gòu)和功能的可移植替代物。近年來，組 織工程一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，發(fā)展迅速并取得了諸多成果，但就其產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域而言， 目前主要集中在結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單的骨組織工程和皮膚組織工程等少數(shù)幾個(gè)領(lǐng)域。究其原因， 很重要的一點(diǎn)就是，現(xiàn)有的組織工程結(jié)構(gòu)體的體外構(gòu)建方法（如電紡絲、模鑄法等）難以構(gòu) 建具有天然組織類似的復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，致使結(jié)構(gòu)體內(nèi)部的細(xì)胞存活率低，因此難以 實(shí)現(xiàn)大塊組織的構(gòu)建。
[0003] 傳統(tǒng)的組織工程遵循"細(xì)胞-支架復(fù)合"的"自上而下"的構(gòu)建思路，即先成形支 架，再把細(xì)胞種植到支架上。但是，當(dāng)支架尺寸和復(fù)雜度提高到一定程度時(shí)，支架成形和細(xì) 胞復(fù)合的難度將大大增加。細(xì)胞三維受控組裝技術(shù)（Wang X H，Yan Y N，Zhang R J. Rapid prototyping as a tool for manufacturing bio-artificial livers. Trends in Biotech nology，2007, 25(11) :505-513.)，即細(xì)胞3D打印技術(shù)，遵循"支架-細(xì)胞"一體化構(gòu)建的思 路。在細(xì)胞打印過程中，細(xì)胞（或細(xì)胞聚集體）與溶膠（水凝膠的前驅(qū)體）同時(shí)置于或者 含細(xì)胞的培養(yǎng)液單獨(dú)置于打印機(jī)的噴頭中，由計(jì)算機(jī)控制含細(xì)胞液滴的沉積位置，在指定 的位置逐點(diǎn)打印，在打印完一層的基礎(chǔ)上繼續(xù)打印另一層，層層疊加形成三維多細(xì)胞-凝膠 體系。細(xì)胞打印技術(shù)的特點(diǎn)是可以保證細(xì)胞密度和分布的均勻性，并且可以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞 的共同組裝和定點(diǎn)排布。但是氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的有效輸送問題，即"血管化問題"仍然是該 方法構(gòu)建可移植復(fù)雜組織器官的瓶頸問題。
[0004] 現(xiàn)有的通過細(xì)胞3D打印成形的組織器官都是按照一層一層的平面堆積而成的， 因其成形的固有特點(diǎn)，微通道（血管）的成形依賴于成形精度及材料的性質(zhì)。而且對(duì)于具 有內(nèi)腔結(jié)構(gòu)組織器官的成形，依靠平面堆積的細(xì)胞打印技術(shù)在其成形過程中不可避免地需 要增加支架或者轉(zhuǎn)動(dòng)成形臺(tái)或噴頭方位，大大增加了設(shè)計(jì)和成形的難度，有時(shí)甚至還無能 為力。
[0005] 中國專利文獻(xiàn)CN1654028提出一種利用溶芯法制造管網(wǎng)狀支架的方法，先利用水 溶性、無生物毒性的材料制造支架的內(nèi)芯，然后將生物相容性材料涂覆在支架內(nèi)芯上，經(jīng)風(fēng) 干后用蒸餾水溶除支架內(nèi)芯。該方法只能成形結(jié)構(gòu)較簡單的管網(wǎng)狀支架，對(duì)于具有復(fù)雜血 管的組織器官的成形無能為力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的組織工程中難以構(gòu)建具有復(fù)雜血管和神經(jīng)結(jié)構(gòu)的 空腔類組織器官，提供一種基于旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法及專用設(shè)備。該方法在細(xì) 胞受控組裝技術(shù)和溶芯技術(shù)的基礎(chǔ)上，目的在于提供一種新的組織器官的制備方法，便于 制備具有螺旋網(wǎng)狀血管和神經(jīng)的組織器官，特別適用于制備具有內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的組織器官。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的工藝方法，其特征在于本發(fā)明的專用設(shè)備包括支 撐裝置、多噴頭組件、運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)、成形裝置以及控制系統(tǒng)；所述支撐裝置包括支撐腿和底板； 所述運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)采用導(dǎo)軌-滑塊機(jī)構(gòu)，包括X向?qū)к?、X向滑塊、Y向?qū)к?、第?Y向滑塊、第 二Y向滑塊、Z向?qū)к?、Z向滑塊，所述X向?qū)к壴O(shè)在底板上，Z向?qū)к壒探釉赬向滑塊上，Y 向?qū)к壒探釉赯向滑塊上；所述多噴頭組件至少含有六個(gè)噴頭，包括至少兩個(gè)擠壓式噴頭 和四個(gè)噴灑式噴頭，兩個(gè)擠壓式噴頭的噴嘴內(nèi)徑分別為200 μ m?1mm和50 μ m?500 μ m， 噴灑式噴頭噴嘴的網(wǎng)孔直徑為50 μ m?100 μ m，噴頭分兩組分別安裝在第一 Y向滑塊和第 二Υ向滑塊上；所述成形裝置包括成形容器、支架和電機(jī)，成形容器安裝在底板上并處于噴 頭組件的下部，支架安裝在成形容器內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連。
[0009] 本發(fā)明所述專用設(shè)備其特征在于：所述支架的結(jié)構(gòu)為兩端呈圓柱狀、中間為棱柱 狀，材料為不銹鋼或者鈦合金。
[0010] 本發(fā)明所述專用設(shè)備其特征在于：所述第一 Υ向滑塊和第二Υ向滑塊上分別開有 與Υ向?qū)к壠叫械牡谝恍?dǎo)軌和第二小導(dǎo)軌，第一小導(dǎo)軌和第二小導(dǎo)軌上分別安裝第一小 滑塊）和第二小滑塊，第一小滑塊和第二小滑塊上開有可固定噴頭的孔。
[0011] 利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：
[0012] 1)材料制備：
[0013] 制備0. 2?20% (w/v)水凝膠溶液、1?10% (w/v)交聯(lián)劑/聚合液、0. 1?10% (w/v)合成高分子溶液、0. 2?10% (w/v)明膠溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液；分離或者誘導(dǎo)種子細(xì) 胞，種子細(xì)胞密度為1X 1〇3?1X 1〇6個(gè)/mL，將種子細(xì)胞與水凝膠溶液按1?9 :9?1體 積比混合制成含種子細(xì)胞的水凝膠溶液；分離或者誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并制成細(xì)胞 懸液，神經(jīng)細(xì)胞懸液和內(nèi)皮細(xì)胞懸液密度均為IX 1〇3?IX 1〇8個(gè)/mL;
[0014] 2)內(nèi)芯制備
