西地那非在制備治療抗血管瘤的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了西地那非的一種新用途——在制備治療抗血管瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人在對(duì)血管瘤的研究中，偶然發(fā)現(xiàn)西地那非對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(血管瘤的主要細(xì)胞成分)的增殖具有顯著的抑制作用，對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡具有顯著的促進(jìn)作用。因此，西地那非可以作為治療血管瘤的有效藥物，可以用于制備治療抗血管瘤的藥物。具體應(yīng)用時(shí)，可以直接將西地那非作為治療藥物用于治療血管瘤，治療方式為口服。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了西地那非的新用途——用于治療血管瘤，屬于老藥新用，該用途是偶然發(fā)現(xiàn)的，該發(fā)現(xiàn)是非顯而易見的，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。
【專利說明】西地那非在制備治療抗血管瘤的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及西地那非在制備治療抗血管瘤的藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]血管瘤(infantile hemang1mas)是嬰幼兒最常見的良性腫瘤,絕大多數(shù)在出生時(shí)或出生后不久發(fā)現(xiàn)，根據(jù)病變發(fā)展過程可分為增生期、消退期、消退完成期。血管瘤的治療方法主要有藥物治療、激光治療及手術(shù)治療、冷凍治療、硬化治療等。藥物治療是一種易行有效的方法，可促使血管瘤早期消退而達(dá)到治療目的。治療血管瘤的藥物有多種，臨床上通常根據(jù)血管瘤部位、大小、分期、功能影響以及醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)等因素，制定個(gè)體化治療方案。目前國內(nèi)外治療血管瘤的常用藥物有以下種類:1.β_腎上腺素受體阻滯劑，以普萘洛爾(Propranolol)為主,是目前治療血管瘤的一線藥物。2.皮質(zhì)類固醇激素，以潑尼松(Prednisolone)為主。3.平陽霉素 / 博來霉素(Pingyangmycin/Bleomycin)。4.其它:α-干擾素(IFN-α)、咪喹莫特(Imiquimod)、抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺(CTX)、長春新堿(VCR)
坐寸ο
[0003]西地那非(英文名Sildenafil，商品名偉哥、萬艾可、viagra)，最早是作為一個(gè)用于治療心血管疾病的5-磷酸二酯酶抑制藥而進(jìn)入臨床研究的，是一種環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)特異的5型磷酸二酯酶(PDE5)的選擇性抑制劑。西地那非是一種治療陰莖勃起功能障礙的藥物，陰莖勃起功能障礙的主要原因是陰莖海綿體供血不足，可能與缺少一氧化氮(NO)有關(guān)。NO可使鳥苷酸環(huán)化酶(GC)活化，在活化的GC作用下，鳥苷酸(GTP)轉(zhuǎn)變成環(huán)鳥苷酸(cGMP) ；cGMP可被磷酸二脂酶(I3DE)降解為5 ^ -cGMP，后者無生物學(xué)效應(yīng)，而cGMP則可引起陰莖海綿體平滑肌血管舒張，使陰莖迅速充血而勃起。
[0004]根據(jù)本發(fā)明人的檢索，現(xiàn)有技術(shù)中存在關(guān)于西地那非增強(qiáng)某些類型的惡性腫瘤化療效果的報(bào)道，但未見西地那非在良性腫瘤治療中的文獻(xiàn)報(bào)道，更未見西地那非在治療血管瘤中的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了西地那非的一種新用途——在制備治療抗血管瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明的發(fā)明人在對(duì)血管瘤的研究中，偶然發(fā)現(xiàn)西地那非對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(血管瘤的主要細(xì)胞成分)的增殖具有顯著的抑制作用，對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡具有顯著的促進(jìn)作用。因此，西地那非可以作為治療血管瘤的有效藥物，可以用于制備治療抗血管瘤的藥物。
[0008]具體應(yīng)用時(shí),可以直接將西地那非作為治療藥物用于治療血管瘤,治療方式為口服。
[0009]具體應(yīng)用時(shí)，還可以以西地那非為活性成分，與藥劑學(xué)上可接受的載體、基質(zhì)或/輔料混合制成藥物劑型。
[0010]具體應(yīng)用時(shí)，還可以將西地那非與其他治療血管瘤的藥物聯(lián)合應(yīng)用，以用于治療血管瘤；所述治療血管瘤的藥物優(yōu)選普萘洛爾。
[0011]所述聯(lián)合應(yīng)用，是指將西地那非與其他治療血管瘤的藥物同時(shí)用藥，或先后用藥(西地那非先用藥或后用藥均可)。
[0012]本發(fā)明還提供了一種用于治療血管瘤的藥劑，是由西地那非組成的，或:是由西地那非與至少一種藥劑學(xué)上可接受的載體、基質(zhì)或/輔料混合組成的。
