一種用于刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境修復(fù)的芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一株芽孢桿菌(Bacillus?sp.)A1，已于2014年01月06日保藏位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏號(hào)為CGMCCNo.8686。本發(fā)明提供的菌株為從養(yǎng)殖水體直接分離篩選得到的土著菌，故將其擴(kuò)大培養(yǎng)再應(yīng)用至刺參養(yǎng)殖池塘對(duì)刺參本身及環(huán)境生態(tài)潛在的暴發(fā)性危害性較低。本發(fā)明提供的菌株經(jīng)過(guò)低溫篩選，有機(jī)降解能力篩選，最終得到目標(biāo)菌株，所得目標(biāo)菌株在低溫下生長(zhǎng)良好，對(duì)于餌料中的氨氮及COD降解能力均較強(qiáng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境修復(fù)的芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)有益微生物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境修復(fù)的芽孢桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]刺參(Apostichopus japonicus Selenka)養(yǎng)殖業(yè)是一新興海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，自2002年以來(lái)，刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，2006年全國(guó)刺參養(yǎng)殖面積已達(dá)到8.4萬(wàn)公頃，產(chǎn)量達(dá)到7.6萬(wàn)噸，產(chǎn)值接近100億元。然而，隨著其迅速發(fā)展的養(yǎng)殖規(guī)模，相關(guān)問(wèn)題也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。由于目前大部分刺參養(yǎng)殖主要依靠投喂人工飼料，飼料粘著性差，池底還專(zhuān)門(mén)設(shè)置了大量的人工附著基，因此在養(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量殘餌、糞便的殘留。這些有機(jī)污染物不僅對(duì)刺參生長(zhǎng)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，而且會(huì)直接危害刺參的健康生長(zhǎng)導(dǎo)致病害的發(fā)生，嚴(yán)重阻礙了刺參養(yǎng)殖業(yè)甚至整個(gè)水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，殘餌和排泄物在養(yǎng)殖環(huán)境中特別是在底質(zhì)中堆積，成為水體污染的最重要內(nèi)源，它們會(huì)不斷向養(yǎng)殖環(huán)境中釋放N、P營(yíng)養(yǎng)鹽和可溶性有機(jī)污染物，導(dǎo)致水質(zhì)敗壞，耗氧量增加，浮游植物、底棲生物多樣性減少，以至于水華或赤潮的發(fā)生。
[0004]而針對(duì)病害頻繁難免需要用藥，各種抗生素如磺胺類(lèi)、四環(huán)素、青霉素、呋喃類(lèi)等，結(jié)果導(dǎo)致養(yǎng)殖上的二次污染 ，產(chǎn)生很多的負(fù)面效應(yīng)，如投入的藥物大部分都直接散失到環(huán)境中，直接污染環(huán)境以致最終對(duì)臨近水域構(gòu)成危害。
[0005]降解微生物作為地球生態(tài)系統(tǒng)中最重要的分解者之一，在污染物的降解轉(zhuǎn)化方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。從80年代開(kāi)始，微生物在環(huán)境污染修復(fù)治理方面的研究越來(lái)越多，人們己將其廣泛應(yīng)用于各污染領(lǐng)域，如在重金屬污染、溢油污染、農(nóng)藥殘留、生活廢水處理等很多方面。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展及出現(xiàn)的一系列環(huán)境污染問(wèn)題，降解微生物在此領(lǐng)域的應(yīng)用研究已引起人們的廣泛重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種芽孢桿菌，即一株能夠在低溫條件下凈化水質(zhì)的芽孢桿菌菌株，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0007]本發(fā)明提供一株芽孢桿菌(Bacillus sp.) Al，已于2014年01月06日保藏位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.8686。
[0008]所篩選的芽孢桿菌用于養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的凈化；
[0009]所述的養(yǎng)殖池塘優(yōu)選為刺參的養(yǎng)殖池塘；
[0010]本發(fā)明篩選的芽孢桿菌還可用作免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑；
[0011 ] 所述的飼料優(yōu)選為刺參飼料；
[0012]另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供利用上述芽孢桿菌發(fā)酵制成的微生物菌液。
[0013]本發(fā)明的菌用于修復(fù)刺參養(yǎng)殖水環(huán)境比起其它方式的有益之處在于:[0014]1、相較于化學(xué)手段，利用自然界中本來(lái)存在的菌株對(duì)環(huán)境進(jìn)行修復(fù)，減少了化學(xué)物質(zhì)在水環(huán)境中的殘留，使養(yǎng)殖水環(huán)境能得到可持續(xù)利用。
