苦杏仁甙保護(hù)缺血心臟的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了苦杏仁甙保護(hù)缺血心臟的應(yīng)用，這些用途是基于其新功能的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)：苦杏仁甙可減輕心肌缺血/再灌損傷，尤其是增強(qiáng)胰島素激活“生存信號(hào)”通路中心分子Akt當(dāng)中的作用。胰島素抵抗是糖尿病、高血壓、冠心病等心腦血管疾病的共同土壤，且胰島素抵抗主要表現(xiàn)為以Akt為中心環(huán)節(jié)的“生存信號(hào)”通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷。因此可增強(qiáng)胰島素激活A(yù)kt作用的苦杏仁甙用于基于胰島素抵抗的疾病的輔助治療，可能具有潛在的較為廣闊的應(yīng)用前景。如開發(fā)富含苦杏仁甙的保健品或藥品，則可為維護(hù)民眾健康、特別是預(yù)防以胰島素抵抗為基礎(chǔ)的心血管疾病有所裨益。
【專利說明】苦杏仁甙保護(hù)缺血心臟的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于苦杏仁甙的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及苦杏仁甙保護(hù)缺血心臟的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，心血管疾病已成為威脅人類健康和生存的主要原因之一，而心肌梗死的發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)。早期溶栓治療是急性心肌梗死最理想的治療措施，能夠縮小梗死面積，提高心臟功能，改善預(yù)后，但卻引起細(xì)胞的缺血/再灌注損傷。
[0003]胰島素是糖與脂肪能量代謝過程中主要的調(diào)控激素。胰島素可激活已知至少兩條信號(hào)途徑:一是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑；另一條是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑。PI3K信號(hào)通路是胰島素的主要信號(hào)通路，已有研究表明，在缺血期給予胰島素治療，可通過磷脂酰肌醇3激 酶-蛋白激酶B-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eN0S)途徑激活細(xì)胞“生存信號(hào)”通路，發(fā)揮抗炎、抗心肌細(xì)胞凋亡的心臟保護(hù)作用(Yu QJ1Si R, Zhou N, etal.1nsulin inhibits b-adrenergic action in ischemic/reperfused heart:A novelmechanism of insulin in cardioprotection.Apoptosis.2008 ； 13:305-17 ；Li J，ZhangHF, Wu F，et al.Suppression of TNF- a induction by insulin in the ischemic/reperfused rat hearts:Roles of Akt and eNOS phosphorylation.Crit Care Med2008 ；36:1551-58.)。且有研究表明，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，胰島素剌激引起的PI3K_Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用下降，而MAPK介導(dǎo)的信號(hào)通路正常。
[0004]苦杏仁為歷版中國(guó)藥典一直收載的中藥，對(duì)苦杏仁及其制劑的研究已有將近200年的歷史?？嘈尤室回灋榻禋馄酱箍?、潤(rùn)腸通便之中藥配方選用，單獨(dú)以苦杏仁命名的制劑為數(shù)極少，如苦杏仁止咳糖漿。
[0005]苦杏仁的主要成分苦杏仁式(Semen Armeniacae amarum, SAA),又稱維生素B17，也可從杏、蘋果、櫻桃等果核中提取。國(guó)外研究表明，苦杏仁甙對(duì)T淋巴細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，因而具有一定抗腫瘤功效(Matthew M.Ames, Thomas P.Moyer, John S.Kovach, etal.Pharmacology of amygdalin(Iaetrile) in cancer patients.Cancer ChemotherPharmacol.1981, 6:51-57.);苦杏仁式可減少腫瘤壞死因子mRNA含量及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，從而降低脂多糖引起的炎癥反應(yīng)(Hwang, H.J.，Lee, H.J.，Kim, C.J.，etal.1nhibitory effect of amygdalin on lipopolysaccharide-1nducible TNF-alpha andIL-1beta mRNA expression and carrageenan—induced rat arthritis.J Microbiol Biotechnol.2008, 18 (10): 1641-1647.)。還有研究發(fā)現(xiàn)，苦杏仁甙可增加正常以及腦缺血狀態(tài)下的能量代謝中細(xì)胞色素氧化酶的活性(《中藥新藥與臨床藥理》，1996，7 (2):50-51)。然而，苦杏仁甙抗炎、增加缺血后能量代謝的細(xì)胞色素氧化酶的活性的具體機(jī)制是什么并未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決的問題在于提供苦杏仁甙在保護(hù)缺血心臟方面的新用途，尤其是其在增強(qiáng)胰島素“生存信號(hào)”系統(tǒng)、提高缺血心臟功能方面的作用。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0008]1、苦杏仁甙保護(hù)缺血心臟的應(yīng)用。
