一種抗術(shù)后疤痕的可降解多支化糖肽水凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗術(shù)后疤痕的可降解多支化糖肽水凝膠及其制備方法。它是由修飾了疏水膽固醇的多支化糖肽在生理條件下通過疏水、π-π堆疊和氫鍵等作用力自組裝形成的水凝膠。由于該多支化糖肽結(jié)構(gòu)中含有的氨基葡萄糖單元能夠有效抑制由成纖維細(xì)胞增殖導(dǎo)致的組織纖維化，防止術(shù)后疤痕的形成，因此本發(fā)明可用作抗術(shù)后疤痕的凝膠態(tài)制劑。引入疏水膽固醇不僅可以提高凝膠的生物相容性，降低其毒副作用和炎癥風(fēng)險，而且可以提高水凝膠的自組裝能力以及穩(wěn)定性。本發(fā)明具有生物安全性高，操作簡便等優(yōu)點。
【專利說明】一種抗術(shù)后疤痕的可降解多支化糖肽水凝膠及其制備方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種抗術(shù)后疤痕的可降解多支化糖肽水凝膠及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0003]青光眼是全球范圍內(nèi)的主要致盲眼病，約占眼科疾病的14.36%。在我國，隨著計算機技術(shù)的普及與應(yīng)用，以及新媒體模式的流行，人們用眼壓力隨著閱讀、工作和娛樂方式的改變不斷增大，青光眼發(fā)病率呈爆發(fā)式增長，已成為我國第二大眼病。近幾年，隨著人們對青光眼發(fā)病機制的進一步了解，激光濾過手術(shù)更受青光眼患者的青睞，目前市場占有率近70%。但濾過手術(shù)后創(chuàng)口極易疤痕化從而導(dǎo)致濾過道閉合，手術(shù)失敗，青光眼復(fù)發(fā)。為了抑制青光眼濾過手術(shù)后疤痕組織的形成(結(jié)膜下組織纖維化)，臨床上常采用多次注射抗增生藥物的方法，如5-氟尿嘧啶和絲裂霉素水劑等。此類藥物會引起嚴(yán)重的毒副作用，如低眼壓性黃斑病變、濾過泡滲漏、濾過泡感染、眼內(nèi)炎等，使患者痛苦不堪。此外，目前市場上可用的青光眼眼閥都依賴進口(如硅管)，我國大部分青光眼患者常因無法承擔(dān)昂貴的費用退而選擇治療效果差副作用大的廉價國產(chǎn)藥物，但其復(fù)發(fā)率很高，患者必須長期用藥，更可怕的后果在于直接導(dǎo)致患者視神經(jīng)受損和視力嚴(yán)重下降。因此，針對青光眼的高發(fā)生率，為了應(yīng)對目前治療的困境，研究開發(fā)更高效、更安全的抑制濾過道疤痕化的制劑或青光眼濾過手術(shù)輔助器械勢在必行。
[0004]研究表明，核心蛋白多糖(Decorin)是一種小分子的硫酸軟骨素類蛋白多糖，包含一個核心蛋白和一條氨基葡萄糖多聚糖鏈。它能降低轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的活性，阻斷TGF-β與其受體之間的相互作用，從而起到抑制成纖維細(xì)胞增生，防止組織纖維化的作用。但Decorin用于臨床上抑制青光眼術(shù)后瘢痕有以下缺點:蛋白多糖人工合成非常困難、價格昂貴，使用的水劑注射法需要反復(fù)注射增加病人痛苦等。從Decorin的組成結(jié)構(gòu)受到啟發(fā)，科學(xué)研究證實氨基葡萄糖同樣具有抑制纖維化的作用。因此，研究設(shè)計具有良好的生物相容性、在體內(nèi)可持續(xù)高效釋放氨基葡萄糖的制劑或手術(shù)輔助器械是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點。
[0005]在過去幾十年里，由于具有良好的生物相容性、生物活性以及種類多樣性，多肽及其衍生物廣泛吸引著研究者的興趣。目前多肽產(chǎn)品已廣泛用于醫(yī)藥、保健品、化妝品、生物材料等眾多領(lǐng)域。其中，在醫(yī)藥領(lǐng)域已開發(fā)的多肽藥物分為治療藥物、診斷藥物和預(yù)防藥物。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)，是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成。研究人員發(fā)現(xiàn)，利用分子間氫鍵作用、疏水性作用和堆積作用等，多肽及其衍生物可以在水溶液自組裝形成具有納米纖維微觀結(jié)構(gòu)的超分子水凝膠。由于在制備過程無需加入化學(xué)交聯(lián)劑，高含水量的多肽凝膠可以被直接注射到靶向位點，因此廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用等領(lǐng)域。
[0006]在多肽分子結(jié)構(gòu)中引入生命體內(nèi)大量含有的疏水功能團膽固醇和氨基葡萄糖，得到與核心蛋白多糖結(jié)構(gòu)類似的多支化糖肽。該糖肽在生理條件下通過自組裝形成水凝膠，該凝膠不僅生物相容性好，安全性高，而且在生理環(huán)境下可以通過降解的方式持續(xù)釋放氨基葡萄糖，起到抑制成纖維細(xì)胞生長的作用，有望用于抑制青光眼濾過手術(shù)后的疤痕化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種生物相容性好、安全無毒的多支化糖肽水凝膠的制備方法。
[0008]制備方法如下:
(O利用固相合成方法制備含有膽固醇作為疏水端的三肽或四肽，三肽的氨基酸序列為天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸或苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，四肽的氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸；
(2)通過使用不同的切落劑將合成的三肽或四肽從固相切落，得到含有一個、兩個或三個羧基的三肽或四肽；
(3)純化的三肽或四肽與氨基葡萄糖進行縮合反應(yīng)得到多支化糖肽；
(4)通過高效液相色譜法分離純化所制得的多支化多肽；
(5)將多支化糖肽分散在磷酸鹽緩沖溶液中，通過加熱溶解-冷卻法制備得到多支化糖肽水凝膠。
[0009]上述方案中，所用多肽全部通過固相有機合成技術(shù)制備，固相合成技術(shù)所采用的樹脂為2-氯-三苯甲基氯樹脂、Rink Amide樹脂或MBHA樹脂中的一種，肽鏈的延長為碳端到氮端。
[0010]上述方案中，步驟(2)中得到含有一個、兩個或三個羧基的三肽或四肽，具體如下:所用切落劑是體積比為1:2:7的醋酸、三氟乙醇和二氯甲烷時，天冬氨酸的側(cè)基保護基OtBu不會被切除，切下的肽鏈只含有碳端一個羧基；當(dāng)所用切落劑是體積比為5:5的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液時，天冬氨酸的側(cè)基保護基OtBu被切除，切下的肽鏈中的羧基包括碳端的羧基和側(cè)鏈的羧基，肽鏈含有一個天冬氨酸就有兩個羧基，肽鏈含有兩個天冬氨酸就有三個羧基。
[0011]上述方案中，合成多支化糖肽的縮合劑是N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺中的一種。
[0012]上述方案中，高效液相色譜法分離純化多支化多肽的條件是:HPLC分離柱為C18柱，用含0.1% (v/v)NH4OH的乙腈和含0.1% (v/v)NH4OH的去離子水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254 nm。
[0013]上述方案中，磷酸緩沖溶液的濃度為10 mM, pH為7.4。
[0014]上述方案中，通過加熱溶解-冷卻法制備糖肽水凝膠時，可以先把多支化糖肽加熱到60-80°C使糖肽完全溶解，隨后靜置冷卻到室溫形成水凝膠。
[0015]本發(fā)明所制備的多支化糖肽水凝膠在組織蛋白酶的作用下能夠緩慢降解，降解的產(chǎn)物安全無毒，且降解的過程中可以緩慢釋放氨基葡萄糖用于抑制組織纖維化。本發(fā)明所制備的糖肽水凝膠制劑由膽固醇、氨基葡萄糖和多肽構(gòu)成，生物相容性好，安全無毒。支化糖肽中有效成份氨基葡萄糖的含量高，可以減少水凝膠制劑用量，降低生產(chǎn)和使用成本。糖肽凝膠的緩慢降解有利于在體內(nèi)持續(xù)釋放氨基葡萄糖，使凝膠制劑長期有效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.糖妝Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine (膽固醇-苯丙氛酸-苯丙氛酸-天冬氨酸-氨基葡萄糖)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0017]圖2.HPLC 表征糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine 的純度。
[0018]圖3.糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine自組裝形成水凝膠照片。
[0019]圖4.不同濃度的糖肽 Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine 水凝膠在 HeLa 和 3T3 細(xì)胞培養(yǎng)48小時的細(xì)胞毒性。
[0020]圖5.糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine 降解前的 ES1-MS 圖。
[0021]圖6.糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine 降解 168 小時后的 ES1-MS 圖。
[0022]圖7.支化糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine)-glucosamine 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0023]圖8.多支化糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine)-Asp (glucosamine)-glucosamine (膽固醇-苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸(氨基葡萄糖)_天冬氨酸(氨基葡萄糖)-氨基葡萄糖)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0024]圖9.a -SMA( α -肌動蛋白)免疫組織化學(xué)研究在濾過泡周圍組織上成纖維細(xì)胞的增殖表達(dá)程度。