[0013]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了西地那非的新用途——用于治療血管瘤，屬于老藥新用，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過其原有用途(陰莖勃起功能障礙、治療心血管疾病)無法合理推測或預(yù)測到該新用途(這個(gè)新用途跟治療陰莖勃起功能障礙沒有直接聯(lián)系)，該用途是偶然發(fā)現(xiàn)的，該發(fā)現(xiàn)是非顯而易見的，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:血管瘤組織切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示意圖(PDE5陽性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞)，20X。
[0015]圖2:培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示意圖(TOE5免疫化學(xué)染色陽性)，400X。
[0016]圖3:血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后的MTT染色示意圖，200X。
[0017]圖4:濃度為5uM的西地那非作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后的MTT染色示意圖，200 X。
[0018]圖5:淋巴管瘤組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示意圖(Η)Ε5表達(dá)陰性)，100X。
[0019]圖6:淋巴管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后的MTT染色示意圖，100X。
[0020]圖7:濃度為5uM的西地那非作用于淋巴管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后的MTT染色示意圖，100X。
[0021]圖8:正常培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長示意圖，200 X。
[0022]圖9:在普萘洛爾作用下的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長示意圖，200X。
[0023]圖10:在西地那非和普萘洛爾作用下的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長示意圖，200X。
[0024] 圖11:裸鼠血管瘤注射西地那非后，生長受到顯著抑制的示意圖，其中，A:注射西地那非10天后，血管瘤的外面觀；B:注射生理鹽水10天后，血管瘤的外面觀；C:注射西地那非10天后，從裸鼠體內(nèi)解剖出來的血管瘤；D:注射生理鹽水10天后，從裸鼠體內(nèi)解剖出來的血管瘤。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0026]下述方法中，未詳盡描述的試劑、實(shí)驗(yàn)操作、方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑、實(shí)驗(yàn)操作、方法等。
[0027]實(shí)施例1西地那非對(duì)血管瘤的抑制作用
[0028](一)用免疫組織化學(xué)染色方法，檢測磷酸二脂酶5(PDE5)在血管瘤組織中的表達(dá)
[0029]1.組織的獲取及處理:隨機(jī)選取10例經(jīng)病理確診的血管瘤組織標(biāo)本。
[0030]2.脫蠟和水化:石蠟包埋的2 - 3μπι連續(xù)切片，裝在載玻片，切片置于70°C烤箱中烘烤40分鐘后依次浸泡入以下液體:二甲苯I (20min) — 二甲苯II (20min)—無水乙醇(5minX2 次)一95% 乙醇(5minX2 次)一90% 乙醇(5min) —80% 乙醇(5min)。PBS 洗5minX 2次,雙蒸水洗5minX I次。
[0031]3.3% H2O2與10%甲醇等體積混合液滴加在組織切片上，室溫靜置10分鐘，滅活內(nèi)源性酶。PBS洗5minX2次，雙蒸水洗5minX I次。
[0032]4.抗原修復(fù):抗原修復(fù)液(枸櫞酸緩沖液，PH6.0)微波高火達(dá)95°C，放入切片，改中高火12min，暴露抗原。雙蒸水洗5minXl次，PBS洗5minX2次。
[0033]5.室溫下，滴加10%羊血清封閉20分鐘，甩干勿洗。
[0034]6.分別滴加 PDE5(1:100) —抗 50μ1，濕盒內(nèi) 4°C過夜。PBS 洗 5minX3 次。
[0035]7.滴加二抗兔鼠通用(ready-to-use)45-50y 1，37°C，30min。PBS 洗 5minX3 次。
[0036]8.DAB顯色0.5_3min，鏡下觀察，掌握染色程度，雙蒸水隨時(shí)終止反應(yīng)。PBS沖洗10分鐘。蘇木素復(fù)染5分鐘、鹽酸酒精分化、雙蒸水沖洗15分鐘。
[0037]9.脫水、透明:80% 乙醇(5min) —95% 乙醇(5min) — 100% 乙醇(5min) — 100%乙醇(5min) — 二甲苯 I (5min) — 二甲苯 II (5min)。
[0038]10.封片:滴加少許中性樹膠，加蓋玻片，自然晾干。倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0039]結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，磷酸二脂酶5(PDE5)在血管瘤組織中具有極強(qiáng)的表達(dá)(roE5免疫化學(xué)染色陽性)。