[0009]2、苦杏仁甙用于抗心肌缺血藥物的制備的應(yīng)用。
[0010]3、苦杏仁甙用于抗心臟缺血/再灌注損傷藥物的制備的應(yīng)用。
[0011]4、苦杏仁甙促進(jìn)或增強(qiáng)胰島素激活A(yù)kt的應(yīng)用。
[0012]5、苦杏仁甙與胰島素的混合物用于激活A(yù)kt藥物的制備的應(yīng)用。
[0013]6、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的苦杏仁甙與胰島素的混合物中胰島素與苦杏仁甙的配比為藥學(xué)上可接受的配比。
[0014]7、苦杏仁甙用于治療基于胰島素抵抗的疾病的輔助藥物的應(yīng)用。
[0015]8、苦杏仁甙用于 預(yù)防心血管疾病的藥物、保健品或食品的制備的應(yīng)用。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0017]本發(fā)明提出了苦杏仁甙的新用途，這些用途是基于其新的功能的發(fā)現(xiàn)和證實(shí):苦杏仁甙能夠增強(qiáng)胰島素激活“生存信號(hào)”通路蛋白，尤其是PI3K-Akt信號(hào)途徑當(dāng)中的作用?？嘈尤蔬安⒉荒苤苯蛹せ預(yù)kt，但胰島素在苦杏仁甙存在情況下，激活A(yù)kt的作用大于單獨(dú)使用等量的胰島素，并且在胰島素存在情況下，苦杏仁甙組的Akt磷酸化水平較對(duì)照組也顯著增加。
[0018]因此，苦杏仁甙通過增強(qiáng)胰島素激活“生存信號(hào)”通路下，能夠?qū)π募∪毖?再灌注損傷心臟具有保護(hù)作用:其保護(hù)作用體現(xiàn)在增加缺血/再灌損傷大鼠的心臟功能、減小心肌梗死范圍。所以，苦杏仁甙對(duì)于缺血心臟的保護(hù)就可應(yīng)用于抗心肌缺血藥物的制備或預(yù)防心血管疾病的藥物的制備。
[0019]進(jìn)一步，鑒于苦杏仁甙對(duì)胰島素激活“生存信號(hào)”通路蛋白的顯著增加的作用，苦杏仁甙可用于基于胰島素抵抗的疾病的輔助治療，可能具有潛在的較為廣闊的應(yīng)用前景。如開發(fā)富含苦杏仁甙的保健品或藥品，則可為維護(hù)民眾健康、特別是預(yù)防以胰島素抵抗為基礎(chǔ)的心血管疾病有所裨益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為苦杏仁甙(SAA)及胰島素(Insulin)均可減少大鼠缺血/再灌注后心肌梗死范圍的檢測(cè)結(jié)果及柱狀圖。
[0021]圖2為在基礎(chǔ)胰島素環(huán)境，苦杏仁甙(SAA)及胰島素(Insulin)均可增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果及柱狀圖。
[0022]圖3為I型糖尿病模型中單獨(dú)使用苦杏仁甙(SAA)不能增加大鼠缺血/再灌注后心肌Akt磷酸化水平的檢測(cè)結(jié)果及柱狀圖。
[0023]圖4為苦杏仁甙(SAA)不能降低大鼠心肌缺血/再灌注后的血糖水平的柱狀圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0025]1、為說明苦杏仁甙對(duì)胰島素激活信號(hào)的增強(qiáng)作用和對(duì)缺血/再灌注的保護(hù)，采用以下模型及檢測(cè)手段:
[0026]1.1、大鼠心肌缺血/再灌注(MIR)模型的制備:
[0027]將SD大鼠以30g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，按常規(guī)方法制備大鼠MIR(30min/3h)模型:頸正中切口氣管插管，連接呼吸機(jī)行正壓人工呼吸。經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至左心室記錄左室壓及其微分。開胸暴露心臟，5-0絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處，心電圖ST段抬高為結(jié)扎成功指標(biāo)。缺血30分鐘后松開絲線，再灌注3小時(shí)。
[0028]1.2、心臟功能監(jiān)測(cè):通過多導(dǎo)生理記錄儀(RM-4200)持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠心電及血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)。心電圖、左室收縮壓(LVSP)、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率(土 LVdP/dtmax)等均通過數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)采集、記錄并計(jì)算。