[0015] 當(dāng)制備具有內(nèi)腔的組織器官時(shí)，根據(jù)所要制備組織器官的內(nèi)腔形狀，用三維繪圖 軟件設(shè)計(jì)其三維模型，用快速成形法制作具有此內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的模具，當(dāng)成形實(shí)體的組織器官 時(shí)，模具是直徑厚8?10mm的圓柱；將支架放入模具中央，往模具中加入明膠溶液后降低溫 度至8?1(TC使明膠固化，打開模具得到中心帶支架的組織器官內(nèi)芯，在帶支架的組織器 官內(nèi)芯外涂覆水凝膠，并用交聯(lián)劑/聚合液進(jìn)行交聯(lián)/聚合；
[0016] 3)成形
[0017] 將含種子細(xì)胞的水凝膠溶液和不含細(xì)胞的水凝膠溶液分別裝入第一擠壓式噴頭 和第二擠壓式噴頭中，交聯(lián)劑/聚合液、神經(jīng)細(xì)胞懸液、內(nèi)皮細(xì)胞懸液以及合成高分子溶液 分別裝入第四噴灑式噴頭、第二噴灑式噴頭、第一噴灑式噴頭和第三噴灑式噴頭中，在成形 容器內(nèi)裝入細(xì)胞培養(yǎng)液，將支架安裝在成形容器內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連，將待成形組織器 官的模型導(dǎo)入控制系統(tǒng)后，啟動(dòng)成形設(shè)備，開始堆積成形；在成形過程中，支架繞Y負(fù)向做 旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，噴頭做平移運(yùn)動(dòng)，當(dāng)成形組織器官的主體部分時(shí)，第一擠壓式噴頭運(yùn)動(dòng)到指定位 置擠出含種子細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)裝有交聯(lián)劑/聚合液的第四噴灑式噴頭運(yùn) 動(dòng)到第一擠壓式噴頭的正后方噴灑出交聯(lián)劑/聚合液對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)/聚合；當(dāng)成形血管時(shí)， 第二擠壓式噴頭運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出不含細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)第四噴灑式噴 頭運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭正后方，第一噴灑式噴頭和第三噴灑式噴頭分別運(yùn)動(dòng)到第二擠壓 式噴頭正前方，在旋轉(zhuǎn)的內(nèi)芯帶動(dòng)下，新纏繞的水凝膠依次運(yùn)動(dòng)至第四噴灑式噴頭下進(jìn)行 交聯(lián)/聚合，經(jīng)過培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，至第一噴灑式噴頭、第三噴灑式噴頭下進(jìn)行噴灑內(nèi)皮細(xì) 胞和復(fù)合合成高分子溶液；當(dāng)成形神經(jīng)時(shí)，第二擠壓式噴頭運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出不含細(xì)胞 的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)第四噴灑式噴頭運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭正后方，第二噴灑式 噴頭和第三噴灑式噴頭分別運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭正前方，在旋轉(zhuǎn)的內(nèi)芯帶動(dòng)下，新纏繞 的水凝膠依次運(yùn)動(dòng)至第四噴灑式噴頭下進(jìn)行交聯(lián)/聚合，經(jīng)過培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，至第二噴 灑式噴頭、第三噴灑式噴頭下進(jìn)行噴灑神經(jīng)細(xì)胞和復(fù)合合成高分子；如此反復(fù)纏繞堆積直 至形成含內(nèi)芯的組織器官前體；
[0018] 4)后續(xù)處理
[0019] 將含內(nèi)芯的組織器官前體置于恒溫箱中培養(yǎng)，溶除內(nèi)芯后取出支架，經(jīng)培養(yǎng)后形 成回轉(zhuǎn)體狀組織器官，神經(jīng)和血管以螺旋狀貫穿其中。
[0020] 本發(fā)明所述制備組織器官的方法，其特征在于：所述的種子細(xì)胞為具有分化能力 的干細(xì)胞或具有生理活性的成體細(xì)胞；所述的干細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、血液干細(xì) 胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多功能干細(xì)胞，所述成體細(xì)胞為脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、淋巴 細(xì)胞、心肌細(xì)胞或腎細(xì)胞；所述水凝膠為復(fù)合了明膠、膠原、基質(zhì)膠、卡拉膠、殼聚糖、瓊脂、 透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、彈性蛋白和層粘素中一種或多種的海藻酸鈉或纖維蛋白原溶液；所述的 水凝膠中可復(fù)合各種細(xì)胞凍存劑、細(xì)胞生長因子、藥物和抗凝血?jiǎng)?；?xì)胞凍存劑為二甲基亞 砜（DMS0)、甘油和右旋糖中的一種或多種復(fù)合物；所述的細(xì)胞生長因子為血管內(nèi)皮生長因 子（VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（b-FGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、人血小板衍化生長 因子（PDGF-BB)和轉(zhuǎn)化生長因子β UTGF-β 1)中的一種或多種復(fù)合物；所述的藥物為抗腫 瘤藥物，該抗腫瘤藥物為黃芪多糖、順式二氨基二氯絡(luò)鉬（DDP)、絲裂霉素（MMC)，5-氟尿嘧 啶（5-FU)、抗過敏藥物、抗生素、病毒疫苗中的一種或多種復(fù)合物；所述的抗凝血因子為肝 素、紫杉醇中的一種或多種復(fù)合物；所述合成高分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳 酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯和聚羥基酸酯中的一種或者多種，溶劑為 四乙二醇或1，4_二氧六環(huán)。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性的技術(shù)效果：
[0022] ①本發(fā)明將溶芯法和3D打印方法結(jié)合起來，能成形傳統(tǒng)3D打印方法難以成形的 具有內(nèi)腔的組織器官；
[0023] ②多噴頭的使用可實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞非均質(zhì)成形以及表面復(fù)合處理，滿足天然組織器 官對(duì)多種細(xì)胞的要求；