【具體實施方式】
[0025]實施例1
(I)含有良好生物相容性的疏水功能團膽固醇(cholesterol, Chol)修飾的三肽Chol-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH 的制備
采用2-氯-三苯甲基氯樹脂(樹脂的有效氯取代度為1.08mmol/g)為固相載體，使用多肽固相自動合成儀制備膽固醇鍵接的短肽Chol-Phe-Phe-Asp (OtBu) -0H。肽鏈在樹脂上由碳端向氮端延長。具體的制備步驟如下:稱取2.0g 2-氯-三苯甲基氯樹脂(共有有效氯的量為2.0g X 1.08mmol/g= 2.16mmol，然后用15mL DMF浸泡樹脂I小時。抽去DMF，加入溶有 FMOC-Asp (OtBu)-OH(2 X 2.16mmol)和二異丙基乙胺(DIEA, 6 X 2.16mmol)的 15 mLDMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，用15 mL DMF洗滌樹脂三次，然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。抽去反應(yīng)液，用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 X 2.16mmol)、DIEA(6 X 2.16mmol)、苯并三氮唑-N，N，N’N’_四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，2.4 X 2.16mmol)和1-羥基苯并三氮唑(H0Bt，2.4 X 2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。之后用15 mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 X 2.16mmol)、DIEA (6 X 2.16mmol)、苯并三氮唑-N，N, N’ N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，2.4 X 2.16mmol)和1-羥基苯并三氮唑(HOBt, 2.4X2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。之后用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有 Cholesteryl chi or o formate (2 X 2.1 Bmmol)和 DIEA (6 X 2.1 Bmmol )的 15 mLTHF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。整個肽鏈合成結(jié)束后，分別用15mL THF、15mLDMF、15mL CH3OH和15mL CH2Cl2各洗滌樹脂3次，真空干燥樹脂過夜。加入20mL切落劑(體積比1:2:7的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2將多肽從樹脂上切落，收集濾液并濃縮。然后加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品真空干燥過夜。
[0026](2)含有氨基葡萄糖單元的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine制備將上述制備的 Chol-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH (1.5mmol )、N, N- 二環(huán)己基碳酰亞胺
(DCC, 1.8mmol)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，1.8mmol)溶于25mL重蒸的無水THF中，并在冰浴下攪拌6小時。然后抽濾除去沉淀，加入6mL溶有氨基葡萄糖鹽酸(6mmol)和NaHCO3(12mmol)的水溶液到濾液中并在室溫下攪拌24小時。旋蒸濃縮除去溶劑，加入20mL體積比為5:5的三氟乙酸和CH2Cl2的混合溶液，在室溫下攪拌I小時除去側(cè)基OtBu。之后加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并用乙醚多次洗滌，室溫下真空干燥產(chǎn)品。用高效液相色譜(HPLC)分離純化產(chǎn)品(HPLC分離柱為C18型，含有0.1%氨水的乙腈和0.1%氨水的二次水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254nm)，結(jié)構(gòu)式見附圖1，其HPLC圖譜如附圖2。
[0027](3)可注射生物降解凝膠的制備
將糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine分散在磷酸緩沖溶液(PBS, pH=7.4)中，加熱至80°C使其充分溶解形成澄清溶液(濃度20-30mg/mL)。緩慢降低溫度至室溫時，糖肽可以自組裝形成穩(wěn)定的超分子水凝膠，如附圖3。
[0028](4)糖肽水凝膠的生物相容性以及生物安全性評價
