一種免疫佐劑及含有該免疫佐劑的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種免疫佐劑,所述免疫佐劑由陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(DDA)、聚肌胞(PolyI:C)和膽固醇組成。本發(fā)明通過篩選可增強佐劑穩(wěn)定性的試劑,并兼顧疫苗免疫活性及臨床應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)膽固醇聯(lián)合DDA、PolyI:C構(gòu)建新型疫苗佐劑DDA+PolyI:C+膽固醇(簡稱DPC),增加了佐劑DDA和PolyI:C的穩(wěn)定性,且粒徑小于DDA+PolyI:C(簡稱DP),易于后期研發(fā)和生產(chǎn)的進行;將其與融合蛋白LT70進行聯(lián)合構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗LT70-DPC,發(fā)現(xiàn)整體保護效果強于BCG和LT70-DP。
【專利說明】一種免疫佐劑及含有該免疫佐劑的疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種免疫佐劑及含有該免疫佐劑的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 鋁佐劑作為唯一一個注冊佐劑在世界范圍廣泛應(yīng)用,其主要介導(dǎo)體液免疫,對于 以細胞免疫為主的疾病卻效果不佳。結(jié)核分枝桿菌和人類免疫缺陷病毒的合并感染現(xiàn)已成 為世界公共衛(wèi)生問題,兩種疾病都是以細胞免疫為特點,目前缺乏理想的針對細胞免疫為 主的佐劑。近年來,盡管佐劑研究有了很大的進步,然而出于安全性方面的考慮,新型疫苗 佐劑獲批品種寥寥無幾。安全性好同時能有效引發(fā)體液免疫與細胞免疫的新型佐劑開發(fā)異 常迫切。
[0003] 陽離子脂質(zhì)體作為疫苗佐劑被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過40年,不僅具有抗原提呈、保護抗原 防止其在體內(nèi)降解的作用,而且能誘導(dǎo)樹突狀細胞成熟,增強免疫反應(yīng)。其表面正電荷是延 長疫苗在注射部位停留、增加抗原提呈、延長刺激體內(nèi)細胞免疫時間的重要因素。DDA是一 種陽離子脂質(zhì)體季銨鹽,其N原子上連有兩個甲基和兩個十八烷基,當溫度高于其膠液相 變溫度時,長碳氫鏈與具有離子性質(zhì)的氨基可以使其自組裝成脂質(zhì)體。DDA主要通過靜電作 用與細胞表面直接接觸,將抗原遞送給細胞,然后誘導(dǎo)活化細胞將抗原吸收,增加脾臟DC、 巨噬細胞和B細胞對抗原的吸收,從而顯著增加效應(yīng)細胞釋放IFN- γ。
[0004] PolyI :c是合成的雙鏈RNA,能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的⑶8+T細胞,可被內(nèi)含體的 TLR3受體識別。本 申請人:在前期實驗中,將DDA和PolyI: C聯(lián)合應(yīng)用作為結(jié)核亞單位疫苗 佐劑使用,在加強BCG免疫后,能有效誘導(dǎo)小鼠特異性的細胞免疫應(yīng)答,且能有效的減輕結(jié) 核分枝桿菌感染造成的病理損傷(專利號:201110199072X)。然而,該佐劑穩(wěn)定性較差,易 于發(fā)生絮凝現(xiàn)象,不利于最終投入生產(chǎn)和實際應(yīng)用。為此,我們在前期佐劑DDA和PolyI: C 的基礎(chǔ)上,研究更加穩(wěn)定和有效的新型免疫佐劑,以增強疫苗的保護效果,適于后期的研發(fā) 和生產(chǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明提供了一種免疫佐劑,能夠有效誘導(dǎo)細 胞和體液免疫應(yīng)答,從而作為細胞免疫佐劑和體液免疫佐劑使用;同時,具有良好的穩(wěn)定性 和有效性,適用于后期的研發(fā)和生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明提供的一種免疫佐劑,由陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(DDA)、聚肌胞 (Polyl :C)和膽固醇組成。
[0007] 優(yōu)選地,所述免疫佐劑中二甲基三十六烷基銨與膽固醇的摩爾比為2:1。
[0008] 本發(fā)明還提供陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(DDA)、聚肌胞(Polyl :C)和膽 固醇在制備免疫佐劑中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述結(jié)核桿菌亞單位疫苗佐劑在制備免疫治療藥物 及免疫疫苗中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是提供免疫疫苗的制備方法,步驟如下:
[0011] (1)將抗原和Polyl: C分別用PBS緩沖液溶解;
[0012] (2)將DDA和膽固醇用無水乙醇溶解后蒸發(fā),再用PBS緩沖液溶解,形成混懸液;
[0013] (3)將步驟⑴中的抗原溶液和Polyl:C溶液混勻,在混合液中逐滴加入步驟(2) 制備得到的混懸液,充分乳化呈均一的乳油狀,得到亞單位疫苗。
[0014] 優(yōu)選地,所述抗原為結(jié)核桿菌抗原。
[0015] 進一步地,步驟如下:
[0016] (1)將抗原用PBS緩沖液溶解至0· 2mg/ml ;
[0017] (2)將 Polyl: C 用 PBS 緩沖液溶解至 lmg/ml ;
[0018] (3)將DDA和膽固醇用無水乙醇溶解后蒸發(fā),加 PBS緩沖液溶解,溶解后DDA的濃 度為2. 5mg/ml,膽固醇的濃度為0· 766mg/ml ;
[0019] (4)取Polyl: C溶液與等體積抗原溶液充分混勻;
[0020] (5)在混合溶液中逐滴加入DDA和膽固醇混懸液,加入體積為Polyl: C溶液與抗原 溶液體積之和;充分乳化,呈均一的乳油狀即得到免疫疫苗。
[0021] 其中,因為DDA的分子量為630. 98,膽固醇的分子量為386. 67,所以兩者的摩爾比 為 2:1。
[0022] 本發(fā)明的第五個目的是提高應(yīng)用上述方法制備得到的免疫疫苗。
[0023] 本 申請人:研究發(fā)現(xiàn):(I)DDA為陽離子脂質(zhì)體,在溫度加熱到凝膠液體高于其相變 溫度時自組裝成脂質(zhì)體,絡(luò)合陽離子凝膠狀態(tài)的脂質(zhì)體與帶相反電荷的寡核苷酸通常導(dǎo)致 高度不穩(wěn)定,易產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象。(2)膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用,被稱為脂質(zhì)體"流動 性緩沖劑",在脂質(zhì)體中加入可起到:①增加脂質(zhì)體中藥物的包封率,提高脂質(zhì)體的抗原提 呈能力。②膽固醇可聯(lián)合陽離子脂質(zhì)體DDA的末端親水基團,從而改善其穩(wěn)定性。③膽固 醇中醇羥基可中和DDA中季銨基的毒性,從而增加陽離子脂質(zhì)體的安全性。
[0024] 本發(fā)明通過篩選可增強佐劑穩(wěn)定性的試劑,并兼顧疫苗免疫活性及臨床應(yīng)用,發(fā) 現(xiàn)膽固醇聯(lián)合DDA、Polyl :C構(gòu)建新型疫苗佐劑DDA+Polyl :C+膽固醇(簡稱DPC),增加了 佐劑DDA和PolyI = C的穩(wěn)定性,且粒徑小于DDA+Polyl :C (簡稱DP),易于后期研發(fā)和生產(chǎn) 的進行;利用乳化-溶劑揮發(fā)法,將DDA和膽固醇制成微米級陽離子脂質(zhì)體,在電鏡下顯示 粒徑大小均一,外形整圓,為單室脂質(zhì)體。將其與抗原(融合蛋白LT70)進行聯(lián)合構(gòu)建形成 免疫疫苗LT70-DPC,通過C57BL/6小鼠模型分別進行免疫學評價及保護效率評價,檢測新 型佐劑DPC聯(lián)合抗原(融合蛋白LT70)的保護效果。實驗結(jié)果顯示新型佐劑DPC聯(lián)合抗原 (融合蛋白LT70)可以有效誘導(dǎo)小鼠的結(jié)核抗原特異性的細胞和體液免疫應(yīng)答;在動物保 護效率實驗中,保護效果和LT70-DP相當,強于BCG ;在小鼠病理損傷面積統(tǒng)計中,相比于對 照組、BCG和沒有改進的佐劑DDA+Polyl :C組,明顯降低了小鼠肺組織病理損傷;整體保護 效果強于BCG和LT70-DP。綜上,本專利申請的新型疫苗佐劑DPC能夠有效誘導(dǎo)小鼠的細胞 和體液免疫應(yīng)答,有望作為免疫佐劑使用,并有望成為具有臨床應(yīng)用價值的有效的結(jié)核亞 單位疫苗佐劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解,并且構(gòu)成說明書的一部分,與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明,并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0026] 圖1為佐劑DDA和PolyI = C添加不同輔料的Zeta電位結(jié)果;
[0027] 圖2為抗原、DDA和膽固醇在脂質(zhì)體中的排列方式;
[0028] 圖3為透射電鏡下觀測佐劑DDA、PolyI :C和膽固醇脂質(zhì)體結(jié)果;
[0029] 圖4為結(jié)核亞單位疫苗LT70/DPC的細胞免疫原性檢測結(jié)果;*p〈0. 05vs PBS, BCG ;