[0024] ③在水凝膠表面噴灑內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞的血管（神經(jīng)）形成方式能成形具有復(fù)雜 結(jié)構(gòu)的血管（神經(jīng)），合成高分子溶液形成的薄膜提高了水凝膠表面粘附的內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì) 胞數(shù)目，有效促進(jìn)血管（神經(jīng)）的形成；
[0025] ④成形過程中細(xì)胞培養(yǎng)液既能為細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)又可以洗滌凝膠表面的交聯(lián) 劑/聚合液及合成高分子中的有機(jī)溶劑，減小其對(duì)細(xì)胞的損傷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明的專用設(shè)備三維結(jié)構(gòu)簡圖。
[0027] 圖2為第一 Y向滑塊的三維結(jié)構(gòu)簡圖。
[0028] 圖3為本發(fā)明的組織器官成形過程示意圖。
[0029] 圖4為本發(fā)明的組織器官成形工藝流程圖。
[0030] 圖5a為不含細(xì)胞的水凝膠；圖5b為噴上內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞后的水凝膠；圖5c為 噴灑合成高分子溶液后的水凝膠。
[0031] 圖6為本發(fā)明的組織器官的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0032] 圖中：101 -底板；102 -成形容器；103 -支架；104 -第一噴灑式噴頭；105 -第二噴 灑式噴頭；106 - Z向滑塊；107 - Y向?qū)к墸?08 -第三噴灑式噴頭；109 -第一小滑塊；110 -第一小導(dǎo)軌；111 -第一 Y向滑塊；112 -第二Y向滑塊；113 -第一擠壓式噴頭；114 -第二 擠壓式噴頭；115 -第四噴灑式噴頭；116 -第二小滑塊；117 -第二小導(dǎo)軌；118 - Z向?qū)к墸?119 -旋轉(zhuǎn)電機(jī)；120 - X向滑塊；121 - X向?qū)к墸?01 -內(nèi)芯；402 -噴頭組件；403 -材料； 404 -水凝膠絲；405 -培養(yǎng)液；601 -主體部分；602 -血管（神經(jīng)）；603 -內(nèi)腔。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0034] 圖1是本發(fā)明提供的利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的專用設(shè)備，該設(shè)備包括多噴 頭組件、運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)、成形裝置以及控制系統(tǒng)（未畫）。所述運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)由滑塊一導(dǎo)軌（槽）實(shí) 現(xiàn)，包括X向?qū)к?21和X向滑塊120、Y向?qū)к?07和第一 Y向滑塊111、第二Y向滑塊 112、Z向?qū)к?18和Z向滑塊106以及第一小滑塊109、第二小滑塊116和第一小導(dǎo)軌110、 第二小導(dǎo)軌117 ;所述X向?qū)к?21設(shè)在底板101上；所述Z向?qū)к?18固接在X向滑塊 120上；所述Y向?qū)к?07固接在Z向滑塊106上；所述第一小導(dǎo)軌110和第二小導(dǎo)軌117 分別安裝在第一 Y向滑塊111和第二Y向滑塊112上；所述多噴頭組件至少含有六個(gè)噴頭， 包括至少兩個(gè)擠壓式噴頭和四個(gè)噴灑式噴頭，分兩組分別固定在兩個(gè)平行的Y向滑塊上， 第一噴灑式噴頭104、第二噴灑式噴頭105和第三噴灑式噴頭108安裝在第一 Y向滑塊111 上，其中第一噴灑式噴頭104和第二噴灑式噴頭105安裝在第一 Y向滑塊111上的噴頭固 定槽中，第三噴灑式噴頭108安裝在第一小滑塊109的噴頭固定槽上；第四噴灑式噴頭115 和至少兩個(gè)擠壓式噴頭，第一擠壓式噴頭113和第二擠壓式噴頭114,安裝在第二Y向滑塊 112上，其中第一擠壓式噴頭113和第二擠壓式噴頭114固定在第二Y向滑塊112的噴頭固 定槽上，第四噴灑式噴頭115安裝在第二小滑塊116的噴頭固定槽上，第一擠壓式噴頭113 和第二擠壓式噴頭114的噴嘴內(nèi)徑分別為200 μ m - 1mm和50 μ m - 500 μ m，四個(gè)噴灑式噴 頭噴嘴的網(wǎng)孔直徑為50μπι - ΙΟΟμπι ;所述成形裝置包括成形容器102、支架103以及電機(jī) 119,成形容器102安裝在底板101上噴頭組件的正下方，可拆卸的支架103安裝在成形容 器102內(nèi)并與電機(jī)119的輸出軸相連，所述支架103為具有一定力學(xué)強(qiáng)度的對(duì)細(xì)胞無毒性 的固體材料，如不銹鋼或者鈦合金；所述控制系統(tǒng)負(fù)責(zé)控制噴頭組件的三維平移運(yùn)動(dòng)和支 架的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
[0035] 圖2為第一 Y向滑塊的三維結(jié)構(gòu)簡圖，所述第一 Y向滑塊上開有兩個(gè)用來固定噴 頭的孔和一個(gè)能讓噴頭運(yùn)動(dòng)的大孔，大孔兩邊設(shè)有第一小導(dǎo)軌110,第一小滑塊109可沿小 導(dǎo)軌運(yùn)動(dòng)，帶動(dòng)其上的第三噴灑式噴頭108輪流為第一噴灑式噴頭104第二噴灑式噴頭105 工作，第二Υ向滑塊結(jié)構(gòu)與第一 Υ向滑塊類似。
[0036] 圖3為本發(fā)明的利用旋轉(zhuǎn)堆積法成形組織器官的流程圖，主要包括成形前的準(zhǔn)備 工作、組織器官前體成形以及后續(xù)操作等三大主要步驟。
[0037] 成形前的準(zhǔn)備工作包括材料的制備和內(nèi)芯的制作，制備0. 2?20% (w/v)水凝膠 溶液、1?10 % (w/v)交聯(lián)劑/聚合液、0.1?10 % (w/v)合成高分子溶液、0.2?10 % (w/v) 的明膠溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液；根據(jù)所要成形的組織器官的類型，從病人身上分離具有分化能 力的自體干細(xì)胞，如脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、血液干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)型多功能干細(xì) 胞，或具有生理活性成體細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、心肌細(xì)胞或腎細(xì) 胞作為種子細(xì)胞，并制成細(xì)胞懸液，種子細(xì)胞密度為1X 1〇3?1X 1〇8個(gè)/mL，將種子細(xì)胞懸 液與滅菌后的水凝膠溶液按體積比為1?9 :9?1均勻混合，制備成含種子細(xì)胞的水凝膠 混合物；所述水凝膠為可復(fù)合明膠、膠原、基質(zhì)膠、卡拉膠、殼聚糖、瓊脂、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、 彈性蛋白、層粘素中一種或多種的海藻酸鈉或纖維蛋白原溶液，所述的水凝膠中可復(fù)合各 種細(xì)胞凍存劑、細(xì)胞生長因子、藥物、抗凝血?jiǎng)?。?xì)胞凍存劑為二甲基亞砜（DMS0)、甘油、右 旋糖中的一種或多種復(fù)合物。