[0040]( 二)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法，檢測TOE5在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)
[0041]1.標(biāo)本來源外科手術(shù)切除的新鮮嬰幼兒血管瘤標(biāo)本。
[0042]2.試劑EBM2 (Lonza公司)，胰蛋白酶、青霉素+鏈霉素、Gibco胎牛血清(Invitrogen 公司)。
[0043]3.組織塊法培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemECs)將手術(shù)切除的新鮮血管瘤組織置于無血清EBM2培養(yǎng)液中，用PBS將血管瘤標(biāo)本的凝血塊和壞死組織沖洗干凈，至肉眼觀察沖洗液顏色清亮，無渾濁及脫落組織；用眼科剪和鑷去除多余的皮膚及脂肪，選擇瘤體組織，適當(dāng)修剪成I~2cm3的組織塊，加入0.25%胰蛋白酶，37°C水浴箱中振蕩消化lOmin，加入含10%胎牛血清(fetalbo vine ser um, FBS)等體積的EBM2培養(yǎng)液中止消化；將消化后的組織塊修剪成Imm3大小，接種于事先用I %明膠包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，孵箱內(nèi)倒置lOmin。然后加入0.5mL完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(成分為EBM2培養(yǎng)基、10% FBS、10IU/L青霉素、10mg/L鏈霉素)，僅使培養(yǎng)液剛剛濕潤組織塊，勿使組織塊浮起，放入孵箱內(nèi)；24h后補(bǔ)充2mL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液緩慢浸潤組織塊，置孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；接種后每日觀察細(xì)胞爬出情況，約I周去除組織塊，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)；每3d更換培養(yǎng)液I次；細(xì)胞匯合成片鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)按1:3比例傳代培養(yǎng)。
[0044]4.按照上述免疫組織化學(xué)法的步驟5-10，檢測培養(yǎng)細(xì)胞中TOE5的表達(dá)。
[0045]結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，磷酸二脂酶5 (PDE5)在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中均具有極強(qiáng)的表達(dá)。
[0046](三)西地那非抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)
[0047]細(xì)胞傳代至第3至第6代時(shí)，消化并重新計(jì)數(shù)細(xì)胞，按5000個(gè)細(xì)胞/孔，接種于96孔板，培養(yǎng)基為完全EBM-2培養(yǎng)基；用培養(yǎng)基補(bǔ)足100 μ L，混勻，使細(xì)胞均勻地分布于96孔板底，邊緣孔用PBS填充。24h后培養(yǎng)基換成不含血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵箱培育。24h后加入5μ M的西地那非，繼續(xù)孵箱培育。于加藥后第24h，加入20 μ L MTT(5mg/mL)，染色，觀察，同時(shí)，以不加西地那非為對(duì)照組。繼續(xù)孵箱培育4h。去除培養(yǎng)液，加150 μ I/孔DMSO，37°C搖床15min。測OD值:用酶標(biāo)儀測490nm處OD值。采用單因素方差分析，重復(fù)至少3次實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果取其均值。
[0048]結(jié)果如圖3、圖4所示。由圖3、圖4可知，加入5uM西地那非后，細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)重抑制，抑制率為40% (抑制率=陰性對(duì)照OD均值一加藥孔OD均值/陰性對(duì)照OD均值)，細(xì)胞的凋亡顯著增強(qiáng)。
[0049](四)在臨床上與血管瘤關(guān)系最密切、最容易混淆的另一種良性病變是淋巴管瘤(lymphang1ma)。本實(shí)驗(yàn)以淋巴管瘤為對(duì)照，對(duì)淋巴管瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(染色方法與血管瘤組織相同)，與上述人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，淋巴管瘤組織中，PDE5無表達(dá)(TOE5表達(dá)陰性)。
[0050]向淋巴管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入有效濃度的西地那非(經(jīng)過對(duì)藥物多種濃度的篩選確定有效終濃度為5uM)，培養(yǎng)24小時(shí)，MTT染色，觀察，同時(shí)，以不加西地那非為對(duì)照組。結(jié)果如圖6、圖7所示。由圖6、圖7可以發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞的生長沒有受到影響。
