一種羊膜生物制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種羊膜生物制劑及其制備方法，該羊膜生物制劑采用人及動(dòng)物脫細(xì)胞羊膜上覆蓋富血小板因子血漿制劑，經(jīng)凍干輻照后低溫冷藏保存，用于臨床皮膚損傷的修復(fù)治療。該羊膜生物制劑能顯著提高創(chuàng)傷的愈合時(shí)間，減輕創(chuàng)面的疤痕形成，是一種極有臨床應(yīng)用前景的可產(chǎn)業(yè)化的生物制劑。
【專利說(shuō)明】一種羊膜生物制劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)，具體涉及一種羊膜生物制劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 脫細(xì)胞羊膜作為一種醫(yī)用生物材料已被廣泛應(yīng)用，但是在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使 用脫細(xì)胞羊膜治療皮膚損傷(如機(jī)械性外傷、潰瘍)，在炎癥反應(yīng)期可加速創(chuàng)面愈合，但是與 對(duì)照組相比，最終的愈合時(shí)間沒(méi)有顯著的提高。
[0003] 申請(qǐng)?zhí)枮?01310508091. 5的專利公開(kāi)了一種生物羊膜及其制備方法，該生物羊 膜采用了膠原復(fù)合膜，但是膠原具有一定的免疫原性，容易引起機(jī)體的過(guò)敏反應(yīng)，副作用明 顯〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種羊膜生物制劑，解決 現(xiàn)有的羊膜制劑易引起過(guò)敏反應(yīng)及難以顯著縮短創(chuàng)傷愈合時(shí)間的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種羊膜生物制劑的制備方法。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種羊膜生物制劑，由脫細(xì)胞羊膜和富血小板 因子血漿制劑組合制成。
[0007] 上述羊膜生物制劑的制備方法，包括： 分別制備脫細(xì)胞羊膜和富血小板因子血漿制劑； 將脫細(xì)胞羊膜的光滑面向下平鋪于0.22?0.45 μ m聚偏氟乙烯膜上，再將富血小 板因子血漿制劑覆蓋在脫細(xì)胞羊膜的粗糙面上，在-6(T-40°C下預(yù)凍2?8小時(shí)，然后 在-7(T-80°C下冷阱冷凍干燥24?30小時(shí)，制得羊膜生物制劑，將制得的凍千羊膜生物制 齊U，按臨床需求，裁剪為不同規(guī)格，lcmX lCm?5CmX 10cm，分裝密封，環(huán)氧乙烷滅菌，置于 4°C，冷藏保存?zhèn)溆谩?br> [0008] 優(yōu)選地，脫細(xì)胞羊膜與富血小板因子血漿制劑的比例為每平方米脫細(xì)胞羊膜上覆 蓋0· 2?0· 5ml富血小板因子血漿制劑。
[0009] 優(yōu)選地，脫細(xì)胞羊膜是通過(guò)以下方法制備得到： 1) 用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液清洗胎盤(pán)去除血液成分，將羊膜從胎盤(pán)絨毛膜上分離，再用PBS 沖洗3次，然后浸泡于l%Triton-100溶液中18?24小時(shí)； 2) 浸泡步驟1)制得的羊膜于〇. 25%胰蛋白酶中，于37°C下恒溫酶解21小時(shí)； 3) 浸泡步驟2)制得的羊膜于1?2升PBS中，在8?12°C，轉(zhuǎn)速為18(T200 rpm下震搖 18~24小時(shí)，制得脫細(xì)胞羊膜。
[0010] 優(yōu)選地，富血小板因子血漿制劑的制備方法為： 參照專利申請(qǐng)?zhí)枮?01310042567. 0的專利申請(qǐng)文件所公開(kāi)的一種自體富血小板因子 血漿PFRP制劑的制備方法來(lái)制備富血小板因子血漿制劑，具體為： 1)采用受體或供體全血，利用離心加凍融方式制備得到受體或供體富血小板因子血漿 PFRP ； 2)將富血小板因子血漿PFRP與生物支架按照體積比為1:3?3:1混合，制得富血小板因 子血漿制劑；生物支架為注射級(jí)透明質(zhì)酸鈉。