所述的細(xì)胞生長因子為內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（如血管內(nèi)皮生長 因子（VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（b-FGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、人血小板衍化生 長因子（PDGF-BB)、轉(zhuǎn)化生長因子M(TGF-M)中的一種或多種復(fù)合物。所述的藥物為抗 腫瘤藥物（如黃芪多糖、順式二氨基二氯絡(luò)鉬（DDP)、絲裂霉素（MMC)，5-氟尿嘧啶（5-FU)、 抗過敏藥物、抗生素（如青霉素、赤霉素、四環(huán)素）、病毒疫苗中的一種或多種復(fù)合物。所述 的抗凝血因子為肝素、紫杉醇中的一種或多種復(fù)合物；所述合成高分子溶液的溶質(zhì)具體為 聚氨酯（PU)、聚己內(nèi)酯（PCL)、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)、聚酯 和聚羥基酸酯中的一種或者多種，溶劑為四乙二醇或1，4 -二氧六環(huán)；取出成形容器102上 的支架103并進(jìn)行滅菌處理，當(dāng)成形具有內(nèi)腔的組織器官時(shí)，根據(jù)所要成形的組織器官內(nèi) 腔的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用三維繪圖軟件設(shè)計(jì)其三維模型，用快速成形法制作具有此內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的模 具，將支架103立入模具中，往模具中加入明膠溶液，降低溫度至10?12°C使明膠固化，得 到中心帶支架的組織器官內(nèi)芯；當(dāng)成形實(shí)體組織器官時(shí)，內(nèi)芯為厚5?6_的圓柱套筒；然 后在帶支架的組織器官內(nèi)芯外涂覆一層水凝膠，并用交聯(lián)劑/聚合液進(jìn)行交聯(lián)/聚合。
[0038] 圖4為本發(fā)明的旋轉(zhuǎn)堆積成形過程示意圖，將含種子細(xì)胞的水凝膠和不含細(xì)胞的 水凝膠分別裝入設(shè)備中第一擠壓式噴頭113和第二擠壓式噴頭114中，交聯(lián)劑/聚合液、神 經(jīng)細(xì)胞懸液和內(nèi)皮細(xì)胞懸液分別裝入第四噴灑式噴頭115、第二噴灑式噴頭105和第一噴 灑式噴頭104中，合成高分子溶液裝入第三噴灑式噴頭噴頭108中，將支架103安裝在成形 容器102中并在成形容器102內(nèi)裝入細(xì)胞培養(yǎng)液405 ;將待成形組織器官的模型導(dǎo)入控制 系統(tǒng)后，啟動(dòng)成形設(shè)備，開始堆積成形，在成形過程中，支架103繞Y負(fù)向做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，噴頭 做平移運(yùn)動(dòng)，當(dāng)成形組織器官主體部分時(shí)，第一擠壓式噴頭113運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出含種 子細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)裝有交聯(lián)劑/聚合液的第四噴灑式噴頭115運(yùn)動(dòng)到第 一擠壓式噴頭113的正后方噴灑出交聯(lián)劑/聚合液對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)/聚合；當(dāng)成形血管時(shí)，第 二擠壓式噴頭114運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出不含細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)第四噴灑式 噴頭115運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭114正后方，第一噴灑式噴頭104和第三噴灑式噴頭108 分別運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭114正前方，在旋轉(zhuǎn)的內(nèi)芯帶動(dòng)下，新纏繞的水凝膠依次運(yùn)動(dòng) 至第四噴灑式噴頭115下進(jìn)行交聯(lián)/聚合，經(jīng)過培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，經(jīng)過第一噴灑式噴頭104、 第三噴灑式噴頭108下進(jìn)行噴灑內(nèi)皮細(xì)胞和復(fù)合合成高分子；當(dāng)成形神經(jīng)纖維束時(shí)，第二 擠壓式噴頭114運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出不含細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)第四噴灑式噴 頭115運(yùn)動(dòng)到第一擠壓式噴頭113正后方，第二噴灑式噴頭105和第三噴灑式噴頭108分 別運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭114正前方，在旋轉(zhuǎn)的內(nèi)芯帶動(dòng)下，新纏繞的水凝膠依次運(yùn)動(dòng)至 第四噴灑式噴頭115下進(jìn)行交聯(lián)/聚合，經(jīng)過培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，經(jīng)過第二噴灑式噴頭105、第 三噴灑式噴頭108下進(jìn)行噴灑神經(jīng)細(xì)胞和復(fù)合合成高分子，如此反復(fù)纏繞堆積，直至成形 所需的組織器官。
[0039] 圖5a為不含細(xì)胞的水凝膠；圖5b為噴上內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞后的水凝膠；圖5c為 噴灑合成高分子溶液后的水凝膠；成形血管（神經(jīng)）時(shí)，從噴頭中噴出的不含細(xì)胞的水凝 膠絲經(jīng)交聯(lián)/聚合和洗滌后，依次被噴上一層內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞和合成高分子溶液，形成凝 膠-細(xì)胞-薄膜結(jié)構(gòu)，在后續(xù)培養(yǎng)過程中，水凝膠逐漸水解，內(nèi)皮細(xì)胞或者神經(jīng)細(xì)胞生長并 相互聯(lián)系，最終形成血管和神經(jīng)結(jié)構(gòu)。
[0040] 圖6為本發(fā)明提供的組織器官的結(jié)構(gòu)示意圖，所述組織器官為回轉(zhuǎn)體或近回轉(zhuǎn) 體，由內(nèi)腔603和外圍實(shí)體組成；所述內(nèi)腔603為圓柱狀、球狀或者由其他曲面圍成的閉 合曲面形狀；所述外圍實(shí)體由含或者不含細(xì)胞的水凝膠絲纏繞堆積而成；含有種子細(xì)胞的 水凝膠絲602纏繞形成主體結(jié)構(gòu)，不含細(xì)胞的水凝膠絲603表面涂覆內(nèi)皮細(xì)胞和合成高分 子溶液形成血管系統(tǒng)，不含細(xì)胞的水凝膠表面涂覆神經(jīng)細(xì)胞和合成高分子溶液形成神經(jīng)系 統(tǒng)。