糖肽水凝膠的生物相容性通過和細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞毒性及細(xì)胞存活率測定，分別采用HeLa和3T3兩種細(xì)胞用MTT法檢測。首先將在高溫溶解的不同濃度的糖肽溶液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔20 μ L，室溫冷卻形成凝膠，照射紫外滅菌。然后將HeLa和3Τ3細(xì)胞以6000個/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μ L含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后在5% CO2培養(yǎng)箱中于37度培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，小心移除培養(yǎng)板中的溶液，加入200 μ L新鮮DMEM培養(yǎng)基。再在每個孔中各加入20 μ L MTT的磷酸鹽緩沖液溶液(5 mg/mL)，在37度濕潤環(huán)境中培育4 h，棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，各加入150 μ LDMSO并在室溫下振蕩I min混合均勻，之后用酶標(biāo)儀(B1-Rad,Model 550)記錄570 nm處的吸光值。用第I列未接種細(xì)胞所測得吸光值的平均值對其它各孔調(diào)零，用第2列只接種細(xì)胞未加入藥物所測得的吸光值為參照，第3列到第11列各孔中得出的平均吸光值作為測試結(jié)果。細(xì)胞的相對存活率由公式算出:細(xì)胞相對存活率(%) = (0D57(l(sampld/0D57CI(_trol))X100^*
OD570 (control)
是未加入藥物時測定的吸光值，0D57CI(sampld是加入藥物后測得的吸光值。OD值的測定基于4個獨立平行樣取平均值，結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。如附圖4所示，在各個濃度下糖肽凝膠對HeLa和3T3兩種細(xì)胞均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。
[0029](5)糖肽水凝膠的生物降解性能評估
稱0.8g糖肽水凝膠放在樣品瓶中，然后加入1.0 mL的20U的組織蛋白酶B和凝膠在37度共孵育。之后每隔24小時取100 μ L混合液體同時補加100 μ L新鮮20U的組織蛋白酶B溶液，連續(xù)檢測168小時。然后使用ES1-MS檢測糖肽凝膠的降解情況評估其在生物體內(nèi)的降解性能。通過對比圖5和圖6可知，在水凝膠降解前，ES1-MS質(zhì)譜(圖5)主要顯示是多肽凝膠的分子離子峰；而與組織蛋白酶B共孵育以后，出現(xiàn)大量分子量較小的分子離子峰且多肽凝膠的分子離子峰消失(圖6)，說明多肽凝膠能夠在組織蛋白酶B的作用下發(fā)生降解。
[0030](6)兔眼濾過手術(shù)以及成纖維細(xì)胞的分布情況檢測
濾過手術(shù)前首先對小分子肽的凝膠做消毒處理。具體方法如下:使用孔徑為250 nm的濾膜將小分子肽的水溶液過濾除菌，然后再將凝膠置于紫外光下照射30分鐘。濾過手術(shù)在兔子的右眼進行，左眼作為參照。12只成年白兔平均分為四組:第一組兔眼只進行濾過手術(shù)、第二組兔眼在濾過手術(shù)中注射Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine多肽凝膠、第三組兔眼在濾過手術(shù)中使用Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine) -glucosamine支化糖肽凝膠、第四組兔眼在濾過手術(shù)中注射 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine) -Asp (glucosamine) -glucosamine多支化糖肽凝膠。在濾過手術(shù)中，向深層肌肉注射氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(15 mg/kg)對兔子做全身麻醉，使用l_wt%地卡因?qū)ν米佑已圩鼍植柯樽怼Ｔ跒V過手術(shù)后的14天內(nèi)，向心臟注射致死劑量的戊巴比妥處死手術(shù)兔。摘除眼球并保存在4-wt%多聚甲醛溶液中進行組織固定。隨后用石蠟包埋眼組織手術(shù)濾過泡區(qū)，做成4 ym的病理切片。將切片進行α-肌動蛋白(α-SMA)免疫組化染色用于觀察肌成纖維細(xì)胞的分布情況。由于成纖維細(xì)胞在增殖時其表面會分泌α -肌動蛋白(a -SMA)，我們使用免疫組織化學(xué)研究a -SMA在濾過泡周圍組織上的表達(dá)程度。如圖9所示，由于glucosamine可以有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖，在glucosamine凝膠劑組(圖9B是:Chol-Phe-Phe_Asp-glucosamine多肽凝膠；圖 9C 是:Chol-Phe-Phe_Asp (glucosamine)-glucosamine 支化糖妝凝膠；圖 9D 是:Chol_Phe-Phe-Asp (glucosamine)-Asp (glucosamine)-glucosamine 多支化糖妝凝膠；)中，兔眼的濾過泡周圍組織在術(shù)后14天內(nèi)只有極少量的a-SMA表達(dá)，說明注射糖肽凝膠的兔眼內(nèi)濾過泡無明顯的組織纖維化現(xiàn)象。而在只進行濾過手術(shù)組(圖9Α)中，兔眼的濾過泡周圍組織在術(shù)后第14天表達(dá)出大量的a -SMA。
