一種防治動物大腸桿菌病的中藥及制備方法
【專利摘要】一種防治動物大腸桿菌病的中藥及制備方法，屬于動物用中藥領域。本發(fā)明的目的是提供一種現代中獸藥新制劑，用于預防和治療豬、雞、牛、羊、馬、犬、兔大腸桿菌病的防治動物大腸桿菌病的中藥及制備方法。本發(fā)明組方為：地錦草、黃連、白頭翁。本發(fā)明以中獸醫(yī)藥學理論為指導，主要是針對家禽、家畜的大腸桿菌病因而組方，以減少或替代抗生素和其它化學抗菌藥，解決大腸桿菌耐藥性日趨嚴重與肉、蛋、奶等動物產品中藥物殘留超標影響食品安全等問題，更加安全、有效且質量可控的中藥制劑用于動物大腸桿菌病的防治，對于促進動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，防控人畜共患病和維護食品安全均具有重大的現實意義。
【專利說明】一種防治動物大腸桿菌病的中藥及制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物用中藥領域。

【背景技術】
[0002] 致病性大腸桿菌可引起多種動物和人感染發(fā)病，如豬的黃痢、白痢、水腫病，雞的 急性敗血癥、氣囊炎、心包炎和肝周炎，牛、羊、馬、犬、兔急性胃腸炎等，發(fā)病率和致死率均 較高，給動物養(yǎng)殖業(yè)和人類健康帶來嚴重威脅。當前對動物大腸桿菌病的防治還存在許多 亟待解決的重大問題：一是致病性大腸桿菌血清型眾多，迄今還沒有研制出理想的菌苗來 用于防控；二是動物飼養(yǎng)場綜合防治措施不夠完善，飼養(yǎng)管理水平還不夠高，為大腸桿菌病 的發(fā)生和傳播提供了外部條件；三是由于抗生素和化學抗菌藥物的大量使用，大腸桿菌產 生了廣泛的耐藥性，使治療效果不斷下降，臨床又不得不加大劑量并延長給藥時間，大幅度 提高了治療難度與成本；四是抗生素和化學藥物在動物體內及其產品中形成有害藥物殘留 而危害食品安全。在現有文獻資料中不乏采用中藥防治動物大腸桿菌病的報道，但大多源 于經驗之談，沒有經過系統(tǒng)的藥學研究去確認其藥效與毒理，沒有從現代藥理學和傳染病 學角度去證明其安全性和有效性，且藥物劑型在現代集約化飼養(yǎng)場不便使用。
[0003] 中國專利201310406071. 7 (-種豬用止瀉中藥及制備方法)，其方劑是由柴胡、白 頭翁、地錦草、黃連、甘草構成，1、柴胡為解表藥，能"發(fā)表和里，升舉陽氣，舒肝解郁（《中國 獸藥典》)，主治感冒發(fā)熱與寒熱往來"，《傷寒論》的小柴胡湯（以柴胡為君藥）是用來治療半 表半里證的；而豬的腹瀉屬于里證，用不好可能加重病情。
[0004] 2、柴胡品種較多，臨床容易混雜使用。例如藥典就有柴胡及 DC.和狹葉柴胡 Wi 1 Id.兩個種，大葉柴胡及腫 Turcz.是有毒的（《中國獸藥典》）。日本人就因為用小柴胡湯不對癥而引發(fā) 了嚴重的毒性事件。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種現代中獸藥新制劑，用于預防和治療豬、雞、牛、羊、馬、 犬、兔大腸桿菌病的防治動物大腸桿菌病的中藥及制備方法。
[0006] 本發(fā)明制成有效成分的重量份為：地錦草40-80、黃連20-40、白頭翁20-40。
[0007] 本發(fā)明的制備方法是：將地錦草、白頭翁和黃連3味，加10倍量50%乙醇浸潤 30min后，回流提取3次，每次90min，濾過，收集醇提液，回收乙醇，繼續(xù)濃縮至稠膏狀， 50?60°C干燥，制成細粉，加輔料，充分混勻，用70%乙醇制粒，60?80°C烘干，整粒，制成 1000g，即得；其中輔料為：糊精：乳糖：蔗糖=1:1:1。