[0011] 本發(fā)明提供的制備方法制備的羊膜生物制劑具有以下有益效果： 1)將脫細(xì)胞羊膜和富血小板因子血漿制劑聯(lián)合制得的該羊膜生物制劑能顯著提高創(chuàng) 傷的愈合時(shí)間，減輕創(chuàng)面的疤痕形成，是一種極有臨床應(yīng)用前景的可產(chǎn)業(yè)化的生物制劑。
[0012] 2)本發(fā)明中的富血小板因子血漿制劑，其生物支架采用注射級(jí)別的透明質(zhì)酸鈉， 無(wú)免疫原性，具有緩釋和生物支架功能；并且該富血小板因子血漿中含有多種生長(zhǎng)因子，除 bFGF和EGF外，還含有VEGF、PDGF、IGF等生長(zhǎng)因子，是一個(gè)天然組合的組織細(xì)胞修復(fù)制劑， 能有效地刺激機(jī)體的內(nèi)環(huán)境發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的脫細(xì)胞羊膜的形態(tài)圖。
[0014] 其中，圖A為顯微鏡下觀察的脫細(xì)胞羊膜組織學(xué)圖片，經(jīng)HE染色后的脫細(xì)胞羊膜， 可以看出該羊膜中含有大量膠原物質(zhì)，無(wú)細(xì)胞殘留； 圖B為脫細(xì)胞羊膜經(jīng)包埋切片后的基質(zhì)結(jié)構(gòu)照片，可以看出，該羊膜的上皮細(xì)胞層、成 纖維細(xì)胞層均被除去，僅保留了基膜層和致密層； 圖C為掃描電鏡下觀察的脫細(xì)胞羊膜的一面的結(jié)構(gòu)照片，可以看出，該脫細(xì)胞羊膜的 一面為縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，不含壞死組織，基質(zhì)成分完整，三維結(jié)構(gòu)清晰； 圖D為掃面電鏡下觀察的脫細(xì)胞羊膜的另一面的結(jié)構(gòu)照片，可以看出，該脫細(xì)胞羊膜 的另一面為致密纖維結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞殘留。
[0015] 圖2為采用正常培養(yǎng)基浸出液、25%、50%、100%三種濃度的本發(fā)明實(shí)施例丨制備脫 細(xì)胞羊膜浸出液培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)表。
[0016]圖3為采用正常培養(yǎng)基浸出液、PE膜浸出液、三批次本發(fā)明實(shí)施例丨、實(shí)施例2及 實(shí)施例3制備的脫細(xì)胞羊膜的1〇〇%浸出液及％苯酚培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)表 [0017] 圖4-A為燙傷潰瘍皮膚損傷模型創(chuàng)面愈合率圖； ° 圖4-B為燙傷潰瘍皮膚損傷模型創(chuàng)面愈合周期測(cè)定圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018]為使本申請(qǐng)的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例 申請(qǐng)作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明。 '
[0019] 實(shí)施例1 一種羊膜生物制劑，由以下配比的原料組成： 脫細(xì)胞羊膜lcm2 :富血小板因子血楽制劑〇. 2ml ; 上述羊膜生物制劑是通過(guò)以下制備得到： 1、制備脫細(xì)胞羊膜： ^健康人及動(dòng)物胎膜，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS洗凈胎膜表面的血跡，將羊 月旲剝罔后再用F^BS沖洗3次，用l%Triton-100浸泡24小時(shí)； 用PBS反復(fù)沖洗后，滴加〇. 25%胰蛋白酶(含有〇. 〇1%肋TA)浸潤(rùn)羊膜，并于37。〇恒溫 孵化箱中酶解4小時(shí)； 再用廣2升PBS浸泡羊膜，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱以10?，轉(zhuǎn)速200 rpm充分震搖24小時(shí)， 制得脫細(xì)胞羊膜，參見(jiàn)圖1和圖2,圖1為該實(shí)施例制備的脫細(xì)胞羊膜的形態(tài)圖；圖2為采用 正常培養(yǎng)基浸出液、25%、 5〇%、100%三種濃度的該實(shí)施例制備的脫細(xì)胞羊膜浸出液培養(yǎng)了2 小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)表；從該毒性評(píng)價(jià)表中可以看出三種濃度的脫細(xì)胞羊膜浸出液均無(wú) 細(xì)胞毒性。