[0015]2、本發(fā)的提供的菌株為從養(yǎng)殖水體直接分離篩選得到的土著菌，故將其擴(kuò)大培養(yǎng)再應(yīng)用至刺參養(yǎng)殖池塘對(duì)刺參本身及環(huán)境生態(tài)潛在的暴發(fā)性危害性較低。
[0016]3、本發(fā)明提供的菌株經(jīng)過(guò)低溫篩選，有機(jī)降解能力篩選，最終得到目標(biāo)菌株，所得目標(biāo)菌株在低溫下生長(zhǎng)良好，對(duì)于餌料中的氨氮及COD降解能力均較強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]雖然對(duì)于微生物修復(fù)環(huán)境的研究比較多，但將微生物用于凈化刺參池塘水環(huán)境的研究報(bào)道極少。另一方面，刺參生長(zhǎng)溫度條件為低溫，超過(guò)24°C刺參便逐漸進(jìn)入夏眠，刺參適宜生長(zhǎng)溫度為12-20°C，最適溫度為17°C _18°C，故提供一株在低溫條件下凈化水質(zhì)的菌株對(duì)于刺參池塘養(yǎng)殖池塘水質(zhì)凈化具有十分重要的實(shí)踐意義。
[0018]本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基等物質(zhì)的配比如下:
[0019]1、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板:
[0020]將配制的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，牛肉膏3_5g/L，海水1L)，于121°C下滅菌15min。將滅菌后的培養(yǎng)基，倒于滅菌的平板，冷卻后備用。
[0021]2、滅菌餌料液體培養(yǎng)基:
[0022]稱取20g刺參餌料，于1000mL滅菌海水中浸泡過(guò)夜。將餌料浸潰液過(guò)濾，于濾液中加入2g牛肉膏，再用海水稀釋至1000mL,將其分裝至10個(gè)滅菌錐形瓶?jī)?nèi)，每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)150mL，剩余培養(yǎng)基裝于錐形瓶中，于121°C下滅菌15min，冷卻備用。
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0024]一、菌株的篩選
[0025]1、樣品采集
[0026]1.1制定采集方案
[0027]在采集之前查找擬采集樣品現(xiàn)有的有關(guān)地理學(xué)、生態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性等數(shù)據(jù)資料，根據(jù)掌握的資料制定采集方案。
[0028]1.2采集準(zhǔn)備
[0029]根據(jù)制定的采集方案，確定采集池塘、采集時(shí)間及采集樣品。并作好采集人員、采集工具、采集車(chē)輛等的安排。采集工具預(yù)先于121°C下滅菌15min。
[0030]1.3現(xiàn)場(chǎng)采集
[0031]池塘選取了即墨鹽廠的刺參養(yǎng)殖池塘，采樣時(shí)，分別于池塘中四個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采樣。采集樣品范圍選擇池塘底泥，養(yǎng)殖動(dòng)物，植物，水體，附著基等。記錄采樣池塘水文條件如溫度，PH值，鹽度等。現(xiàn)場(chǎng)采集過(guò)程中注意無(wú)菌操作。用一次性無(wú)菌手套，將底泥、養(yǎng)殖動(dòng)物與植物裝于無(wú)菌的樣品袋中，用無(wú)菌樣品瓶從設(shè)定位置灌裝定量的水體。
[0032]2、芽孢桿菌篩選
[0033]2.1樣品預(yù)處理
[0034] 根據(jù)樣品的物理狀態(tài)進(jìn)行處理。將采集的樣品池塘底泥、養(yǎng)殖動(dòng)物、植物、水體、附著基等，用滅菌生理鹽水10倍稀釋后研磨打勻取上清液，得到樣品儲(chǔ)備液。液體樣不做預(yù)處理。[0035]2.2芽孢桿菌分離
[0036]將樣品儲(chǔ)備液經(jīng)80°C水浴IOmin后，用滅菌生理鹽水10倍梯度稀釋至適宜的濃度。具體稀釋方法按GB4789.2-2010的規(guī)定。將每一份樣品稀釋液作兩份接種，采用平板涂布的方法接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C下培養(yǎng)24h。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制方法按GB/T4789.28-2003 的規(guī)定。
[0037]2.3芽孢桿菌純化
[0038]將營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好的、用肉眼觀察菌落有差異的單菌落分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于28°C下培養(yǎng)24h。經(jīng)多次劃線純化，獲得單菌株。
[0039]3、芽孢桿菌二次篩選及鑒定
[0040]篩選前的準(zhǔn)備工作:
[0041]滅菌餌料液體培養(yǎng)基
[0042]稱取20g刺參餌料，于1000mL滅菌海水中浸泡過(guò)夜。將餌料浸潰液過(guò)濾，于濾液中加入2g牛肉膏，再用海水稀釋至1000mL,將其分裝至5個(gè)滅菌錐形瓶?jī)?nèi)，每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)150mL，剩余培養(yǎng)基裝于錐形瓶中，于121°C下滅菌15min，冷卻備用。
[0043]3.1芽孢桿菌的低溫篩選 [0044]將一次篩選得到的芽孢桿菌劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，于17°C下培養(yǎng)一周后，選擇有明顯生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0045]3.2芽孢桿菌的有機(jī)物降解能力篩選