[0008] 本發(fā)明以中獸醫(yī)藥學理論為指導，主要是針對家禽、家畜的大腸桿菌病因而組方， 以減少或替代抗生素和其它化學抗菌藥，解決大腸桿菌耐藥性日趨嚴重與肉、蛋、奶等動物 產品中藥物殘留超標影響食品安全等問題，更加安全、有效且質量可控的中藥制劑用于動 物大腸桿菌病的防治，對于促進動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，防控人畜共患病和維護食品安全均具有 重大的現實意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是本發(fā)明制備工藝流程圖； 圖2是本發(fā)明抑菌試驗效果圖。

【具體實施方式】
[0010] 本發(fā)明制成有效成分的重量份為：地錦草40-80、黃連20-40、白頭翁20-40。 [0011] 本發(fā)明的制備方法是：將地錦草、白頭翁和黃連3味，加10倍量50%乙醇浸潤 30min后，回流提取3次，每次90min，濾過，收集醇提液，回收乙醇，繼續(xù)濃縮至稠膏狀， 50?60°C干燥，制成細粉，加輔料，充分混勻，用70%乙醇制粒，60?80°C烘干，整粒，制成 1000g，即得；其中輔料為：糊精：乳糖：蔗糖=1:1:1。
[0012] 實施例1 : 本發(fā)明制成有效成分的重量份為：地錦草40、黃連20、白頭翁20; 制備方法同上。
[0013] 實施例2: 本發(fā)明制成有效成分的重量份為：地錦草60、黃連30、白頭翁30; 制備方法同上。
[0014] 實施例3 : 本發(fā)明制成有效成分的重量份為：地錦草80、黃連40、白頭翁40 ; 制備方法同上。
[0015] 提取配方中藥有效成分加工制成口服液、顆粒劑或膠囊劑，含量規(guī)格：lg成品相 當于生藥1.2g。
[0016] 用途：預防和治療豬、雞、牛、羊、馬、犬、兔大腸桿囷病。
[0017] 給藥途徑：內服(混飼、混飲、灌服)。
[0018] 地錦草：為大戟科植物地錦Aawi/iAsa Willd.或斑地 L.的干燥全草，味辛性平，歸肝與大腸經；具有清熱解毒，涼血止血功效，主治動 物下痢，腸炎，便血，尿血，咳血，跌撲損傷，癰腫惡瘡和魚爛鰓等病證，為君藥。
[0019] 白頭翁：為毛茛科植物白頭翁(Bge. ) Regel的干燥根， 味苦性寒，歸胃、大腸經，具有清熱解毒，涼血止痢功效。主治動物熱毒血痢，濕熱腸炎，為臣 藥。輔助君藥地錦草清熱解毒，涼血止血作用；二藥相須為用，能增強全方對動物大腸桿菌 病的防治功效，為臣藥。
[0020] 黃連：為毛茛科植物黃連Franch.、三角葉黃連 ofe/ioiofea C. Y. Cheng et Hsiao或云連teeta Wall.的干燥根莖，味苦性寒，歸 心、脾、胃、肝、膽、大腸經；具有清熱燥濕，瀉火解毒功效，主治動物濕熱瀉痢，心火亢盛，胃 火熾盛，肝膽濕熱，目赤腫痛，火毒瘡癰以及魚赤皮，白頭白嘴，出血等病證；為佐使藥。輔佐 君臣藥發(fā)揮作用，使方劑整體突顯清熱燥濕，瀉火解毒功效；同時黃連歸經較廣，可引導藥 物多靶點發(fā)揮整體防治作用，為佐藥。
[0021] 以下通過實驗對本發(fā)明進一步證明：（以下將本發(fā)明的方劑定名為地翁顆粒） 以打孔法證明本產品對動物致病性大腸桿菌具有顯著地的抑菌作用： 將動物致病性大腸桿菌標準菌株(購自中國獸醫(yī)藥品檢查所）接種于肉湯培養(yǎng)基37°C 培養(yǎng)24 h，按比濁計數法計數，配制成菌濃度為109個/ml的菌液。無菌條件下，用移液槍 吸取供試菌液ιοομ?滴入肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基表面，用涂布棒將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表 面，用滅菌的打孔器(直徑為6mm)在每個平板培養(yǎng)基上打上等距3孔，將藥液滴滿孔，每種 藥做3個樣，作好標記，靜置30 min后平穩(wěn)轉入37°C培養(yǎng)16h，取出測量抑菌直徑，取平均 值。
[0022] 結果表明地翁顆粒對動物致病性大腸桿菌具有顯著地的抑菌作用。
