Urantide的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及及醫(yī)藥和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為Urantide的應(yīng)用。本發(fā)明以健康雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象，建立AS模型，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Urantide可使動(dòng)脈壁內(nèi)的膠原蛋白降解加速，血清中的膠原蛋白以HYP形式隨尿液排出體外，大鼠AS癥狀緩解；Urantide可下調(diào)炎癥介質(zhì)CRP及MCP-1的表達(dá)，并上調(diào)IL-6及TGF-β的表達(dá)，對(duì)動(dòng)脈炎癥損傷有抑制作用；Urantide可改善大鼠胸主動(dòng)脈AS病變程度，并下調(diào)胸主動(dòng)脈U?II及其受體GPR14基因和蛋白的表達(dá)水平，對(duì)AS大鼠胸主動(dòng)脈有抗損傷作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】Urant i de的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及Urantide的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著化學(xué)和生命科學(xué)的進(jìn)步，近年來(lái)多肽類(lèi)藥物的研發(fā)和上市出現(xiàn)了逐步加速的 趨勢(shì)，與小分子化學(xué)藥相比，多肽類(lèi)藥物往往具有更為安全、副作用小，很少引起嚴(yán)重的免 疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。Urantide是在h U II基礎(chǔ)上衍生的肽類(lèi)U II受體拮抗劑，目前被認(rèn)為是 最有效的肽類(lèi)U II受體拮抗劑，其拮抗效應(yīng)較其它化合物高50?100倍。隨著對(duì)特異性、 高親和力的u II受體拮抗劑Urantide研發(fā)的深入，Urantide在心血管系統(tǒng)疾病，尤其是 AS的病理生理作用將得到進(jìn)一步的闡明，同時(shí)Urantide作為臨床治療AS藥物亦展現(xiàn)出廣 泛的應(yīng)用前景。。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明旨在將Urantide用于加速動(dòng)脈壁內(nèi)的膠原蛋白降解，使血清中的膠原蛋 白以HYP形式隨尿液排出體外。
[0004] 本發(fā)明還將Urantide用于下調(diào)炎癥介質(zhì)CRP及MCP-1的表達(dá)，并上調(diào)IL-6及 TGF-β的表達(dá)，抑制動(dòng)脈炎癥損傷。
[0005] 本發(fā)明還將Urantide用于改善胸主動(dòng)脈AS病變程度，并下調(diào)胸主動(dòng)脈U II及其 受體GPR14基因和蛋白的表達(dá)水平。
[0006] 本發(fā)明以健康雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象，建立AS模型，研究AS大鼠胸主動(dòng)脈 及AS病變細(xì)胞中U II及其受體GPR14的變化，探討了 Urantide對(duì)大鼠 AS的作用及其作 用下U II、GPR14、炎癥因子和膠原代謝的變化規(guī)律，
[0007] 結(jié)果顯示：
[0008] (1) Urantide可使動(dòng)脈壁內(nèi)的膠原蛋白降解加速，血清中的膠原蛋白以HYP形式 隨尿液排出體外，大鼠 AS癥狀緩解；
[0009] (2)Urantide可下調(diào)炎癥介質(zhì)CRP及MCP-1的表達(dá)，并上調(diào)IL-6及TGF-β的表 達(dá)，對(duì)動(dòng)脈炎癥損傷有抑制作用；
[0010] (3) Urantide可改善大鼠胸主動(dòng)脈AS病變程度，并下調(diào)胸主動(dòng)脈U II及其受體 GPR14基因和蛋白的表達(dá)水平，對(duì)AS大鼠胸主動(dòng)脈有抗損傷作用。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 u II與其受體GPR14結(jié)合后可促進(jìn)AS的發(fā)生，而 u II受體特異性拮抗劑Urantide則可減輕AS炎癥反應(yīng)，減少ECM積聚增加，改善AS癥狀， 闡明Urantide抑制AS發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制，為臨床應(yīng)用Urantide防治AS提供了依據(jù)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠肝系數(shù)的影響圖。
[0013] 圖2為Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈U II表達(dá)的影響圖
[0014] A :正常對(duì)照組；B :AS模型對(duì)照組；C :陽(yáng)性藥對(duì)照組；D-F分別為Urantide給藥 3d、7d 及 14d 組（DAB，X200)
[0015] 圖3為Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈GPR14表達(dá)的影響圖
[0016] A :正常對(duì)照組；B :AS模型對(duì)照組；C :陽(yáng)性藥對(duì)照組；D-F分別為Urantide給藥 3d、7d 及 14d 組（DAB，X200)