[0031]實施例2
(I)含有良好生物相容性的疏水膽固醇(cholesterol, Chol)修飾的三肽Chol-Phe-Phe-Asp-OH 的制備
采用2-氯-三苯甲基氯樹脂(樹脂的有效氯取代度為1.08mmol/g)為固相載體，使用多肽固相自動合成儀制備膽固醇鍵接的短肽Chol-Phe-Phe-Asp (OtBu) -0H。肽鏈在樹脂上由碳端向氮端延長。具體的制備步驟如下:稱取2.0g 2-氯-三苯甲基氯樹脂(共有有效氯的量為2.0g X 1.08mmol/g= 2.16mmol，然后用15mL DMF浸泡樹脂I小時。抽去DMF，加入溶有 FMOC-Asp (OtBu)-OH(2 X 2.16mmol)和二異丙基乙胺(DIEA, 6 X 2.16mmol)的 15 mLDMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，用15 mL DMF洗滌樹脂三次，然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。抽去反應(yīng)液，用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 X 2.16mmol)、DIEA(6 X 2.16mmol)、苯并三氮唑-隊隊^-四甲基脲六氟磷酸鹽(冊?，2.4 X 2.16mmol)和1-羥基苯并三氮唑(H0Bt，2.4 X 2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。之后用15 mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 X 2.16mmol)、DIEA (6 X 2.16mmol)、苯并三氮唑-N，N, N’ N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，2.4 X 2.16mmol)和1-羥基苯并三氮唑(HOBt, 2.4X2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。之后用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有 Cholesteryl chi or o formate (2 X 2.1 Bmmol)和 DIEA (6 X 2.1 Bmmol )的 15 mLTHF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。整個肽鏈合成結(jié)束后，分別用15mL THF、15mLDMF、15mL CH3OH和15mL CH2Cl2各洗滌樹脂3次，真空干燥樹脂過夜。加入20mL切落劑(體積比5:5三氟乙酸和CH2Cl2將多肽從樹脂上切落，收集濾液并濃縮。然后加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品真空干燥過夜。此時Asp的側(cè)基OtBu已經(jīng)被切除,Cho1-Phe-Phe-Asp-OH含有兩個羧基能夠和兩分子的氨基葡萄糖反應(yīng),可用于制備支化的多肽功能糖肽。
[0032](2)多功能支化糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine)-glucosamine 的合成將上述制備的Chol-Phe-Phe-Asp-OH (0.5mmol )、N, N- 二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC,
1.2mmol)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，1.2mmol)溶于15mL重蒸的無水THF中，并在冰浴下攪拌6小時。然后抽濾除去沉淀，加入6mL溶有氨基葡萄糖鹽酸(4mmol)和NaHCO3(Smmol)的水溶液到濾液中并在室溫下攪拌24小時。旋蒸濃縮除去溶劑，然后將產(chǎn)品溶于少量的三氟乙酸中，并加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并用乙醚多次洗滌，室溫下真空干燥產(chǎn)品。用高效液相色譜(HPLC)分離純化產(chǎn)品(HPLC分離柱為C18型，含有0.1%氨水的乙腈和0.1%氨水的二次水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254nm)，結(jié)構(gòu)式見附圖7。
[0033]( 3 )支化糖肽水凝膠的制備
將糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine) -glucosamine 分散在憐酸緩沖溶液(PBS，pH=7.4)中，加熱至80°C使其充分溶解形成澄清溶液(濃度20mg/mL)。緩慢降低溫度至室溫時，糖肽可以自組裝形成穩(wěn)定的超分子水凝膠。
