Toll作用蛋白（Tollip）在腦卒中疾病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種Toll作用蛋白(Toll-interactingprotein，Tollip)基因在腦卒中疾病中的功能和應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以Tollip基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，結(jié)果表明與野生型對照小鼠對比，Tollip基因敲除小鼠腦袋梗死體積明顯減少，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，腦袋死亡的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少。從而發(fā)現(xiàn)Tollip基因能夠促進(jìn)惡化神經(jīng)系統(tǒng)并加重促進(jìn)腦卒中的發(fā)生發(fā)展，Tollip可作為藥物靶標(biāo)篩選治療腦卒中的藥物，Tollip的抑制劑可用于制備治療腦卒中的藥物。
【專利說明】Tol I作用蛋白(Tol I ip)在腦卒中疾病中的應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種Toll作用蛋白(Tollip)在腦卒中疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]缺血性腦卒中目前是全球第四大致死因素及第二大致殘因素，其發(fā)后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷，對患者的生命和健康造成嚴(yán)重危害。神經(jīng)元細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成部分，但其高代謝率降低了對缺血缺氧環(huán)境的耐受能力，因此較其他神經(jīng)血管元件組分更易受到損傷。目前組織纖溶酶原激活劑(tPA)纖溶的治療仍是缺血性腦卒中的主要治療手段，但其僅4.5小時(shí)長的時(shí)間窗限制大部分患者只能接受對癥治療。研究表明，神經(jīng)元保護(hù)策略可以在腦缺血損傷后較長時(shí)間內(nèi)改善大腦功能，減少神經(jīng)元細(xì)胞損失。凋亡是大腦缺血/再灌注過程中細(xì)胞死亡的基本機(jī)制之一，但其調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。因此，研究大腦缺血/再灌注時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡生存的分子機(jī)制，將有助于為神經(jīng)元保護(hù)提供新的治療策略和方法。
[0004]多數(shù)研究認(rèn)為，恢復(fù)腦組織供血是治療腦缺血最有效的方法。盡管1996年起組織纖溶酶原激活劑(tPA)即批準(zhǔn)用于缺血性腦卒中治療，迄今為止其仍然是美國藥監(jiān)局(FDA)唯一審核通過的溶栓藥物。因?yàn)殡S時(shí)間延長出血風(fēng)險(xiǎn)增加，tPA的治療時(shí)間窗僅為 4.5小時(shí)；考慮到缺血性和出血性腦卒中在早期影像學(xué)不易鑒別，進(jìn)一步延誤了患者接受tPA治療的機(jī)會(huì)。目前只有小于5%的缺血性腦卒中患者使用tPA溶栓治療。此外,研究發(fā)現(xiàn)腦組織如果長時(shí)間嚴(yán)重缺血缺氧，即使在后期恢復(fù)腦血流仍會(huì)對腦組織造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，因此當(dāng)前仍迫切需要研究針對缺血缺氧和(或)再灌注所致病理生理學(xué)事件的治療策略。自20世紀(jì)90年代以來，研究保護(hù)神經(jīng)和腦組織的治療策略一直是腦卒中治療的熱點(diǎn)，這些策略不僅可以延長tPA的治療時(shí)間窗，也可以減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的腦組織損傷。多種神經(jīng)保護(hù)藥物已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了令人振奮的結(jié)果，但是進(jìn)入腦卒中3期臨床實(shí)驗(yàn)后，絕大部分藥物均未取得預(yù)期效果，其首要失敗的原因之一是大部分已知神經(jīng)保護(hù)機(jī)制作用于在卒中后4-6小時(shí)以內(nèi)，而臨床實(shí)踐中很難在如此短暫的時(shí)間窗內(nèi)實(shí)施治療，因此進(jìn)一步闡明卒中發(fā)生后較長一段時(shí)間內(nèi)促進(jìn)或保護(hù)腦組織損傷的分子機(jī)制對于研究有效的卒中治療靶點(diǎn)或者策略具有重要意義。
[0005]Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的信號通路已被證實(shí)在天然免疫中發(fā)揮重要的作用，TLR被激活時(shí)，TLRs通過白介素I受體(IL-1R)招募胞漿蛋白MyD88，反過來又與IL-1R相關(guān)激酶(IRAK)作用，激活下游的相關(guān)信號通路。TLRs信號通路的激活是一把雙刃劍:一方面可以通過刺激天然免疫應(yīng)答和提高獲得性免疫反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體，另一方面它所引起的持續(xù)性免疫反應(yīng)也會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生損傷。慢性炎癥，感染性疾病以及腫瘤都與之相關(guān)。