[0023] 中藥藥理學研究證明本品能促進動物細胞免疫功能 采用3H法進行刀豆蛋白A (ConA)、脂多糖（LPS)誘導脾臟淋巴細胞增殖實驗，ELISA 方法檢測ConA或金黃色葡萄球菌Cown株滅活菌體（SAC)刺激的脾淋巴細胞上清液IL-2、 IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的含量。結果顯示，在安全濃度范圍內，地翁顆粒能 夠明顯促進T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖；能夠促進ConA刺激的淋巴細胞分泌INF- γ ;能 夠促進SAC刺激的淋巴細胞分泌IL-12、INF- γ和IL-6,并抑制IL-10的分泌。結果表明， 地翁顆粒能夠有效調節(jié)小鼠脾淋巴細胞的功能，促進細胞免疫。
[0024] 安全藥理學評價 急性毒性試驗結果表明：內服地翁顆粒，劑量為5000 mg/kg生藥的高劑量組，小鼠均 健康成活。表明地翁顆粒的毒性較低，為實際無毒。以最大給藥量和最高濃度的地翁顆粒 灌胃小鼠，小鼠均健康成活，無一死亡病例，經剖檢觀察主要臟器發(fā)育正常，無明顯病變。測 定地翁顆粒的最大耐受量約為10000 mg/kg生藥，證明本品經小鼠口服給藥屬于無毒性藥 品，可以作為一種安全可靠的藥物使用。
[0025] 長期毒性試驗結果表明：給大鼠連續(xù)灌服地翁顆粒28天，外觀體征、行為活動、大 便性狀、體重均未見任何不良影響。各劑量組的血液生理生化學指標和臟器指數在給藥期 間與空白對照組比較，均無顯著性差異；停藥14天后，給藥組的各項指標與空白對照組相 t匕，均無顯著性差異（P > 0.05)。通過組織病理學剖檢，大鼠主要臟器均發(fā)育正常，未見異 常病變。結果表明，不同劑量的地翁顆粒對大鼠連續(xù)使用28天后，未見有明顯的藥物所致 毒性反應及相關組織病理學改變。停藥14天，亦未見藥物引起的延遲性毒性反應。上述研 究結果表明，地翁顆粒長期使用具有較高安全性。
[0026] 靶動物安全性試驗證明本品安全無毒副作用 將地翁顆粒以每lkg體重0. 2g、0. 6g、1. 0g，相當于1倍、3倍和5倍于推薦劑量給豬灌 月艮，連續(xù)用藥7天，給藥后詳細觀察受試豬的一般臨床表現、采食量與體重變化、血液學及 血清生化指標、剖檢與病理組織學變化。結果顯示1倍、3倍和5倍于臨床推薦劑量的地翁 顆粒未引起試驗豬死亡和其它毒性反應。試驗豬精神狀態(tài)、飲食欲及糞便無異常，生長發(fā)育 良好，紅細胞數、血紅蛋白含量、白細胞總數和分類計數以及各項血清生化指標均在正常范 圍。組織切片觀察，各臟器組織結構形態(tài)未發(fā)現有任何異常病變。以上結果表明，地翁顆粒 對豬具有較高的臨床用藥安全性。
[0027] 實驗臨床試驗證明其能有效治療豬大腸桿菌病(仔豬白?。?參照預備臨床試驗結果，將豬源致病性大腸桿菌08株以2. 5 X 101° cfu/頭的攻菌劑量 給21日齡離乳仔豬灌服加腹腔注射，并模擬低溫、潮濕和多重應激條件，使受試豬感染發(fā) 病，待出現典型、穩(wěn)定的臨床癥狀并符合仔豬白痢疾病模型標準后用于臨床試驗。將中藥制 劑地翁顆粒以0. 4g/kg、0. 2g/kg、0. lg/kg的劑量給患病仔豬灌服，每日1次，連服5d。選 擇白龍散為對照藥物，同時設陰性和空白對照組，在預定時期內觀測地翁顆粒對人工感染 仔豬白痢的治療效果、療程和對患病豬生長發(fā)育情況的影響。結果證明：在多重應激存在的 前提下，灌服加腹腔注射豬源致病性大腸桿菌08株成功造成了仔豬白痢疾病模型，感染仔 豬出現了較典型且穩(wěn)定的臨床癥狀，發(fā)病率100%。服用地翁顆粒高、中劑量（0.4 g/kg及 0. 2g/kg)組的仔豬臨床癥狀得到較快改善并治愈，精神活潑，飲食欲增進迅速，排便逐漸恢 復正常，體增重得到較快恢復；高、中劑量組療效優(yōu)于低劑量組和對照藥物組，而且療程較 短，以其治療的仔豬較快恢復了正常生長發(fā)育。由此得出結論：以每lkg體重0.2g和0.4g 劑量的地翁顆粒內服，可有效治療人工感染致病性大腸桿菌08株引發(fā)的仔豬白痢，其治愈 率均為91. 67%，有效率均為100%。用地翁顆粒（0. 4 g/kg及0. 2g/kg)內服治療人工感染 所致仔豬白痢，平均療程為2. 75和2. 92天，病豬精神、飲食欲、糞便性狀和體增重得到較快 恢復。地翁顆粒高、中劑量（0. 4 g/kg及0. 2g/kg)間沒有顯著差異，建議以0. 2g/kg體重 為臨床用藥推薦劑量。高劑量〇. 4g/kg體重的地翁顆粒內服也沒有發(fā)現明顯的毒、副作用， 表明該劑量地翁顆粒對豬臨床用藥也是安全的。