[0034]與實例I中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，實例2中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine) -glucosamine中天冬氨酸的側(cè)基上的羧基也被修飾上氨基葡萄糖，形成了支化的糖肽。此支化糖肽含有兩分子的氨基葡萄糖，增加了氨基葡萄糖的含量不僅有利于形成凝膠(增加氫鍵作用)而且提高了單位質(zhì)量內(nèi)有效氨基葡萄糖的含量。
[0035]實施例3
(I)含有良好生物相容性的疏水膽固醇(cholesterol, Chol)修飾的四肽Chol-Phe-Phe-Asp-Asp-OH 的制備
采用2-氯-三苯甲基氯樹脂(樹脂的有效氯取代度為1.08mmol/g)為固相載體，使用多肽固相自動合成儀制備膽固醇鍵接的短肽Chol-Phe-Phe-Asp (OtBu) -0H。肽鏈在樹脂上由碳端向氮端延長。具體的制備步驟如下:稱取2.0g 2-氯-三苯甲基氯樹脂(共有有效氯的量為2.0g X 1.08mmol/g= 2.16mmol，然后用15mL DMF浸泡樹脂I小時。抽去DMF，加入溶有 FMOC-Asp (OtBu)-OH(2 X 2.16mmol)和二異丙基乙胺(DIEA, 6 X 2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，用15 mL DMF洗滌樹脂三次，然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。抽去反應(yīng)液，用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FM0C_Asp (OtBu)-OH (2 X2.16mmol)、DIEA (6 X 2.16mmol )、苯并三氮唑-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，
2.4 X 2.16mmol)和 1-羥基苯并三氮唑(H0Bt，2.4 X 2.16mmol)的 15 mL DMF 溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。抽去反應(yīng)液，用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 X 2.16mmol)、DIEA(6X 2.16臟01)、苯并三氮唑-隊隊^-四甲基脲六氟磷酸鹽(!--，2.4 X 2.16mmol)和1-羥基苯并三氮唑(H0Bt，2.4 X 2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。之后用15 mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2 X 2.16mmol)、DIEA (6 X 2.16mmol)、苯并三氮唑-N，N, N’ N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，2.4 X 2.16mmol)和1-羥基苯并三氮唑(HOBt, 2.4X2.16mmol)的15 mL DMF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)1.5小時。抽去反應(yīng)液，之后用DMF洗滌樹脂3次。取少量樹脂做茚三酮顯色測試(顏色應(yīng)為無色或淺黃色)，若變色則重復(fù)此步反應(yīng)至顯色測試為無色。然后加入15 mL 20%哌啶/DMF (v/v)溶液到上一步的樹脂中，充分反應(yīng)脫去FMOC保護基。之后用15mL DMF洗滌樹脂三次后加入溶有 Cholesteryl chi or o formate (2 X 2.1 Bmmol)和 DIEA (6 X 2.1 Bmmol )的 15 mLTHF溶液到樹脂中，并在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。整個肽鏈合成結(jié)束后，分別用15mL THF、15mLDMF、15mL CH3OH和15mL CH2Cl2各洗滌樹脂3次，真空干燥樹脂過夜。加入20mL切落劑(體積比5:5的三氟乙酸和CH2Cl2將多肽從樹脂上切落，收集濾液并濃縮。然后加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品真空干燥過夜。此時Asp的側(cè)基OtBu已經(jīng)被切除，Chol-Phe-Phe-Asp-Asp-OH含有三分子羧基能夠和三分子的氨基葡萄糖反應(yīng),可用于制備多支化的功能糖肽。
[0036](2)多功能支化糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine) -Asp (glucosamine) -glucos am-1ne的合成
將上述制備的 Chol-Phe-Phe-Asp-Asp-OH (0.5mmol)、N, N- 二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC,