近期的研究表明，一些心血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、心肌重構(gòu))的發(fā)生發(fā)展也與TLRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)(Xu XH et al.Toll-like receptor-4 is expressed by macrophagesin murine and human lipid-rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidizedldl.Circulation (2001);104:3103-8; Topkara VK et al.Therapeutic targeting ofinnate immunity in the failing heart.J Mol Cell Cardiol (2011) ; 51:594-9.X Toll作用蛋白(Toll — interacting protein, Tollip)作為TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,通過下調(diào)TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)，從而在炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控中具有重要作用(Zhang G et al.Negative regulation of toll like receptor mediated signaling byTollip.J Biol Chem (2002) ; 277: 7059 — 65)。我們已有研究證實(shí) Tollip 同 AKT 作用抑制下游的信號通路，負(fù)性調(diào)節(jié)主動(dòng)脈縮窄引起的心肌重構(gòu)，從而保護(hù)心肌肥厚(Liu Yet al.Toll-1nteracting Protein (Tollip) Negatively Regulates Pressure Overload-1nducedVentricular Hypertrophy in Mice.Cardiovascular Research (2014 ) ;101(I):87-96)。到目前為止國際上無文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)Tollip在腦卒中疾病中應(yīng)用的內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是確定Tollip基因的表達(dá)與腦卒中疾病之間的相互關(guān)系，提供一種Tollip作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種Tollip的抑制劑在制備保護(hù)神經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明以Tollip基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷造成腦卒中模型，結(jié)果表明與野生型小鼠(對照組)相比，Tollip基因敲除小鼠梗死體積明顯降低，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)。這提示Tollip基因具有惡化神經(jīng)功能的作用，能加重促進(jìn)腦卒中的發(fā)展，為研究防 治腦卒中疾病的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0008]因此，Tollip基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建Tollip基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中的藥物；Tollip基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中的目的。例如以Tollip為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾Tollip表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使Tollip基因沉默來治療腦卒中；還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建Tollip的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競爭Tollip原形的作用底物，從而抑制Tollip的功能，起到治療目的；此外，還可以以Tollip為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用Tollip基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制Tollip的分子，從而為腦卒中的治療提供新的治療性分子。
[0009]針對Tollip的上述功能,提供Tollip作為藥物祀標(biāo)在篩選治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用。
[0010]針對Tollip的上述功能，提供Tollip的抑制劑在制備治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用。
[0011]一種保護(hù)神經(jīng)功能的藥物，包含Tollip的抑制劑。
[0012]一種治療腦卒中的藥物，包含Tollip的抑制劑。
[0013]所述的Tollip的抑制劑優(yōu)選為Tollip基因的siRNA、Tollip基因的RNA干擾載體，Tollip的抗體及其他能夠抑制Tollip表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0014]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Tollip基因的新功能，即Tollip基因能夠惡化腦卒中的作用。
[0015]2.基于Tollip基因在惡化腦卒中疾病中的功能，為研制腦卒中的藥物提供靶標(biāo)。
[0016]3.Tollip的抑制劑可用于制備保護(hù)神經(jīng)功能和治療腦卒中的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是WT和Tollip-KO小鼠腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評估結(jié)果圖。
[0018]A為TTC染色結(jié)果圖；
B為腦梗體積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；
C為神經(jīng)功能評分統(tǒng)計(jì)柱狀圖；
圖2是FIuoto Jade B染色檢測腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果圖。【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0020]實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用11-12周齡、體重在25-30g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號:949431)、Tollip基因敲除小鼠(Tollip-KO,購買自 EuropeanMouseMutantArchive (EMMA),貨號 EMMAOl970)