[0041] 下面舉出幾個(gè)具體的實(shí)施例，以進(jìn)一步理解本發(fā)明：
[0042] 實(shí)施例1心房的制備
[0043] (1)材料制備
[0044] 提取脂肪干細(xì)胞（ADSCs)、內(nèi)皮細(xì)胞（ECs)、神經(jīng)細(xì)胞、星狀細(xì)胞和心肌細(xì)胞 (CMCs)，培養(yǎng)傳代，得到細(xì)胞材料，內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞濃度均為8 X 107個(gè)/mL，星狀細(xì)胞和 心肌細(xì)胞密度為2X 106個(gè)/mL ;取2g海藻酸鈉和7g明膠置于100mL培養(yǎng)液中使其完全溶 解，在該混合液中加入質(zhì)量體積濃度3 %的細(xì)胞凍存液DMS0,滅菌處理得到明膠-海藻酸鈉 水凝膠材料；取4g明膠置于100mL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到明膠溶液；制備 0. 05g/ml的氯化鈣水溶液作為其交聯(lián)劑/聚合液；將可降解聚碳酸酯溶于四乙二醇中得到 質(zhì)量體積濃度為2%的合成高分子溶液，滅菌處理待用；制備細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM和1 %膠原溶 液。將星狀細(xì)胞和心肌細(xì)胞的混合液與水凝膠以體積比為1:1混合得到含心肌-星狀細(xì)胞 的水凝膠溶液。
[0045] (2)內(nèi)芯制備
[0046] 根據(jù)心房內(nèi)腔的形狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用三維繪圖軟件設(shè)計(jì)三維紡錘狀模型，用快速成 形法制作具有此內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的模具，將滅菌后的支架立入模具中，往模具中加入明膠溶液，降 低溫度至10?12°C使明膠固化，形成中心帶支架的心房內(nèi)芯，并在帶支架的心房內(nèi)芯外涂 覆一層膠原溶液，并使膠原固化形成一層不溶于水溶液的保護(hù)膜；
[0047] (3)成形
[0048] 將含心肌-星狀細(xì)胞和DMS0的水凝膠和不含細(xì)胞的水凝膠分別裝入第一擠壓式 噴頭113和第一擠壓式噴頭114,內(nèi)皮細(xì)胞懸液和神經(jīng)細(xì)胞懸液分別裝入第一噴灑式噴頭 104、第二噴灑式噴頭105,氯化鈣水溶液裝入第四噴灑式噴頭115,合成高分子溶液裝入第 三噴灑式噴頭108,將帶明膠內(nèi)芯的支架安裝在成形容器102內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連，在成 形容器102內(nèi)裝入100mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，整個(gè)裝置置于溫度為8?10°C的環(huán)境中，將心房模 型導(dǎo)入控制系統(tǒng)后啟動(dòng)成形裝置，開始成形。
[0049] (4)溶芯
[0050] 成形完畢后，將含明膠內(nèi)芯的心房前體置于液氮中長期保存或恒溫箱中培養(yǎng)，融 除內(nèi)芯，取出支架，即得到帶內(nèi)腔的心房前體。
[0051] (5)后期培養(yǎng)
[0052] 將心房前體至于脈動(dòng)生物培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，在應(yīng)力場(chǎng)的多重作用 下，促使細(xì)胞間建立連接并誘導(dǎo)生長，在不含細(xì)胞的凝膠絲周圍的內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞誘導(dǎo)分 化形成內(nèi)徑約為1mm的血管（神經(jīng)），在凝膠降解后，最終形成具有自主收縮能力的含有血 管和神經(jīng)的心房。此心房可直接貼附在病損心臟上，達(dá)到修復(fù)再生的目的。
[0053] 實(shí)施例2肝臟前體的制備
[0054] (1)材料制備
[0055] 提取人體骨髓干細(xì)胞（BSCs)、脂肪干細(xì)胞（ADSCs)、內(nèi)皮細(xì)胞（ECs)、神經(jīng)細(xì)胞和 肝細(xì)胞，培養(yǎng)傳代，得到種子細(xì)胞；取1纖維蛋白原和7g明膠置于100mL培養(yǎng)液中使其完全 溶解，其中加入〇. 1 %的抗腫瘤藥物黃芪多糖，滅菌處理得到纖維蛋白原-明膠-黃芪多糖 水凝膠材料；取4g明膠置于100mL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到明膠溶液；制備 0. 05g/ml的凝血酶PBS聚合液；將PU溶于四乙二醇中得到質(zhì)量體積濃度為5%的合成高分 子溶液，滅菌處理待用；
[0056] 將上述制備的骨髓干細(xì)胞-肝細(xì)胞與纖維蛋白原-明膠-黃芪多糖水凝膠材料混 合得到脂肪干細(xì)胞和肝細(xì)胞的密度均為1X 1〇6個(gè)/mL的含肝細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞的水凝膠。 內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞與〇. 1%肝素磷酸緩沖液（PBS)混合得到濃度均為5X 107個(gè)/mL的 內(nèi)皮-脂肪干細(xì)胞懸液。神經(jīng)細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞混合得到濃度均為5 X 107個(gè)/mL的神經(jīng)-脂肪干細(xì)胞懸液。
[0057] (2)內(nèi)芯制備
[0058] 在滅菌后的支架表面涂一層厚度約為5mm的明膠，降低溫度至10?12°C固化形 成內(nèi)芯，在帶支架的肝臟前體內(nèi)芯外涂覆水凝膠并交聯(lián)聚合形成一層不溶于培養(yǎng)液的保護(hù) 膜。
[0059] (3)成形
[0060] 將含肝細(xì)胞-骨髓干細(xì)胞的纖維蛋白原-明膠-黃芪多糖水凝膠和不含細(xì)胞的水 凝膠分別裝入第一擠壓式噴頭113和第一擠壓式噴頭114,內(nèi)皮-脂肪干細(xì)胞-肝素懸液和 神經(jīng)-脂肪干細(xì)胞懸液分別裝入第一噴灑式噴頭104和第二噴灑式噴頭105,凝血酶聚合液 裝入第四噴灑式噴頭115,合成高分子裝入第三噴灑式噴頭108。將帶明膠內(nèi)芯的支架安裝 在成形容器102內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連，并在成形容器內(nèi)裝入100mL的細(xì)胞培養(yǎng)液。整個(gè) 裝置置于溫度為l〇°C的環(huán)境中，導(dǎo)入肝臟前體模型后啟動(dòng)成形裝置開始成形。
[0061] (4)溶芯
[0062] 成形完畢后，將含明膠內(nèi)芯的肝臟前體置于約37°C的恒溫環(huán)境中，使明膠內(nèi)芯"融 化"，取出支架，即得到肝臟前體。
[0063] (5)后期培養(yǎng)
[0064] 將肝臟前體置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，細(xì)胞間建立連接并增殖生長，不含細(xì) 胞的凝膠絲周圍的內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成內(nèi)徑約為1mm的血管（神 經(jīng)），在凝膠降解后，最終形成肝臟。