[0051](五)普萘洛爾是治療血管瘤的主要藥物，西地那非可以顯著增強(qiáng)普萘洛爾對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用:
[0052]血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞傳代至第3至第6代時(shí)，消化、計(jì)數(shù)，按5000個(gè)細(xì)胞/孔，接種于96孔板，培養(yǎng)基為完全EBM-2培養(yǎng)基；用培養(yǎng)基補(bǔ)足100 μ L，混勻，使細(xì)胞均勻地分布于96孔板底，邊緣孔用PBS填充。24h后培養(yǎng)基換成不含血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵箱培育，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，如圖8所示。一組細(xì)胞加入終濃度為10 μ M的普萘洛爾，繼續(xù)孵箱培育，于加藥后第24h，觀察細(xì)胞生長情況。如圖9所示，由圖9可見，在普萘洛爾作用下，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞皺縮、生長受到明顯的抑制。另一組細(xì)胞加入濃度10 μ M的普萘洛爾和西地那非(終濃度為5 μ Μ)，觀察細(xì)胞生長情況，如圖10所示，由圖10可見，西地那非聯(lián)合普萘洛爾對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的抑制作用，比單純普萘洛爾更加顯著。
[0053](六)在血管瘤的動(dòng)物模型上，瘤體內(nèi)注射微量西地那非后，血管瘤消退顯著
[0054]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c nu/nu裸小鼠(簡稱為裸鼠)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，隔離器屏障環(huán)境(SPF)級(jí)別環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用裸鼠共6只，雌雄不限，鼠齡(28 ±3.2)d，體重(20.5 ±2.Dg0
[0055]胰蛋白酶消化收集第3代HemEC,以107cells/mL密度重懸于完全培養(yǎng)液中，以200 μ L/部位注射至裸鼠雙側(cè)腋窩皮下。
[0056]第40d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組于瘤內(nèi)多點(diǎn)注射5 μ M西地那非0.1毫升(該體積基本將瘤體打滿)，連續(xù)注射7d。對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。
[0057] 從第一次開始注射西地那非第10天時(shí)，亦即向裸鼠體內(nèi)注射血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的第50天，觀察裸鼠腫瘤生長的情況，以及處死裸鼠后對(duì)解剖出的腫瘤進(jìn)行體積、色澤、質(zhì)地等方面進(jìn)行檢查。結(jié)果如圖11所示，由圖可見，第50天時(shí)，觀察到生理鹽水組瘤體體積約為5mmX3mmX2mm,瘤體在皮下不可移動(dòng),表面皮膚與周圍相比顏色較紅,質(zhì)硬；切開皮膚可見瘤體位于皮下，由大量裸鼠皮下組織包裹，分離解剖見瘤體約5_X3_X2mm，呈鮮紅色，質(zhì)軟。；西地那非組瘤體約2mmX3mmX2mm大小，瘤體在皮下不可移動(dòng)，表面皮膚顏色與周圍無異，質(zhì)硬；切開皮膚可見瘤體位于皮下，被裸鼠皮下組織包裹，分離解剖見瘤體約2mmX 3mmX 2mm,呈乳白色，質(zhì)硬。
[0058]綜合以上實(shí)驗(yàn)的結(jié)果、結(jié)論，可以確信，西地那非是治療血管瘤的有效藥物。
【權(quán)利要求】
1.西地那非在制備治療抗血管瘤的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用時(shí)，直接將西地那非作為治療藥物用于治療血管瘤，治療方式為口服。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用時(shí)，以西地那非為活性成分，與藥劑學(xué)上可接受的載體、基質(zhì)或/輔料混合制成藥物劑型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用時(shí)，將西地那非與其他治療血管瘤的藥物聯(lián)合應(yīng)用，以用于治療血管瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述治療血管瘤的藥物為普萘洛爾。
6.一種用于治療血管瘤的藥劑，其特征在于:是由西地那非組成的，或:是由西地那非與至少一種藥劑學(xué)上可接受的 載體、基質(zhì)或/輔料混合組成的。
【文檔編號(hào)】A61K31/138GK104069113SQ201410322411
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】劉少華, 劉怡然, 和曉坡, 來慶國, 董立新 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院