[0020] 2、制備富血小板因子血漿制劑：該富血小板因子血漿的制備過(guò)程參照申請(qǐng)?zhí)枮?201310042567· 0的專利中所公開(kāi)的內(nèi)容，即 采用受體或供體全血，利用離心加凍融方式制備得到受/供體富血小板因子血漿 PFRP ； 將富血小板因子血漿PFRP與生物支架按照體積比為1:2混合，制得富血小板因子血漿 制劑；生物支架采用注射級(jí)別的透明質(zhì)酸鈉。
[0021] 3、制備羊膜生物制劑 將脫細(xì)胞羊膜的光滑面向下平鋪于0. 45 μ m聚偏氟乙烯膜上，該脫細(xì)胞羊膜的粗糙面 上覆蓋富血小板因子血漿制劑，在-40?預(yù)凍8小時(shí)，_70°C下冷阱冷凍干燥24小時(shí)，制得 羊膜生物制劑；根據(jù)臨床需求，裁剪為2cmX 3cm，分裝密封，環(huán)氧乙烷滅菌，置于4?下，冷 藏保存?zhèn)溆谩?br> [0022] 參見(jiàn)圖4-A和圖4-B，圖4-A為燙傷潰瘍皮膚損傷模型創(chuàng)面愈合率圖；圖4-B為燙 傷潰瘍皮膚損傷模型創(chuàng)面愈合周期測(cè)定圖。
[0023] 從上圖中可以看出，單用脫細(xì)胞羊膜在炎性反應(yīng)期與對(duì)照組相比，創(chuàng)面愈合率有 所改善，但最終的愈合周期，與對(duì)照組相比，沒(méi)有明顯的提高；采用該實(shí)施例制備的羊膜生 物制劑治療潰瘍損傷，與對(duì)照組相比無(wú)論是創(chuàng)面愈合率還是創(chuàng)面愈合周期，都得到顯著的 改善。
[0024] 實(shí)施例2 一種羊膜生物制劑，由以下配比的原料組成： 脫細(xì)胞羊膜lcm2 :富血小板因子血漿制劑0. 3ml ; 上述羊膜生物制劑是通過(guò)以下制備得到： 1、制備脫細(xì)胞羊膜： 取健康人及動(dòng)物羊膜，用PBS沖洗3次，再用l%Triton-100浸泡18小時(shí)； 用PBS反復(fù)沖洗后，滴加0· 25%胰蛋白酶(含有〇· 01% EDTA)浸潤(rùn)羊膜，并于37°C恒溫 孵化箱中酶解2小時(shí)； 再用1?2升PBS浸泡羊膜，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱以12°C，轉(zhuǎn)速I(mǎi)SO rpm充分震搖1S小時(shí)， 制得脫細(xì)胞羊膜。
[0025] 2、制備富血小板因子血漿制劑：該富血小板因子血漿的制備過(guò)程參照申請(qǐng)?zhí)枮?201310042567. 0的專利中所公開(kāi)的內(nèi)容，即 采用受/供體全血，利用離心加凍融方式制備得到受/供體富血小板因子血漿PFRP ; 將富血小板因子血漿PFRP與生物支架按照體積比為1:1混合，制得富血小板因子血漿 制劑；生物支架采用注射級(jí)別的透明質(zhì)酸鈉。
[0026] 3、制備羊膜生物制劑 將脫細(xì)胞羊膜的光滑面向下平鋪于〇· 22 μ m聚偏氟乙烯膜上，并于該脫細(xì)胞羊膜的粗 糙面上覆蓋富血小板因子血漿制劑，在-60Γ預(yù)凍2小時(shí)，-75?下冷阱冷凍干燥30小時(shí)； 根據(jù)臨床需求，裁剪為不同規(guī)格，5cmX 10cm，分裝密封，環(huán)氧乙烷滅菌，置于4Γ下，冷 藏保存?zhèn)溆谩?實(shí)施例3 一種羊膜生物制劑，由以下配比的原料組成： 脫細(xì)胞羊膜lcm2 :富血小板因子血漿制劑0. 5ml ; 上述羊膜生物制劑是通過(guò)以下制備得到： 1、制備脫細(xì)胞羊膜： 用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液PBS洗凈胎膜表面的血跡，將羊膜自絨毛膜剝離后再用PBS沖洗 3次，用l%Triton-100浸泡20小時(shí)； 用PBS反復(fù)沖洗后，滴加〇· 25%胰蛋白酶(含有0· 01% EDTA)浸潤(rùn)羊膜，并于37Γ恒溫 孵化箱中酶解3小時(shí)； 再用廣2升PBS浸泡羊膜，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱以8°C,轉(zhuǎn)速190 rpm充分震搖20小時(shí)， 制得脫細(xì)胞羊膜。