[0065] 實(shí)施例3膀胱前體的制備 [0066] (1)材料制備
[0067] 提取人體脂肪干細(xì)胞（ADSC)、內(nèi)皮細(xì)胞（EC)、神經(jīng)細(xì)胞和膀胱細(xì)胞，培養(yǎng)傳代，得 到細(xì)胞材料；取lg海藻酸鈉、lg殼聚糖和lg明膠置于l〇〇mL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌 處理得到海藻酸鈉-殼聚糖-明膠水凝膠材料；制備0. 05g/ml的氯化鈣水溶液作為其交聯(lián) 齊U ;取2g葡萄糖和2g右旋糖置于100mL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到葡萄糖-右 旋糖溶液；將PLGA溶于四乙二醇中得到體積濃度為5%的溶液，滅菌處理待用；
[0068] 將上述制備的脂肪干細(xì)胞-膀胱細(xì)胞與海藻酸鈉-殼聚糖-明膠水凝膠材料混合 得到脂肪干細(xì)胞和膀胱細(xì)胞的密度均為1X 1〇6個(gè)/mL的含膀胱細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞的水凝 膠；內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞混合得到濃度均為5X 107個(gè)/mL的內(nèi)皮-脂肪干細(xì)胞懸液；神 經(jīng)細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞混合得到濃度均為5 X 107個(gè)/mL的神經(jīng)細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞懸液。
[0069] (2)內(nèi)芯制備
[0070] 根據(jù)膀胱內(nèi)腔的形狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，用三維繪圖軟件設(shè)計(jì)橢球狀結(jié)構(gòu)，用快速成形法 制作具有此內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的模具。將滅菌后的支架立入模具中，往模具中加入適量的明膠溶液， 降低溫度至10?12°c使明膠固化，形成中心帶支架的組織器官內(nèi)芯，在帶支架的肝臟前體 內(nèi)芯外涂覆水凝膠并交聯(lián)聚合形成一層不溶于培養(yǎng)液的保護(hù)膜。
[0071] ⑶成形
[0072] 將含膀胱細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞的海藻酸鈉-殼聚糖-明膠水凝膠和不含細(xì)胞的水凝 膠分別裝入第一擠壓式噴頭113和第一擠壓式噴頭114,內(nèi)皮細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞懸液和神經(jīng) 細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞懸液分別裝入第一噴灑式噴頭104和第二噴灑式噴頭105,氯化鈣交聯(lián)劑 裝入第四噴灑式噴頭115,合成高分子裝入第三噴灑式噴頭108。將帶明膠內(nèi)芯的支架安裝 在成形容器102內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連，并在成形容器內(nèi)裝入100mL的細(xì)胞培養(yǎng)液。整個(gè) 裝置置于溫度為8?10°C的環(huán)境中，在計(jì)算機(jī)中導(dǎo)入膀胱模型后啟動(dòng)成形裝置，開始成形。
[0073] (4)溶芯
[0074] 成形完畢后，將含明膠內(nèi)芯的膀胱前體置于恒溫箱中培養(yǎng)，去除內(nèi)芯，取出支架， 即得到帶內(nèi)腔的膀胱前體。
[0075] (5)后期培養(yǎng)
[0076] 將膀胱前體置于恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，細(xì)胞間建立連接并增殖生長，在 不含細(xì)胞的凝膠絲周圍的內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成血管（神經(jīng)），在凝 膠降解后，最終形成具有神經(jīng)和血管的膀胱。
[0077] 實(shí)施例4腎前體的制備
[0078] (1)材料制備
[0079] 提取人體血液干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（EC)、神經(jīng)細(xì)胞和腎細(xì)胞，培養(yǎng)傳代，得到細(xì)胞材 料；取lg海藻酸鈉和lg透明質(zhì)酸置于lOOmL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到海藻酸 鈉-透明質(zhì)酸水凝膠材料；制備〇. 〇5g/ml的氯化鈣水溶液作為其交聯(lián)劑；取4g明膠置于 lOOmL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到明膠溶液；將合成高分子PU溶于四乙二醇中 得到質(zhì)量體積濃度為5 %的合成高分子溶液，滅菌處理待用；
[0080] 將上述制備的血液干細(xì)胞-腎細(xì)胞與海藻酸鈉-透明質(zhì)酸水凝膠材料混合得到血 液干細(xì)胞和腎細(xì)胞的密度均為1X 1〇6個(gè)/mL的含腎細(xì)胞-血液干細(xì)胞的水凝膠。內(nèi)皮細(xì) 胞和血液干細(xì)胞混合得到濃度均為4X 107個(gè)/mL的內(nèi)皮細(xì)胞血液干細(xì)胞懸液。神經(jīng)細(xì)胞 和血液干細(xì)胞混合得到濃度均為4X 107個(gè)/mL的神經(jīng)細(xì)胞-血液干細(xì)胞懸液。
[0081] (2)內(nèi)芯制備
[0082] 在支架表面涂一層厚約5mm的明膠，降低溫度至10?12°C固化形成內(nèi)芯，在帶支 架的肝臟前體內(nèi)芯外涂覆水凝膠并交聯(lián)聚合形成一層不溶于培養(yǎng)液的保護(hù)膜。
[0083] (3)成形
[0084] 將含腎細(xì)胞-血液干細(xì)胞的水凝膠和不含細(xì)胞的水凝膠分別裝入第一擠壓式噴頭 113和第二擠壓式噴頭114,內(nèi)皮細(xì)胞-血液干細(xì)胞溶液和神經(jīng)細(xì)胞-血液干細(xì)胞溶液分別 裝入第一噴灑式噴頭104和第二噴灑式噴頭105,氯化鈣交聯(lián)劑/聚合液裝入第四噴灑式 噴頭115,合成高分子裝入第三噴灑式噴頭108。將帶明膠內(nèi)芯的支架安裝在成形容器102 內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連，并在成形容器內(nèi)裝入lOOmL的細(xì)胞培養(yǎng)液。整個(gè)裝置置于溫度為 8?10°C的環(huán)境中，導(dǎo)入腎模型后啟動(dòng)成形裝置，開始旋轉(zhuǎn)堆積成形。
[0085] (4)溶芯
[0086] 成形完畢后，將含明膠薄膜內(nèi)芯的腎臟前體置于恒溫箱中培養(yǎng)，使明膠薄膜內(nèi)芯 "融化"，取出支架，即得到腎臟前體。
[0087] (5)后期培養(yǎng)