1.8mmol)以及N-輕基琥拍酰亞胺(NHS, 1.8mmol)溶于15mL重蒸的無水THF中，并在冰浴下攪拌6小時。然后抽濾除去沉淀，加入6mL溶有氨基葡萄糖鹽酸(6mmol)和NaHCO3(12mmol)的水溶液到濾液中并在室溫下攪拌24小時。旋蒸濃縮除去溶劑，然后將產(chǎn)品溶于少量的三氟乙酸中，并加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并用乙醚多次洗滌，室溫下真空干燥產(chǎn)品。用高效液相色譜(HPLC)分離純化產(chǎn)品(HPLC分離柱為C18型，含有0.1%氨水的乙腈和0.1%氨水的二次水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254nm)，結(jié)構(gòu)式見附圖8。
[0037](3)多支化糖肽水凝膠的制備將糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine)-Asp (glucosamine)-glucosamine 分散在磷酸緩沖溶液(PBS，pH=7.4)中，加熱至60°C使其充分溶解形成澄清溶液(濃度15mg/mL)。緩慢降低溫度至室溫時，糖肽可以自組裝形成穩(wěn)定的超分子水凝膠。與實例I中的糖肽Chol-Phe-Phe-Asp-glucosamine 相比，實例 3 中的糖妝 Chol-Phe-Phe-Asp (glucosamine)-Asp (glucosamine) -glucosamine兩個天冬氨酸的側(cè)基上的羧基也被修飾上氨基葡萄糖,形成了多支化的糖肽。此支化糖肽含有三分子的氨基葡萄糖，增加了氨基葡萄糖的含量不僅有利于形成凝膠(增加氫鍵作用)而且提高了單位質(zhì)量內(nèi)有效氨基葡萄糖的量。
【權(quán)利要求】
1.一種抗術(shù)后疤痕的多支化糖肽水凝膠的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)利用固相合成方法制備含有膽固醇作為疏水端的三肽或四肽，三肽的氨基酸序列為天冬氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸或苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，四肽的氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸； (2)通過使用不同的切落劑將合成的三肽或四肽從固相切落，得到含有一個、兩個或三個羧基的三肽或四肽； (3)純化的三肽或四肽與氨基葡萄糖進行縮合反應(yīng)得到多支化糖肽； (4)通過高效液相色譜法分離純化所制得的多支化多肽； (5)將多支化糖肽分散在磷酸鹽緩沖溶液中，通過加熱溶解-冷卻法制備得到多支化糖肽水凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，固相合成技術(shù)所采用的樹脂為2-氯-三苯甲基氯樹脂、Rink Amide樹脂或MBHA樹脂中的一種，肽鏈的延長為碳端到氮端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所用切落劑是體積比為I:2:7的醋酸、三氟乙醇和二氯甲烷時，天冬氨酸的側(cè)基保護基OtBu不會被切除，切下的肽鏈只含有碳端一個羧基；當(dāng)所用切落劑是體積比為5:5的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液時，天冬氨酸的側(cè)基保護基OtBu被切除，切下的肽鏈中的羧基包括碳端的羧基和側(cè)鏈的羧基，肽鏈含有一個天冬氨酸就有兩個羧基，肽鏈含有兩個天冬氨酸就有三個羧基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中高效液相色譜法分離純化多支化多肽的條件是=HPLC分離柱為C18柱，用含0.1% (v/v)NH40H的乙腈和含0.1% (v/v)NH4OH的去離子水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254 nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中合成多支化糖肽的縮合劑是N，N- 二環(huán)己基碳二亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中磷酸緩沖溶液的濃度為10mM, pH 為 7.4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，通過加熱溶解-冷卻法制備糖肽水凝膠時，先把多支化糖肽加熱到60-80°C使糖肽完全溶解，隨后靜置冷卻到室溫形成水凝膠。
8.權(quán)利要求Γ7中任一種方法所制備的多支化糖肽水凝膠。
9.權(quán)利要求8所述的多支化糖肽水凝膠在制備術(shù)后疤痕抑制劑上的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K9/06GK104311641SQ201410365194
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】張先正, 陳巍海, 曾旋, 馮俊 申請人:武漢拜爾默生物科技有限公司