飼養(yǎng)環(huán)境:所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件:室溫在22-24°C之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0021]【實(shí)施例1】小鼠腦梗死模型(I/R)獲得
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:雄性C57BL/6品系野生型小鼠及Tollip基因敲除小鼠，通過大腦中動(dòng)脈缺血再灌注建立腦梗死模型(I/R)。隨機(jī)分為2組，每組10只小鼠:C57BL/6品系野生型小鼠I/R術(shù)組(WT I/R)、Tollip基因敲除小鼠I/R術(shù)組(K0 I/R)。
[0022]2.線栓法腦梗死 I/R 手術(shù)米用 MCAO (middle cerebral artery occlusion,大腦中動(dòng)脈閉塞)模型操作流程:
(1)抓取小鼠，使用3%異氟烷麻醉小鼠，8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術(shù)剪迅速剪掉，3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75%酒精脫碘I次；
(2)在小鼠的顱頂部位 橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結(jié)締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前因后方2_，左側(cè)5_的部位；
(3)將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。在ECA遠(yuǎn)心端用8-0線結(jié)扎，ECA近心端處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA、CCA ;然后在ECA遠(yuǎn)心端結(jié)扎和近心端掛線中間剪一小口，將線栓由剪口送入到CCA，并將ECA近心端的掛線在剪口處打一活結(jié)，松緊度以線栓可自由進(jìn)出但略帶摩擦感為宜,再松ICA動(dòng)脈夾，將線栓送入ICA，從血管分叉處開始算距離，當(dāng)插入深度在9-llmm左右至血流下降遇阻力停。這時(shí)將繞在ECA近心端處活結(jié)輕輕系牢拴線，整個(gè)過程必須維持小鼠的肛溫在37±0.5°C ；
(4)從線栓進(jìn)入腦血管至血流下降遇阻力停時(shí)開始計(jì)時(shí)，45min后先松開ECA近心端處活結(jié)，將線栓拔出，并將ECA近心端處活結(jié)扎緊，迅速松開CCA處動(dòng)脈夾，并將ECA近心端結(jié)扎(Sham組在從線栓進(jìn)入腦血管至血流下降遇阻力時(shí)抽出線栓)。注意觀察血流恢復(fù)情況，選擇血流下降75%以上，血流恢復(fù)達(dá)70%以上的小鼠納入實(shí)驗(yàn)；
(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，并用活力碘消毒傷口。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠放在溫箱中，箱溫維持在28 °C，給水和飼料至取材。
[0023]【實(shí)施例2】腦梗死模型(I/R)小鼠腦梗死體積測定
腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)主要包括大腦梗死體積和神經(jīng)功能評分，這些指標(biāo)均與缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。
[0024](I)分別在手術(shù)后24h，72h取材前進(jìn)行神經(jīng)功能及行為學(xué)評分；
基于Berderson神經(jīng)功能評分改進(jìn)方法(9分制):
O分:無神經(jīng)受損的癥狀；
I分:提尾時(shí)對側(cè)前肢蜷曲，或者不能完全到達(dá)患側(cè)前肢；
2分:提尾時(shí)對側(cè)肩膀內(nèi)收； 3分:平推:向?qū)?cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降；
4分:可自發(fā)的向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，但在脫尾巴時(shí)只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎；
5分:自發(fā)運(yùn)動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn)；
6分:無自主運(yùn)動(dòng),只在刺激時(shí)運(yùn)動(dòng)；
7分:無自主運(yùn)動(dòng),刺激時(shí)也無運(yùn)動(dòng)；
8分:與腦缺血有關(guān)的死亡。
[0025]( 2 )抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，剪開小鼠胸腔，剪破心臟放血；
(3)體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒后頸部皮膚，剪開后頸部皮膚，暴露頭及頸部，從頸椎處剪斷頸髓，分離除去后頸部肌肉，眼科剪縱向剪開腦干小腦外顱骨，用紋齒鉗剝開顱骨，分離大腦表面的硬腦膜，避免硬腦膜劃傷腦組織。取腦時(shí)從延髓開始，小心分離顱底組織，避免損傷大腦；
(4)將取下的腦組織放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中潤洗，用紗布吸干PBS，將腦組織放入Imm小鼠腦模，置于_20°C冰箱凍存(不超過4h)；
(5)腦組織2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloricej,TTC)染色:從_20°C冰箱取出腦組織，立即切成Imm厚的切片，包括前囟前方切4片，后方切3片，共切7片。將切片立即置于10mL2%TTC溶液的血清瓶中，37°C恒溫孵育lOmin。不時(shí)翻動(dòng)切片，使組織均勻染色。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色；