[0029]1.3、心肌梗死范圍:再灌注3h結(jié)束后，再次結(jié)扎冠脈，向左心室腔注入2%伊文藍(lán)(I~2ml)。速取出心臟，凍存于_20°C。用心臟切片器垂直于心臟長(zhǎng)軸將其切成Imm厚的薄片，分片置于含2mll% TTC (pH7.4)的12孔培養(yǎng)皿中，37°C孵育15min。用數(shù)碼相機(jī)拍照并輸入計(jì)算機(jī)。采用單盲法分別將伊文藍(lán)染色區(qū)(非缺血區(qū))、TTC染色區(qū)(紅染，缺血但仍存活組織)以及非TTC染色區(qū)(梗死心肌)，用SigmaScan面積測(cè)算軟件進(jìn)行計(jì)算處理。心肌梗死范圍以每一心臟總梗死面積(INF)占總?cè)毖獏^(qū)面積(AAR)的百分比表示。
[0030]I.4、蛋白表達(dá)水平檢測(cè):
[0031]為研究SAA減輕心肌缺血/再灌注損傷的分子機(jī)制,采用Western blot方法檢測(cè)心肌細(xì)胞中磷酸化Akt (p-Akt)及Akt表達(dá)水平。心肌組織在預(yù)冷至0°C的PBS (pH7.4)中剪碎、清洗數(shù)次后移入預(yù)冷至O °C的裂解液中并進(jìn)一步剪碎。
[0032]裂解液成分如下(mmol/L):20Tris.HCl、50NaCl、50NaF、50Na4P207、250Sucrose、2Na3V04、1DTT、I %復(fù)合型蛋白酶抑制劑。
[0033]用Heidolph DIA900 組織勻漿器勻漿 lmin，勻漿液 12000 X g (4°C )離心 lOmin，取
上清即得組織蛋白提取液。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。
[0034]蛋白定量后，組織蛋白提取液加入5倍上樣緩沖液(溶液成分(mmol/L):50Tris.HC1、100DTT、2% SDS、0.1 % 溴酚藍(lán)、10 % 甘油)，100°C 煮沸 5min，恢復(fù)至室溫，12000Xg離心10min,取上清分裝，_80°C保存。
[0035]按Laemmli (1970)方法，以每孔50~100 μ g蛋白上樣量加到8~12%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠(SDS/PGEA)上進(jìn)行電泳，電泳完成后，小心取下分離膠，用半干電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂奶粉室溫下封閉lh。將PVDF膜與一抗共孵育，4°C過夜；用PBST緩沖液(溶液成分:10mmol/L PBS加0.1 %的Tween20)洗去所有未結(jié)合的一抗，將膜與偶聯(lián)二抗37°C —起孵育Ih(二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)的山羊抗兔抗體)，洗去所有未結(jié)合的二抗，使用ECL-plus免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光檢測(cè)。完成P-Akt或β-Actin免疫檢測(cè)后，50°C解析液(溶液成分(mmol/L，PH6.7):1002-巰基乙醇、2% (W/V)SDS、62.5Tris.HCl)對(duì)原一抗進(jìn)行30min解離，用PBST漂洗，5 %脫脂奶粉室溫下重新封閉，印跡膜進(jìn)行Akt蛋白表達(dá)的免疫檢測(cè)。
[0036] 1.5,1型糖尿病動(dòng)物模型:SD大鼠禁食8h，迅速腹腔注射新鮮配制的鏈脲霉素(STZ)溶液(35mg/kg),每天一次,連續(xù)注射兩天。選用7天空腹血糖大于16.7mmol/L的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。制作心肌缺血/再灌注模型，于再灌注結(jié)束后，取危險(xiǎn)區(qū)心室肌組織，同上方法提取蛋白，用Western blot方法檢測(cè)心肌細(xì)胞中ρ-Akt及Akt表達(dá)水平。[0037]2、苦杏仁甙的新的藥用功能:
[0038]2.1、確定苦杏仁甙的實(shí)驗(yàn)劑量
[0039]為確定SAA在缺血/再灌注中的用藥量，將大鼠隨機(jī)分為以下幾組:(1)心肌缺血/ 再灌注組(MIR) ;(2)MIR+SAA10 組(10mg/kg，劑量體重比)；(3)MIR+SAA100 組(IOOmg/kg) ;(4)MIR+SAA1000組(1000mg/kg)。SAA治療組再灌注前15min給藥(iv)。然后檢測(cè)如表1所示的各指標(biāo)，從而選擇合適的劑量。
[0040]表1不同劑量苦杏仁甙對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心臟功能的影響
[0041]
【權(quán)利要求】
1.苦杏仁甙用于預(yù)防心血管疾病的藥物、保健品或食品的制備的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物或保健品是預(yù)防以胰島素抵抗為基礎(chǔ)的心血管疾病的藥物或保健品。
3.苦杏仁甙 用于治療基于胰島素抵抗的疾病的輔助藥物的制備的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK103948612SQ201410174903
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月14日
【發(fā)明者】董玲, 劉文沖, 高峰, 張海鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)