一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒及其制備方法和應用。納米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜堿(PCB)或聚乙二醇(PEG)的親水層，內(nèi)部是至少含有pH敏感的聚合物單元的疏水核，親水層與疏水核之間是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚(PDS)單元間經(jīng)交聯(lián)反應形成的二硫鍵(S‐S)交聯(lián)層。在pH與氧化還原雙敏感層交聯(lián)納米粒的表面親水層上可修飾上腫瘤靶向基團，通過納米粒對腫瘤細胞的特異性靶向作用，促進納米粒在腫瘤組織的富集和腫瘤細胞的內(nèi)吞。本發(fā)明提供的雙敏感層交聯(lián)納米粒，其生物相容性好，毒性低。在腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽作用下交聯(lián)結構解離，促進藥物釋放。制備方法簡便、穩(wěn)定性良好、便于操作推廣。
【專利說明】一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒及其制備方法 和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分子化學和生物醫(yī)學工程領域，特別是涉及一種pH與氧化還原雙 敏感聚合物層交聯(lián)納米粒，及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 目前，癌癥（即惡性腫瘤）是世界上發(fā)病率和死亡率都比較高的疾病之一。在眾 多治療癌癥的手段中，化療是最重要的治療方法之一，但由于體循環(huán)的清除作用、腫瘤組織 低滲透性、腫瘤細胞耐藥性等問題，嚴重阻礙了抗腫瘤藥物向腫瘤細胞的遞送效率，導致療 效差。此外，現(xiàn)有抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞的同時對正常組織也產(chǎn)生嚴重的毒副作用，導 致臨床治療往往因毒副作用大而失敗，或因毒副作用的限制無法提高劑量而達不到理想治 療效果。可見，要提高化療效果、降低毒副作用，必須提高抗腫瘤藥物的靶向遞送效率，降低 藥物在正常組織內(nèi)的聚集。納米載體與各種促進腫瘤靶向遞送手段的結合，為抗腫瘤藥物 的革巴向遞送帶來了希望。
[0003] 此外，腫瘤組織具有有別于正常組織的特異微環(huán)境，首先表現(xiàn)為腫瘤組織與正常 組織之間存在pH梯度：血液和正常組織的pH約為7. 4,而腫瘤組織的pH在6. 8左右，腫瘤 細胞內(nèi)的內(nèi)涵體及溶酶體的pH為4. 0?6. 5。其次，腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)的谷胱甘肽（GSH)的濃 度（?lOmmol)遠高于血液和正常組織內(nèi)的谷胱甘肽濃度（2?20 μ mol)。因此，為提高抗 腫瘤藥物的靶向遞送效率，人們設計了多種pH、氧化還原敏感的納米載體，旨在促進藥物在 腫瘤組織及腫瘤細胞內(nèi)的釋放。但是，非交聯(lián)結構的pH或GSH敏感的納米載體，不僅體循 環(huán)穩(wěn)定性較差，而且在正常生理環(huán)境里24h內(nèi)有高于20%的藥物被釋放出來。為提高納米 粒的穩(wěn)定性，人們采用pH或GSH敏感的化學鍵進行核或殼交聯(lián)。雖然單一敏感的交聯(lián)結構 能夠有效降低藥物在體循環(huán)過程中的釋放，但難以實現(xiàn)腫瘤細胞內(nèi)的藥物快速釋放。
[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種腫瘤靶向并響應腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境藥物釋放的納米粒，特 點是：在人體循環(huán)中結構穩(wěn)定并有效抑制藥物釋放，能夠靶向腫瘤組織并在腫瘤細胞內(nèi)協(xié) 同響應低pH和GSH刺激，快速釋放藥物的納米粒，解決抗腫瘤藥物腫瘤靶向遞送問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明中，以活性可逆加成鏈轉移（RAFT)聚合方法，制備結構和組成可控的兩親 性兩性離子聚合物，鍵合對惡性腫瘤具有特定靶向作用的配體，即靶向基團，構建抗腫瘤藥 物靶向遞送的納米載體。旨在通過靶向基團，親水段，二硫鍵可逆交聯(lián)殼層、pH敏感疏水內(nèi) 核的協(xié)同作用，提高納米載體的靶向遞送效率，實現(xiàn)藥物在腫瘤細胞內(nèi)的定位可控釋放，以 解決現(xiàn)有技術中納米藥物載體的體循環(huán)清除速率快、靶向性差、控釋效果差等諸多問題。