(6)腦組織固定:將燒杯里的腦組織及溶液一同轉(zhuǎn)入做好標(biāo)記的杯中，棄去TTC溶液，用10%中性福爾馬林溶液固定腦組織切片，24h后拍照并用IPP軟件分析；
(7)腦梗體積計(jì)算:梗死體積％=(對側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)未梗死體積)/(對側(cè)大腦半球體積X 2) X 100% ；
總梗死體積為各自7張腦片結(jié)果數(shù)據(jù)之和。
[0026]TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，它是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會(huì)產(chǎn)生變化呈蒼白色。
[0027]TTC染色結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過I/R缺血45min再灌注24小時(shí)后Tollip-KO小鼠梗死體積較野生型小鼠降低；且這種保護(hù)作用在I/R術(shù)后72小時(shí)仍然持續(xù)，腦組織梗死比野生型小鼠均低，而神經(jīng)功能評分在I/R術(shù)后24小時(shí)、72小時(shí)均改善。
[0028]【實(shí)施例3】腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定
1.腦組織冰凍切片制備
O實(shí)驗(yàn)小鼠按50mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉；
2)開胸暴露心臟，用注射針頭穿刺如左心室，同時(shí)剪開右心房；
3)用0.lmol/L PBS (pH7.4) IOOmmHg壓力灌流至肝臟變蒼白后，用4%多聚甲醛灌流15min ；
4)開顱迅速取出小鼠大腦，室溫4%多聚甲醛后固定6-8h；
5)切除腦組織的嗅球和小腦，再延正中線將大腦分為先后兩個(gè)部分，用先前的固定液再固定15min ；
6)隨后浸沒于含30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中，4°C冰箱沉底過夜；
7)30%蔗糖與OCT按1:1混合后，倒適量到包埋框中，將前一步的組織取出，在紗布上吸去液體后在該包埋框中浸泡一會(huì)兒，再將其轉(zhuǎn)入到先已加入2滴OCT的另一個(gè)包埋框中，調(diào)整組織的位置，使其正好位于包埋框的正中；
8)將盛組織的包埋框，移入干冰中，盡量使其處于水平位，稍待一會(huì)兒后，繼續(xù)加入0CT，浸沒組織一定的高度，待OCT凝固后，將其儲存于_80°C的冰箱中；
9)用冰凍切片機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序切5um的冰凍切片備用。
[0029]2.FJB (Fluoro Jade B)染色
1)將冰切組織切片在烘箱中烘干I小時(shí)；
2)l%Na0H+80% 無水乙醇 5min ；
3)70%無水乙醇2min ；
4)dd H20 2min ；
5)Flouro Jade B 稀釋液(AG310, Millipore, Billerica, MA),室溫，避光 20min ;
6)dd H20 Imin X3 ；
7)在烘箱中烘片5-10min；
8)二甲苯 > Imin ；
9)封片，拍照。
[0030]腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果見圖2所示，我們檢測了Tollip-KO小鼠和野生型小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。Fluoro Jade B細(xì)胞凋亡檢測顯示，Tollip-KO組小鼠的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯比WT組小鼠少，這提示Tollip與神經(jīng)元細(xì)胞缺血/再灌注時(shí)死亡相關(guān)。這些結(jié)果表明，抑制Tollip表達(dá)可以改善腦組織缺血再灌注損傷程度和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
[0031]我們的研究成果表明，Tollip KO小鼠在大腦中動(dòng)脈缺血再灌注引起的損傷中，我們發(fā)現(xiàn)Tollip敲除后，小鼠梗死體積顯著減少，神經(jīng)功能明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞凋亡也明顯減少。說明Tollip基因在腦卒中疾病模型中有著重要的惡化作用。
[0032] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換 方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.Tollip作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.Tollip作為藥物靶標(biāo)在篩選治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
3.Tollip的抑制劑在制備保護(hù)腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.一種保護(hù)腦卒中疾病的藥物，其特征在于:包含Tollip的抑制劑。
5.Tollip的抑制劑在制備治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.一種治療腦卒中疾病的藥物，其特征在于:包含Tollip的抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的Tollip的抑制劑優(yōu)選為Tollip基因的siRNA、Tollip基因的RNA干擾載體或Tollip的抗體及其他能夠抑制Tollip表達(dá)的抑制劑中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要 求4或6所述的藥物，其特征在于:所述的Tollip的抑制劑優(yōu)選為Tollip基因的siRNA、Tollip基因的RNA干擾載體或Tollip的抗體及其他能夠抑制Tollip表達(dá)的抑制劑中的一種。
【文檔編號】A61K45/00GK103990147SQ201410256991
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】李紅良, 郭森, 盧燕云, 鄭安康, 李明昌 申請人:武漢大學(xué)