[0046]將一次篩選得到的芽孢菌株，用接種針挑一個(gè)單菌落，接種于標(biāo)記的滅菌的錐形瓶中，17°C、160r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5d后,取樣于5000r/min離心10min后取上清,測(cè)定上清液 COD、NH4-N 的含量。用 100X (1-C0D5/C0D0) %U00X (1-NH4-N5/NH4-N0) Y0 分別表示各菌株對(duì)刺參餌料中有機(jī)污染物和氨氮的5d的降解率。根據(jù)細(xì)菌利用刺參餌料的能力，即菌株對(duì)刺參餌料中C0D、氨氮的去除效果進(jìn)行權(quán)衡，篩選降解效果好的菌株進(jìn)行研究。最終篩選得到一株菌，培養(yǎng)5d后其COD及氨氮降解效果最優(yōu)，降解率分別為69.5%與61.7%。
[0047]3.3菌株Al的潛在致病性檢測(cè)
[0048]利用血平板(購(gòu)于濟(jì)南百博生物技術(shù)有限責(zé)任公司)檢測(cè)菌株有無(wú)潛在的致病性，以驗(yàn)證菌株是否為病原菌。用無(wú)菌牙簽分別挑取菌株Al單菌落點(diǎn)種于血平板，然后置于17°C、恒溫培養(yǎng)24~72h后觀測(cè)無(wú)溶血圈。說(shuō)明菌株Al無(wú)致病性，可以用于經(jīng)濟(jì)生物養(yǎng)殖池塘投放，以及作為經(jīng)濟(jì)生物的飼料添加劑。
[0049]3.4芽孢桿菌的鑒定
[0050]PCR模板DNA的制備:
[0051]基因組DNA采用水煮法提取。菌株經(jīng)活化后挑取單一菌落于50 μ I無(wú)菌蒸餾水中，于100°C沸水浴中蒸煮5-10min，離心取上清液作為PCR模板DNA。
[0052]菌株的16SrDNA序列的測(cè)定:
[0053]16SrDNA擴(kuò)增引物為細(xì)菌16SrDNA通用引物，正向引物:5' -AGAGTT TGA TCC TGGCTC AG-3 ' (27F)，反向引物:5 ' -TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ' (1492R)。按照PCR體系(牛宇峰等，2009)對(duì)菌株進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物(1.5kb左右)經(jīng)電泳檢測(cè)后送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化與測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用Blast軟件與GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中的相關(guān)屬種的16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)，將菌株鑒定到屬或種。
[0054]現(xiàn)在菌株已于2014年I月6日保藏位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCN0.8686。
[0055]二、篩選菌株的低溫下的降解應(yīng)用
[0056]1、芽孢桿菌的活化培養(yǎng)
[0057]將保藏編號(hào)為CGMCCN0.8686的黃桿菌Al與其它保存的菌株A2~A7及市面上的菌株A8共8株芽孢桿菌(分別編號(hào)為Al，A2, A3, A4, A5, A6，A7，A8)接種于富集培養(yǎng)基上280C 160rpm條件活化后，再劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，于28°C下培養(yǎng)24h。
[0058]2、篩選菌株低溫下降解能力檢測(cè)
[0059]實(shí)施例1:
[0060]將用接種針挑一個(gè)單菌落，分別接種于Al、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8標(biāo)記的相應(yīng)滅菌的錐形瓶中，兩個(gè)錐形瓶不接種作為空白。將所有錐形瓶置于28°C、160r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5d后。分別從相應(yīng)錐形瓶取樣于5000r/min離心10min后取上清，測(cè)定上清液COD、NH4-N 的含量。用 100X (1-C0D5/C0D0) % UOOX (1-NH4-N5/NH4-N0) %分別表示各菌株對(duì)刺參餌料中有機(jī)污染物和氨氮的5d的降解率。具體數(shù)值如下表所示。
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種芽孢桿菌，其特征在于，所述的芽孢桿菌額保藏編號(hào)為CGMCC N0.8686。
2.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌，其特征在于，所述的芽孢桿菌為從養(yǎng)殖水體直接分離篩選得到的。
3.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌在養(yǎng)殖池塘水質(zhì)凈化中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的養(yǎng)殖池塘為刺參養(yǎng)殖池塘。
5.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌在制備免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑中的應(yīng)用。
6.一種免疫增強(qiáng)劑，其特征在于，所述的免疫增強(qiáng)劑包含有權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌的活菌。
7.—種飼料添加劑，其特征在于，所述的飼料添加劑包含有權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌的活菌。
8.如權(quán)利要 求7所述的飼料添加劑，其特征在于，所述的飼料為刺參飼料。
【文檔編號(hào)】A61K35/74GK104004695SQ201410277400
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】宋愛(ài)環(huán), 辛美麗, 劉元文, 鄒琰, 王英俊, 孫福新 申請(qǐng)人:山東省海洋生物研究院