[0027] 2、制備富血小板因子血漿制劑：該富血小板因子血漿的制備過(guò)程參照申請(qǐng)?zhí)枮?2〇1310042567. 0的專利中所公開(kāi)的內(nèi)容，gp 采用受體或供體全血，利用離心加凍融方式制備得到受體或供體富血小板因子血漿 PFRP ； 將富血小板因子血漿PFRP與生物支架按照體積比為1:3混合，制得富血小板因子血漿 制劑。生物支架采用注射級(jí)別的透明質(zhì)酸鈉。
[0028] 3、制備羊膜生物制劑 將脫細(xì)胞羊膜的光滑面向下平鋪于〇. 35 μ m聚偏氟乙烯膜上，并于該脫細(xì)胞羊膜的粗 糙面上覆蓋富血小板因子血漿制劑，在-55。(：預(yù)凍6小時(shí)，_8(TC下冷阱冷凍干燥28小時(shí)； 根據(jù)臨床需求，裁剪為不同規(guī)格，3cmX 3cm，分裝密封，環(huán)氧乙烷滅菌，置于4Γ下，冷藏 保存?zhèn)溆谩?br> [0029]參見(jiàn)圖3,圖3為采用正常培養(yǎng)基浸出液、PE膜浸出液、三批次本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí) 施例2及實(shí)施例3制備的脫細(xì)胞羊膜的100%浸出液及5%苯酚培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞毒性 評(píng)價(jià)表；從該毒性評(píng)價(jià)表中可以看出，三批次本發(fā)明實(shí)施例i、實(shí)施例2及實(shí)施例3制備的 脫細(xì)胞羊膜的100%浸出液均無(wú)細(xì)胞毒性。
[0030]以上所述僅為本申請(qǐng)的實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、 等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種羊膜生物制劑，其特征是，由脫細(xì)胞羊膜和富血小板因子血漿制劑組合制成。
2. -種權(quán)利要求1所述的羊膜生物制劑的制備方法，其特征是，包括： 分別制備脫細(xì)胞羊膜和富血小板因子血漿制劑； 將所述脫細(xì)胞羊膜的光滑面向下平鋪于〇· 22、· 45 μ m聚偏氟乙烯膜上，再將所述富 血小板因子血漿制劑覆蓋在脫細(xì)胞羊膜的粗糙面上，在-60~-40°C下預(yù)凍2~8小時(shí)，然后 在-7(T-8(TC下冷阱冷凍千燥24~30小時(shí)，制得所述羊膜生物制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊膜生物制劑的制備方法，其特征是：脫細(xì)胞羊膜與富血小 板因子血漿制劑的比例為每平方米脫細(xì)胞羊膜上覆蓋〇· 2~〇· 5ml富血小板因子血漿制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊膜生物制劑的制備方法，其特征是，所述脫細(xì)胞羊膜是通 過(guò)以下方法制備得到： 1) 用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液清洗胎盤(pán)去除血液成分，將羊膜從胎盤(pán)絨毛膜上分離，再用PBS 沖洗3次，然后浸泡于l%Triton_100溶液中18?24小時(shí)； 2) 浸泡步驟1)制得的羊膜于0. 25%胰蛋白酶中，于37?下恒溫酶解2?4小時(shí)； 3) 浸泡步驟2)制得的羊膜于廣2升PBS中，在8~12°C，轉(zhuǎn)速為18(T200 rpm下震搖 18?24小時(shí)，制得所述脫細(xì)胞羊膜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的羊膜生物制劑的制備方法，其特征是，所述富血小板因子血 漿制劑是通過(guò)以下方法制備得到： 1) 采用受體或供體全血，利用離心加凍融方式制備得到受體或供體富血小板因子血漿 PFRP ； 2) 將所述富血小板因子血漿PFRP與生物支架按照體積比為1:3?3:1混合，制得所述富 血小板因子血漿制劑；所述生物支架為注射級(jí)透明質(zhì)酸鈉。
【文檔編號(hào)】A61L15/40GK104189950SQ201410447833
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】康裕建, 丁雪琴, 陳靜嫻, 海泉, 趙峻 申請(qǐng)人:成都清科生物科技有限公司