[0088] 將腎前體置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，細(xì)胞間建立連接并增殖生長，在不含細(xì) 胞的凝膠絲周圍的內(nèi)皮（神經(jīng)）細(xì)胞和血液干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成內(nèi)徑約為1mm的血管（神 經(jīng)），在凝膠降解后，最終形成具有血管和神經(jīng)的腎臟。
[0089] 實(shí)施例5人工乳房的制備
[0090] (1)材料制備
[0091] 提取人體脂肪干細(xì)胞（ADSC)、內(nèi)皮細(xì)胞（EC)、神經(jīng)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)傳代，得 到細(xì)胞材料；取lg海藻酸鈉和2g明膠置于100mL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到海 藻酸鈉-明膠水凝膠材料；制備〇. 〇5g/ml的氯化鈣水溶液作為其交聯(lián)劑/聚合；取2g明膠 置于100mL培養(yǎng)液中使其完全溶解，滅菌處理得到明膠溶液；將合成高分子PU溶于四乙二 醇中得到質(zhì)量體積濃度為5%的合成高分子溶液，滅菌處理待用；
[0092] 將上述制備的脂肪干細(xì)胞與海藻酸鈉-明膠水凝膠材料混合得到脂肪干細(xì)胞密度 均為1 X 106個(gè)/mL的含脂肪干細(xì)胞的水凝膠。其中加入1 μ Μ胰島素，1 μ Μ地塞米松，50u/ mL抑肽酶和0. 5mmol/L異丁基甲基化黃嘌呤衍生物。神經(jīng)細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞混合得到濃度 均為3X 108個(gè)/mL的神經(jīng)細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞懸液。脂肪干細(xì)胞懸浮液中加入50ng/mL內(nèi) 皮生長因子（VEGF)、3ng/mL TGF - β 1生長因子、10ng/mL成纖維細(xì)胞生長因子（b - FGF)。
[0093] (2)內(nèi)芯制備
[0094] 在支架表面涂一層厚約5mm的明膠，降低溫度至10?12°C固化形成內(nèi)芯，在帶支 架的肝臟前體內(nèi)芯外涂覆水凝膠并交聯(lián)聚合形成一層不溶于培養(yǎng)液的保護(hù)膜。
[0095] (3)成形
[0096] 將含脂肪干細(xì)胞、胰島素、地塞米松、抑肽酶和異丁基甲基化黃嘌呤衍生物的海藻 酸鈉-明膠水凝膠和不含細(xì)胞的水凝膠分別裝入第一擠壓式噴頭113和第二擠壓式噴頭 114,內(nèi)皮細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞懸液和神經(jīng)細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞懸液分別裝入第一噴灑式噴頭 104和第二噴灑式噴頭105,氯化鈣交聯(lián)劑裝入第四噴灑式噴頭115,合成高分子裝入第三 噴灑式噴頭108。將帶明膠內(nèi)芯的支架安裝在成形容器102內(nèi)并與電機(jī)輸出軸相連，并在成 形容器內(nèi)裝入l〇〇mL的細(xì)胞培養(yǎng)液。整個(gè)裝置置于溫度為10?12°C的環(huán)境中，導(dǎo)入乳房模 型后啟動(dòng)成形裝置，開始成形。
[0097] (4)溶芯
[0098] 成形完畢后，將含明膠薄膜內(nèi)芯的乳房前體置于恒溫箱中培養(yǎng)，使明膠內(nèi)芯"融 化"，取出支架，即得到乳房前體。
[0099] (5)后期培養(yǎng)
[0100] 培養(yǎng)過程中，細(xì)胞間建立連接并增殖生長，在不含細(xì)胞的凝膠絲周圍的內(nèi)皮（神 經(jīng)）細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成內(nèi)徑約為1_的血管（神經(jīng)），在凝膠降解后，最終形 成具有一定功能的乳房。
【權(quán)利要求】
1. 利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的專用設(shè)備，包括支撐裝置、多噴頭組件、運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)、 成形裝置以及控制系統(tǒng)；所述支撐裝置包括支撐腿和底板（101);所述運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)采用導(dǎo)軌-滑塊機(jī)構(gòu)，包括X向?qū)к墸?21)、X向滑塊（120)、Y向?qū)к墸?07)、第一 Y向滑塊（111)、第二 Υ向滑塊（112)、Ζ向?qū)к墸?18)、Ζ向滑塊（106);所述X向?qū)к墸?21)設(shè)在底板（101)上， Ζ向?qū)к墸?18)固接在X向滑塊（120)上，Υ向?qū)к墸?07)固接在Ζ向滑塊（106)上；其特 征在于：所述多噴頭組件至少含有六個(gè)噴頭，分兩組分別安裝在第一 Υ向滑塊和第二Υ向滑 塊上；所述成形裝置包括成形容器（102)、支架（103)和電機(jī)（119)，成形容器（102)安裝在 底板（101)上并處于噴頭組件的下方，支架（103)安裝在成形容器（102)內(nèi)并與電機(jī)（119) 輸出軸相連。
2. 如權(quán)利要求1所述的利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的專用設(shè)備，其特征在于：所述 支架為兩端呈圓柱狀、中間為棱柱狀結(jié)構(gòu)。
3. 如權(quán)利要求1所述的利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的專用設(shè)備，其特征在于，所述 支架的材料為不銹鋼或者鈦合金。
4. 如權(quán)利要求1所述的利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的專用設(shè)備，其特征在于：所述 第一 Υ向滑塊（111)和第二Υ向滑塊（112)上分別開有與Υ向?qū)к壠叫械牡谝恍?dǎo)軌（110) 和第二小導(dǎo)軌（117)，第一小導(dǎo)軌和第二小導(dǎo)軌上分別安裝第一小滑塊（109)和第二小滑 塊（116)，第一小滑塊和第二小滑塊上開有固定噴頭的孔。
5. 如權(quán)利要求1所述的利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的專用設(shè)備，其特征在于：所述 多噴頭組件包括至少兩個(gè)擠壓式噴頭和四個(gè)噴灑式噴頭，兩個(gè)擠壓式噴頭的噴嘴內(nèi)徑分別 為200 μ m?1mm和50 μ m?500 μ m，噴灑式噴頭噴嘴的網(wǎng)孔直徑為50 μ m?100 μ m。