[0017] 圖4為Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈U II及GPR14mRNA表達(dá)的影響圖。
[0018] 其中，*P <0· 05, **P <0· Olvs NC group ; ΔΡ <0· 05，Δ ΔΡ <0· Olvs AS group
[0019] 圖5為Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈U II及GPR14蛋白表達(dá)的影響圖
[0020] 其中，*P <0· 05, **P <0· Olvs NC group ; ΔΡ <0· 05，Δ ΔΡ <0· Olvs ASgroup

【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0022] 本具體實(shí)施以健康雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象，從體內(nèi)和體外兩方面研究 Urantide對(duì)NF-κ B炎癥通路相關(guān)信號(hào)分子蛋白及基因表達(dá)的抑制作用及其作用機(jī)制。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] S1、配制高脂飼料：基礎(chǔ)飼料、3. 5%膽固醇、10%豬油、0. 2%丙基硫氧嘧啶、0. 5% 膽酸鈉及5%白糖。
[0025] S2、將健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為3組：正常組，飼以普通飼料；高脂組，飼以 高脂飼料；AS模型組，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)在飼以高脂飼料基礎(chǔ)上，每只大鼠給予腹腔注射VD 370U/ kg (分3次注射）。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為單籠飼養(yǎng)，自由飲水，每周稱(chēng)取體重。實(shí)驗(yàn)周期為4 周。
[0026] S3、使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中的TC、TG、HDL、LDL、Ca2+的含量；羥脯 氨酸測(cè)試盒測(cè)定血清、尿中HYP含量；U II和GPR14試劑盒檢測(cè)血尿中U II及其受體GPR14 含量。
[0027] S4、大鼠胸主動(dòng)脈用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μ m厚的切片，二甲苯脫蠟，梯度 酒精脫水，常規(guī)HE染色。應(yīng)用鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)各組大鼠胸主動(dòng)脈U II及其受體GPR14的表達(dá)情況，以及與AS炎癥通路有關(guān)的信號(hào)分子、炎癥因子和膠原的表 達(dá)情況。
[0028] S5、采用貼塊法進(jìn)行VSMC及內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下 進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。細(xì)胞鑒定采用免疫化學(xué)染色S-ABC法，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，一抗為 α-SM和VIII因子抗體，按1 : 100比例稀釋?zhuān)迈r配置的DAB顯色液，室溫下顯色約為 3?5min，復(fù)染，封片。光學(xué)顯微鏡100倍視野下觀察計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百 分比。
[0029] S6、高脂血清制備：復(fù)制AS動(dòng)物模型4周時(shí)，部分AS模型組大鼠用戊巴比妥 (30mg/kg體重）腹腔麻醉，分離胸主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈分叉處下方剪開(kāi)胸主動(dòng)脈，用5mL注射 器采集動(dòng)脈血，用3000r/min離心15min，分離出血清，過(guò)濾滅菌，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030] S7、0x-LDL的制備：ox-LDL在氧化前，LDL先用無(wú) EDTA的PBS液透析24小時(shí)，以除 去 EDTA ;再將 LDL 在含 10ymol/LCuS04 的 PBS 中，于 37°C氧化 12h，后于 4°C，在含 lOOmg/ LEDTA的PBS中透析，每8h換液一次，透析24h ;最后過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0031] S8、將細(xì)胞接種及同步化后，換含高脂血清和OX-LDL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48?72h， 終止培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞增殖情況，制備掃描電鏡照片，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改 變，如可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)含大量脂滴，細(xì)胞器豐富，呈增殖旺盛狀態(tài)，則表明成功的復(fù)制AS細(xì)胞 模型。