[0006] 首先，本發(fā)明提供了一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒，其特征在于，所 述的納米粒表面是至少含有聚羧酸甜菜堿（PCB)或聚乙二醇（PEG)的親水層，內(nèi)部是至少 含有pH敏感的聚合物單元的疏水核，親水層與疏水核之間是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶 二硫醚（ros)單元間經(jīng)交聯(lián)反應形成的二硫鍵（s-s)交聯(lián)層。
[0007] 優(yōu)選的，所述的pH敏感的聚合物為聚甲基丙烯酸二異丙氨基乙酯（PDPA)。PDPA 在pH = 7. 4環(huán)境下疏水，即保持納米粒內(nèi)核的疏水性，用于藥物負載和體循環(huán)穩(wěn)定性；在 pH6. 5以下能質(zhì)子化變?yōu)橛H水。因此，在體循環(huán)（pH7. 4)下，Η)ΡΑ為內(nèi)核的納米粒保持穩(wěn) 定；但被腫瘤細胞攝取后，在內(nèi)涵體/溶酶體PH4. 0?6. 5條件下，PDPA鏈上的二異丙氨基 發(fā)生質(zhì)子化而使內(nèi)核由疏水變?yōu)橛H水，協(xié)同交聯(lián)層二硫鍵（S-S)的GSH響應性斷裂，促進納 米粒在腫瘤細胞內(nèi)崩解并快速釋放藥物。
[0008] 優(yōu)選的，pH與氧化還原雙敏感層交聯(lián)納米粒的表面親水段為兩性離子聚合物聚 羧酸甜菜堿（PCB)，其能夠通過靜電作用形成穩(wěn)定的水化層，降低RES對納米粒的體循環(huán)清 除。
[0009] 優(yōu)選的，在pH與氧化還原雙敏感層交聯(lián)納米粒的表面親水層上可修飾上腫瘤靶 向基團，通過納米粒對腫瘤細胞的特異性靶向作用，促進納米粒在腫瘤組織的富集和腫瘤 細胞的內(nèi)吞。
[0010] 優(yōu)選的，靶向基團與聚合物的摩爾比為〇. 01?1。
[0011] 優(yōu)選的，腫瘤靶向基團選自多肽 RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、 CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白細胞介素 IL-13p、葉酸等；其中的R、G、D、C、K等大寫字母是各 種氨基酸的單字符縮寫符號，如R代表精氨酸，G代表甘氨酸。
[0012] 進一步優(yōu)選的，由式1所示的l)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或2) RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA與PCB-b-PDS-b-PDPA聚合物共組裝形成納米粒，再經(jīng)PDS的交聯(lián)反 應形成層交聯(lián)納米粒。其特征在于（如附圖1所示），該納米粒最外層為能夠與腫瘤血管內(nèi) 皮細胞和腫瘤細胞表面過表達的整合素受體結合的RGD和兩性離子PCB ;內(nèi)部為高度pH敏 感的Η)ΡΑ疏水核；親水層與疏水核之間為二硫鍵交聯(lián)層。該納米粒，通過親水段兩性離子 的靜電作用形成穩(wěn)定的水化層，使得納米粒在血液循環(huán)中能夠穩(wěn)定存在，減少RES系統(tǒng)的 清除，延長體循環(huán)時間；RGD靶向配體，提高納米載體在腫瘤組織的富集和滯留，增強腫瘤 細胞對納米藥物載體的攝??；二硫鍵殼層交聯(lián)，抑制藥物在正常生理條件下的釋放以降低 毒副作用，而被腫瘤細胞攝取后，在腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH?10mM)作用下，二硫鍵斷裂 使交聯(lián)結構快速解離；酸敏感的疏水內(nèi)核在內(nèi)涵體/溶酶體微酸環(huán)境中（pH4. 0?6. 5)，發(fā) 生疏水-親水轉變而使納米粒解體，促進藥物快速釋放，提高藥效。
[0013]

【權利要求】
1. 一種pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒，其特征在于，所述的納米粒表面是至少 含有聚羧酸甜菜堿（PCB)或聚乙二醇（PEG)的親水層，內(nèi)部是至少含有pH敏感的聚合物單 元的疏水核，親水層與疏水核之間是由聚甲基丙烯酰胺乙基吡啶二硫醚（ros)單元經(jīng)二硫 鍵（S-S)形成的交聯(lián)層。
2. 權利要求1所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒，其特征在于所述的pH敏 感的聚合物為聚甲基丙烯酸二異丙氨基乙酯（PDPA)。
3. 權利要求2所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒，其特征在于表面親水層帶 有腫瘤靶向基團。