[0028] 擴大臨床試驗證明其能有效治療自然發(fā)生的豬大腸桿菌病(仔豬白?。?以流行病學調查、臨床檢查、病理剖檢和實驗室檢查確定診斷，隨機分組后分別灌服地 翁顆粒和白龍散進行治療。通過觀察排便次數、糞便形態(tài)、精神、食欲等臨床癥狀和實驗室 指標變化，以及給藥前和給藥結束5天后體重等，綜合判定地翁顆粒治療仔豬白痢的有效 性及安全性。結果表明：以〇. 2g/kg體重的劑量灌服地翁顆粒對仔豬白痢確有較好療效。月艮 用地翁顆粒的仔豬臨床癥狀得到較快改善并治愈，精神漸顯活潑，聚堆漸少，活動增多，口 鼻潤澤，飲食欲增進迅速，排便逐漸恢復正常，皮毛漸顯亮澤，體增重得到較快恢復；與對照 藥物組相比，地翁顆粒治療組癥狀恢復較快，療程較短，仔豬較快恢復了正常生長發(fā)育。由 此得出結論：地翁顆粒以〇. 2g/kg體重內服，連續(xù)給藥5天，可有效治療由豬致病性大腸桿 菌引起的仔豬白痢，治愈率92. 86%，有效率96. 43%，平均療程為3. 02天，癥狀得道較快減輕 或消失，治愈仔豬生長發(fā)育得到較快恢復。治療期間未發(fā)現地翁顆粒明顯的毒性或其他不 良反應，證明以0. 2g/kg體重內服是安全的。
[0029] 中藥地翁顆粒對小鼠脾淋巴細胞功能的影響。
[0030] 受試藥物的溶解將地翁顆粒用適量1640培養(yǎng)液溶解，2500rpm離心lOmin，取上 清液經0· 22 μ m濾膜過濾后，稀釋為中藥濃度40(^g/ml、4(^g/ml、4Pg/ml 3個濃度。
[0031] 脾細胞懸液的制備無菌取出小鼠脾臟，用毛玻璃片將小鼠脾臟磨碎，制成脾細胞 懸液。裂解紅細胞后，用PBS洗滌三次，計數(活細胞在95%以上)。用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液將脾細胞濃度調為4X 106細胞/ml。
[0032] 淋巴細胞毒性實驗（MTT法）于96孔培養(yǎng)板中每孔加入ΙΟΟμΙ的細胞懸液，5〇μ1 的中藥樣品（陰性對照組加5〇μ1的培養(yǎng)液)，總體積15〇μ1。每實驗組設3個孔。置5%C0 2 培養(yǎng)箱內37°C溫育48h，培養(yǎng)終止前4h加5 mg/ml ΜΤΤ (2〇μ1/孔)，終止培養(yǎng)后，離心，棄 去上清，每孔加 DMS0 15〇μ1，搖床震蕩lOmin，用酶標儀于570nm處測定每孔0D值。結果表 明，地翁顆粒對小鼠淋巴細胞無毒(見表1)。
[0033] 表1地翁顆粒對淋巴細胞的毒性實驗

【權利要求】
1. 一種防治動物大腸桿菌病的中藥，其特征在于：制成有效成分的重量份為：地錦草 40-80、黃連 20-40、白頭翁 20-40。
2. 權利要求書1所述的防治動物大腸桿菌病的中藥的制備方法，其特征在于：將地錦 草、白頭翁和黃連3味，加10倍量50%乙醇浸潤30min后，回流提取3次，每次90min，濾 過，收集醇提液，回收乙醇，繼續(xù)濃縮至稠膏狀，50?60°C干燥，制成細粉，加輔料，充分混 勻，用70%乙醇制粒，60?80°C烘干，整粒，制成1000g，即得；其中輔料為：糊精：乳糖：蔗糖 =1:1:1。
【文檔編號】A61K36/718GK104147165SQ201410395588
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2014年8月13日
【發(fā)明者】韋旭斌, 付本懂, 伊鵬霏, 夏方 申請人:韋旭斌