[0032] S9、選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并稀釋至 終濃度為1X 1〇3,接種96孔板，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。各實(shí)驗(yàn)組處理時(shí)間 分別為811、1211、2411、4811、7211，每個(gè)時(shí)間段采用奶'1'法進(jìn)行增殖曲線測(cè)定。
[0033] S10、按照流式細(xì)胞儀使用說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)48h后，0.25%胰酶消 化收集細(xì)胞（1X 1〇6個(gè)/mL)，PBS洗滌，經(jīng)70%冷乙醇固定過(guò)夜，離心沉淀，加入PI工作液， 4°C避光反應(yīng)30min，上機(jī)檢測(cè)不同周期分布的細(xì)胞，Modfit LT 3. 0分析。
[0034] S11、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0. 25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約為 1X104個(gè)/mL接種至24孔板。待細(xì)胞80 %融合后，加入含0. 5 %血清培養(yǎng)基同步生長(zhǎng)24h 后，分別加入條件培養(yǎng)液，于48h收集培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測(cè)上清中信號(hào)分子、炎癥因子 及ECM的含量。
[0035] S12、根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針；提取DNA/RNA，紫外分光 光度計(jì)檢測(cè)其完整性和濃度，反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;引物預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出特異性最 強(qiáng)的引物；熒光定量PCR，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，結(jié)合內(nèi)參與目的基因的CT值，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析。
[0036] S13、采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，"探針"是抗體，"顯色"用 標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，硝酸纖維素薄膜以 非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以硝酸纖維素薄膜上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體 起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色檢測(cè)電泳分離的特異 性目的基因表達(dá)的蛋白成分。
[0037] 采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC)及電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS)檢測(cè)合成的 Urantide純度和分子結(jié)構(gòu)。
[0038] RP-HPLC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左 右。工作原理：用非極性的十八烷基鍵合固定相，化學(xué)鍵合固定相是在薄殼型或全多孔硅 膠微粒上，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)把有機(jī)分子鍵合到無(wú)機(jī)擔(dān)體表面，其優(yōu)點(diǎn)是固定相表面更加均勻 一致，能靈活的改變吸附劑表面性質(zhì)，提高選擇性，增強(qiáng)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)柱的壽命；再加入甲 醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相（極性流動(dòng)相），用以 分離非極性或極性小的化合物。RP-HPLC法對(duì)合成的Urantide進(jìn)行檢測(cè)肽純度（Peptide Purity) > 95 %。
[0039] 這種ESI-MS具有很高靈敏度，且電離的分子可以帶有多電荷，這種多電荷離子的 產(chǎn)生大大擴(kuò)展了普通質(zhì)譜儀能分析的質(zhì)量范圍，使質(zhì)譜儀可以分析分子量為幾十萬(wàn)質(zhì)量單 位的蛋白質(zhì)分子。工作原理：ESI-MS是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng) 使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸 增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子 的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷 比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子 的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。ESI-MS對(duì)合成的Urantide進(jìn)行檢測(cè) Expected MS 為 1388.60。