6. -種利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法，其特征在于該方法包括以下步驟： 1) 材料制備： 制備0. 2?20% (w/v)水凝膠溶液、1?10% (w/v)交聯(lián)劑/聚合液、0. 1?10% (w/ v)合成高分子溶液、0. 2?10% (w/v)明膠溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液；分離或者誘導(dǎo)種子細(xì)胞，種 子細(xì)胞密度為1X 1〇3?1X 1〇6個(gè)/mL，將種子細(xì)胞與水凝膠溶液按1?9 :9?1體積比混 合制成含種子細(xì)胞的水凝膠溶液；分離或者誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，內(nèi) 皮細(xì)胞懸液和神經(jīng)細(xì)胞懸液密度均為1X 1〇5?1X 1〇8個(gè)/mL ; 2) 內(nèi)芯制備 當(dāng)制備具有內(nèi)腔的組織器官時(shí)，根據(jù)所要制備組織器官的內(nèi)腔形狀，用三維繪圖軟件 設(shè)計(jì)其三維模型，用快速成形法制作具有此內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的模具，當(dāng)成形實(shí)體的組織器官時(shí)，模 具是直徑厚8?10mm的圓柱；將支架（103)放入模具中央，往模具中加入明膠溶液后降低 溫度至8?10°C使明膠固化，打開模具得到中心帶支架（103)的組織器官內(nèi)芯（401)，在帶 支架的組織器官內(nèi)芯（401)外涂覆一層水凝膠溶液，并用交聯(lián)劑/聚合液交聯(lián)/聚合； 3) 成形 將含種子細(xì)胞的水凝膠溶液和不含細(xì)胞的水凝膠溶液分別裝入第一擠壓式噴頭（113) 和第二擠壓式噴頭（114)中，交聯(lián)劑/聚合液、神經(jīng)細(xì)胞懸液、內(nèi)皮細(xì)胞懸液以及合成高分 子溶液分別裝入第四噴灑式噴頭（115)、第二噴灑式噴頭（105)、第一噴灑式噴頭（104)和 第三噴灑式噴頭（108)中，在成形容器內(nèi)裝入細(xì)胞培養(yǎng)液（405)，將支架（103)安裝在成形 容器（102)內(nèi)并與電機(jī)（119)輸出軸相連，將待成形組織器官的模型導(dǎo)入控制系統(tǒng)后，啟動(dòng) 成形設(shè)備，開始堆積成形；在成形過程中，支架（103)繞Y負(fù)向做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，噴頭做平移運(yùn) 動(dòng)，當(dāng)成形組織器官的主體部分時(shí)，第一擠壓式噴頭（113)運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出含種子細(xì) 胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)裝有交聯(lián)劑/聚合液的第四噴灑式噴頭（115)運(yùn)動(dòng)到第一 擠壓式噴頭（113)的正后方噴灑出交聯(lián)劑/聚合液對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)/聚合；當(dāng)成形血管時(shí)，第 二擠壓式噴頭（114)運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出不含細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同時(shí)第四噴灑 式噴頭（115)運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭（114)正后方，第一噴灑式噴頭（104)和第三噴灑式 噴頭（108)分別運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭（114)正前方，在旋轉(zhuǎn)的內(nèi)芯帶動(dòng)下，新纏繞的水凝 膠依次運(yùn)動(dòng)至第四噴灑式噴頭（115)下進(jìn)行交聯(lián)/聚合，經(jīng)過培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，至第一噴灑 式噴頭（104)、第三噴灑式噴頭（108)下進(jìn)行噴灑內(nèi)皮細(xì)胞和復(fù)合合成高分子溶液；當(dāng)成形 神經(jīng)時(shí)，第二擠壓式噴頭（114)運(yùn)動(dòng)到指定位置擠出不含細(xì)胞的水凝膠纏繞在內(nèi)芯上，同 時(shí)第四噴灑式噴頭（115)運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭（114)正后方，第二噴灑式噴頭（105)和 第三噴灑式噴頭（108)分別運(yùn)動(dòng)到第二擠壓式噴頭（114)正前方，在旋轉(zhuǎn)的內(nèi)芯帶動(dòng)下，新 纏繞的水凝膠依次運(yùn)動(dòng)至第四噴灑式噴頭（115)下進(jìn)行交聯(lián)/聚合，經(jīng)過培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌， 至第二噴灑式噴頭（105)、第三噴灑式噴頭（108)下進(jìn)行噴灑神經(jīng)細(xì)胞和復(fù)合合成高分子； 如此反復(fù)纏繞堆積直至形成含內(nèi)芯的組織器官前體； 4)后續(xù)處理 將含內(nèi)芯的組織器官前體置于恒溫箱中培養(yǎng)，溶除內(nèi)芯后取出支架，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí) 間后形成回轉(zhuǎn)狀組織器官，神經(jīng)和血管（502)以螺旋狀貫穿其中。
7.如權(quán)利要求6所述的一種利用旋轉(zhuǎn)堆積法制備組織器官的方法，其特征在于：所述 的種子細(xì)胞為具有分化能力的干細(xì)胞或具有生理活性的成體細(xì)胞，所述干細(xì)胞為脂肪干細(xì) 胞、胚胎干細(xì)胞、血液干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞或誘導(dǎo)型多功能干細(xì)胞，所述成體細(xì)胞為脂肪細(xì) 胞、肝細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、心肌細(xì)胞或腎細(xì)胞；所述水凝膠為復(fù)合了明膠、膠原、基質(zhì) 膠、卡拉膠、殼聚糖、瓊脂、透明質(zhì)酸、基質(zhì)膠、彈性蛋白中層粘素中一種或多種的海藻酸鈉 或纖維蛋白原溶液；所述的水凝膠中復(fù)合各種細(xì)胞凍存劑、細(xì)胞生長因子、藥物、抗凝血?jiǎng)?細(xì)胞凍存劑為二甲基亞砜、甘油、右旋糖中的一種或多種復(fù)合物；所述的細(xì)胞生長因子為血 管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子、人血小板衍化生長因子、轉(zhuǎn) 化生長因子β 1中的一種或多種復(fù)合物；所述的藥物為抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物為黃芪 多糖、順式二氨基二氯絡(luò)鉬、絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、抗過敏藥物、抗生素和病毒疫苗中的一 種或多種復(fù)合物；所述的抗凝血因子為肝素和紫杉醇中的一種或兩種復(fù)合物；所述合成高 分子溶液的溶質(zhì)為聚氨酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚酯 和聚羥基酸酯中的一種或者多種，溶劑為四乙二醇或1，4-二氧六環(huán)。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK104207859SQ201410473055
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】王小紅, 周新偉 申請(qǐng)人:清華大學(xué)