4. 權利要求3所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒，其特征在于腫瘤靶向基團 選自多肽 RGD、CRGDRGPDC、CRGDKGPDC、CGNKRTRGC、CRGDK、CGNKRTRGC、RPARPAR，以及白細胞 介素 IL-13p或葉酸。
5. 權利要求4所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒，其特征在于是由式1所 示的 l)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 或 2)RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 與 PCB-b-PDS-b-PDPA 聚合 物共組裝形成納米粒，再經(jīng)ros的交聯(lián)反應形成二硫鍵（S-S)層交聯(lián)；所述的嵌段聚合物 RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA 或 PCB-b-PDS-b-PDPA 中，PCB 聚合度 X 為 25 ?70 的整數(shù)，PDS 聚 合度y為1?15的整數(shù)，PDPA聚合度Z為25?70的整數(shù)；
6. 權利要求5所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒的制備方法，是采用活性可 逆加成鏈轉移（RAFT)聚合方法制備，特征是步驟如下： 1) 采用三硫代十二烷基-2-異丙酸酯（CTAm)為RAFT鏈轉移劑，偶氮二異丁腈（AIBN) 為引發(fā)劑，逐步引發(fā)羧酸甜菜堿叔丁酯甲基丙烯酸甲酯（CB-tBU)、甲基丙烯酰胺乙基吡啶 二硫醚（DS)和甲基丙烯酸二異丙氨基乙酯（DPA)聚合，得到PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA三嵌 段聚合物； 2) 二甲基亞砜（DMSO)中，PCB (tBU) -b-PDS-b-PDPA與N-羥基琥珀酰亞胺（NHS) 和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC.HC1)于室溫下反應2-4h后， 加入巰基乙醇淬滅未反應的EDC. HCl，之后加入RGD，于室溫下繼續(xù)反應12-36h，得到 RGD-PCB (tBU) -b-PDS-b-PDPA 三嵌段聚合物； 3) 將 RGD-PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA 或 PCB(tBU)-b-PDS-b-PDPA 三嵌段聚合物在室 溫下用三氟乙酸（TFA)水解PCB (tBU)嵌段上的叔丁酯，得到RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或 PCB-b-PDS-b-PDPA三嵌段聚合物。
7. 權利要求1?5任意一項所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒載藥應用，其 特征是納米粒核內(nèi)包載疏水藥物，其中藥物含量為納米粒質(zhì)量的〇. 5-15% ;所述的納米粒 的平均粒徑優(yōu)選為50-300nm。
8. 權利要求7所述的pH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒應用，其特征是所述疏水性 藥物選自阿霉素、紫杉醇、多西他賽、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春花堿、地塞米松、姜黃素或博 來霉素中的一種或多種的任意組合。
9. 權利要求7或8所述的納米粒應用方法，特征是：將疏水性藥物與嵌段共聚物如 RGD-PCB-b-PDS-b-PDPA或（和）PCB-b-PDS-b-PDPA溶解于二甲基亞砜中，加入二硫蘇糖 醇（DTT)，在氮氣保護下至少反應15min ;然后將有機相溶液置于薄膜透析袋中，在1000? 2000倍體積的脫氧的pH = 7. 4的0. OlM的磷酸鹽緩沖溶液中透析提純；透析結束后，透析 袋中形成的載藥納米粒溶液，在超聲作用下至少反應，完成二硫鍵層交聯(lián)，得到PH與氧化 還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒水分散液，凍干，得到可再分散的納米粒凍干粉。
10. 權利要求1所述的PH與氧化還原雙敏感的層交聯(lián)納米粒的應用，其特征在于可用 于藥物、核酸、蛋白、多肽、多糖類大分子的體內(nèi)遞送，或用于診斷試劑、熒光探針的遞送；所 述載藥雙敏感層交聯(lián)納米粒劑型為凍干粉或者為生理鹽水分散液針劑。
【文檔編號】A61K47/34GK104231193SQ201410366575
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權日:2014年7月29日
【發(fā)明者】董岸杰, 黃平升, 鄧聯(lián)東 申請人:天津大學