[0040] 動(dòng)脈壁鈣化和動(dòng)脈壁上的脂質(zhì)沉積是AS最顯著的特征。本實(shí)驗(yàn)擬建立一種實(shí)驗(yàn) 周期短、病變重的AS模型復(fù)制的新方法。高脂飼料配制方法，在傳統(tǒng)的高脂飼料中添加了 丙基硫氧嘧啶、膽酸鈉及白糖，目的是抑制甲狀腺功能、促進(jìn)膽固醇吸收，同時(shí)能克服丙基 硫氧嘧啶的苦味并促進(jìn)大鼠的血糖的升高；更重要的是通過(guò)腹腔注射VD370 U/kg體重作 為鈣離子誘導(dǎo)劑，引起動(dòng)脈鈣超負(fù)荷。胸主動(dòng)脈HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組血管內(nèi)皮完整，中 膜可見(jiàn)梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰完整；模型組病變部位內(nèi)膜明顯增厚，血管內(nèi) 皮細(xì)胞排列不完整，平滑肌細(xì)胞在內(nèi)膜增生顯著，大量堆積的泡沫細(xì)胞，出現(xiàn)典型AS病理 改變。
[0041] 本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的AS模型與以往的模型相比，具有實(shí)驗(yàn)周期短、動(dòng)物存活率高及 模型穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。
[0042] AS模型復(fù)制成功后，模型組再隨機(jī)分3組:AS模型組（AS group)、陽(yáng)性藥組（氟伐 他汀Flu group)、Urantide組。正常組和AS模型組每日尾靜脈注射生理鹽水30μ g .kg-l， 連續(xù)14d ;陽(yáng)性藥組每日灌胃給予Flu 5 μ g ?kg-l，連續(xù)14d ;Urantide組，每日尾靜脈注射 Urantide 30 μ g · kg_l，給藥時(shí)間分別為 3d、7d 和 14d。
[0043] 尿標(biāo)本的采集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)收集大鼠24h尿液，留尿期間禁食，不禁水，將大鼠放 入金屬代謝籠內(nèi)，收集、記錄尿量后留取3mL，l 500r/min離心lOmin。去除沉漁，分裝于 Eppendorf管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0044] 血標(biāo)本的采集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組動(dòng)物禁食過(guò)夜，大鼠用戊巴比妥（30mg/kg體重） 腹腔麻醉后，分離胸主動(dòng)脈，用5mL注射器采集動(dòng)脈血，用3 000r/min離心15min，吸取血清 分裝于Eppendorf管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0045] 胸主動(dòng)脈標(biāo)本的采集：大鼠取血后，取胸主動(dòng)脈約為1cm，一部分分裝入標(biāo)本袋， 立即放入液氮中速凍，而后_80°C保存?zhèn)溆?；另一部分則用4%多聚甲醛固定，留做組織學(xué) 檢測(cè)之用。
[0046] 肝臟標(biāo)本采集：大鼠取血后，立即摘取肝臟，生理鹽水洗去血跡后稱(chēng)重，計(jì)算肝系 數(shù)（肝系數(shù)=肝臟重量/體重）。而后用4%多聚甲醛固定，留做形態(tài)學(xué)檢測(cè)之用。
[0047] 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)前體重及一般狀態(tài)無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組大鼠精神狀 態(tài)良好，皮毛有光澤，活潑好動(dòng)，體重隨飼養(yǎng)時(shí)間的增加而增長(zhǎng);AS模型組大鼠皮毛色澤暗 淡，活動(dòng)減少，精神狀態(tài)較差，食欲降低，與正常組比較體重明顯減少（P< 〇.〇1);給藥前， 各給藥組大鼠體重與AS模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥后，各給藥組與AS模型組比較大鼠 體重有不同程度的增加，Urantide給藥組大鼠體重的增加與陽(yáng)性藥組近似，各給藥組大鼠 的精神狀態(tài)及食欲均有所改善，具體結(jié)果如表1所示。
[0048] 表1 Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體質(zhì)量的影響
[0049]

【權(quán)利要求】
1. Urantide用于加速動(dòng)脈壁內(nèi)的膠原蛋白降解，使血清中的膠原蛋白以HYP形式隨尿 液排出體外。
2. 此&拉丨(^用于下調(diào)炎癥介質(zhì)〇^及1〇3-1的表達(dá)，并上調(diào)11^6及了6?-0的表達(dá)，抑 制動(dòng)脈炎癥損傷。 3. Urantide用于改善胸主動(dòng)脈AS病變程度，并下調(diào)胸主動(dòng)脈U II及其受體GPR14基 因和蛋白的表達(dá)水平。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK104189884SQ201410418176
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】趙娟, 任立群 申請(qǐng)人:承德醫(yī)學(xué)院