[0030] 圖5為結(jié)核亞單位疫苗LT70/DPC的體液免疫原性檢測結(jié)果;其中,a為小鼠血清 結(jié)核抗原特異性抗體IgGl水平,b為小鼠血清結(jié)核抗原特異性抗體IgG2c水平。*p〈0. 05vs PBS, BCG ;
[0031] 圖6為結(jié)核亞單位疫苗LT70/DPC的保護效果評價;#ρ〈0· Olvs PBS ;
[0032] 圖7為結(jié)核亞單位疫苗免疫和毒株攻擊后小鼠肺組織病理反應(yīng);
[0033] 圖8為結(jié)核亞單位疫苗免疫和毒株攻擊后小鼠肺臟病理損傷程度。
【具體實施方式】
[0034] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0035] 試劑和材料:
[0036] PolyI = C購自開平牽牛生化制藥有限公司;
[0037] 陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六燒基銨(dimo-thylidioctyl ammonium bromide, DDA)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;
[0038] 膽固醇購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。
[0039] 抗原為結(jié)核桿菌抗原融合蛋白LT70,其全稱為ESAT6-Ag85B-MPT6419Q_ 198-Mtb8. 4-Rv2626c,制備方法具體如下(也可參見專利申請?zhí)枮?01410390880. 8):
[0040] 1.融合蛋白的構(gòu)建和純化
[0041] I. 1構(gòu)建融合蛋白LT70表達質(zhì)粒pET30a (+) -LT70
[0042] (1)構(gòu)建重組基因載體 PET3Oa (+) -LT69 (ESAT6-Ag85B-MPT6419Q_ 198-Mtb8· 4-Hsp X)。
[0043] A,pET30a(+)-EA(ESAT6_Ag85B)的構(gòu)建:
[0044] 以臨床分枝桿菌菌液為模板,PCR擴增ESAT6,Ag85B相應(yīng)基因,并將其克隆構(gòu)建至 質(zhì)粒pET30a中。
[0045]
【權(quán)利要求】
1. 一種免疫佐劑,其特征在于:所述免疫佐劑由陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨 (DDA)、聚肌胞(Polyl :C)和膽固醇組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫佐劑,其特征在于:所述免疫佐劑中二甲基三十六烷基 銨與膽固醇的摩爾比為2:1。
3. 陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(DDA)、聚肌胞(Polyl :C)和膽固醇在制備免疫 佐劑中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1或2所述的免疫佐劑在制備免疫治療藥物及免疫疫苗中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求4所述的免疫疫苗的制備方法,其特征在于:步驟如下: (1) 將抗原和Polyl: C分別用PBS緩沖液溶解; (2) 將DDA和膽固醇用無水乙醇溶解后蒸發(fā),再用PBS緩沖液溶解,形成混懸液; (3) 將步驟(1)中的抗原溶液和Polyl: C溶液混勻,在混合液中逐滴加入步驟(2)制備 得到的混懸液,充分乳化呈均一的乳油狀,得到亞單位疫苗。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:所述抗原為結(jié)核桿菌抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法,其特征在于:步驟如下: (1) 將抗原用PBS緩沖液溶解至0. 2mg/ml ; (2) 將Polyl :C用PBS緩沖液溶解至lmg/ml ; (3) 將DDA和膽固醇用無水乙醇溶解后蒸發(fā),加 PBS緩沖液溶解,溶解后DDA的濃度為 2. 5mg/ml,膽固醇的濃度為0· 766mg/ml ; (4) 取Polyl :C溶液與等體積抗原溶液充分混勻; (5) 在混合溶液中逐滴加入DDA和膽固醇混懸液,加入體積為Polyl: C溶液與抗原溶液 體積之和;充分乳化,呈均一的乳油狀即得到免疫疫苗。
8. 應(yīng)用權(quán)利要求5-7任一所述的方法制備得到的免疫疫苗。
【文檔編號】A61K39/04GK104225591SQ201410470358
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】祝秉東, 劉勛, 汪月, 何珊珊, 牛紅霞, 馬瀾, 何娟娟, 陸小鈴, 于紅娟 申請人:蘭州大學