溴苯那敏在制備治療或預防流感病毒感染藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種溴苯那敏在制備預防或治療流感病毒感染藥物中的應用。本發(fā)明首先檢測了溴苯那敏對MDCK細胞的毒性，結(jié)果顯示溴苯那敏在所測濃度范圍對細胞完全無毒性；其次，在完全無毒性的濃度范圍內(nèi)測定了溴苯那敏的抗病毒活性，結(jié)果顯示這種小分子化合物具有顯著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈劑量依賴效應；最后，檢測了溴苯那敏對不同型和亞型的流感病毒的抗病毒活性，結(jié)果顯示溴苯那敏可以劑量依賴地抑制所有被檢測流感病毒株的復制，表明溴苯那敏的抗流感病毒活性具有廣譜性。因此，本發(fā)明首次披露了溴苯那敏是一種新型廣譜抗流感病毒藥物，可以用于制備預防或治療流感病毒感染的藥物。
【專利說明】溴苯那敏在制備治療或預防流感病毒感染藥物中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種溴苯那敏在制備治療或預防流感病毒感染藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒屬。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也稱甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負鏈RNA組成，分別以節(jié)段I至節(jié)段8命名。病毒基因組全長約13.6kb，編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進一步分為17個H(H1-H17)和10個N(Nl-NlO)亞型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型。而目前危害嚴重的高致病性禽流感多為H5、H7和H9亞型，其中以H5N1亞型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆發(fā)，僅在人和海豹中發(fā)現(xiàn)。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，可感染人類和豬。
[0003]流感病毒的整個生活周期需要在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)完成。感染的起始是病毒顆粒表面的刺突HA識別和結(jié)合宿主細胞表面含唾液酸的受體。唾液酸與次末端半乳糖的連接鍵，決定了病毒的宿主特異性，該連接鍵在禽類中為α (2-3),在人類中為α (2_6)。病毒吸附細胞后，細胞通過網(wǎng)格蛋白受體介導的胞飲作用攝入病毒。在細胞內(nèi)，網(wǎng)格蛋白分子解離，病毒與內(nèi)涵體融合形成吞噬體，使得病毒粒子周圍的PH值下降至5.0左右。在此pH條件下，病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使位于輕鏈(HA2) N端的融合肽暴露，從而引起病毒囊膜與細胞膜融合。低PH環(huán)境也致使大量H+經(jīng)由M2離子通道進入病毒粒子內(nèi)部，導致Ml蛋白與vRNPs的解離。兩者的共同結(jié)果致使病毒粒子的vRNPs釋放到被感染細胞的胞漿。vRNPs隨后轉(zhuǎn)到細胞核內(nèi)進行基因組的復制和轉(zhuǎn)錄，復制時病毒首先以自身RNA為模板合成互補RNA (cRNA)，然后以cRNA為模板再合成vRNA。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞漿，翻譯出病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與新生成的vRNA組裝成vRNP，vRNP出核后與其余的病毒蛋白開始組裝成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通過神經(jīng)氨酸酶(NA)水解細胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點釋放出來。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解為HAl和HA2多肽，這樣的病毒粒子才具有感染性，從而開始新一輪病毒的復制。
[0004]流感病毒自20世紀初發(fā)現(xiàn)以來已在全球范圍內(nèi)造成五次大流行，十年左右會產(chǎn)生一次暴發(fā)流行，在全球范圍內(nèi)造成了巨大的損失。流感流行每年可導致25萬~50萬例死亡，300萬~500萬重病例，全球約共有5~15%的人被感染。接種疫苗和使用抗病毒藥物是應對流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原變異能力強，在大流行前基本上不可能大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。目前，經(jīng)美國食品和藥物管理局(FDA)批準正式上市的抗流感病毒藥物有兩類:(1)以金剛烷胺和金剛乙胺為代表的M2離子通道阻斷劑。此類藥只對甲型流感病毒有預防和治療作用，研究表明此類藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且由于耐藥株的普遍存在，所以CDC建議此類藥物不再用于預防流感病毒感染。(2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑，此類藥的代表是奧斯他韋和扎拉米韋。此類藥物對所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來關(guān)于奧斯他韋耐藥株的確不斷有報道。因此，研究并開發(fā)新型抗流感病毒藥物有重要意義。
[0005]溴苯那敏(Brompheniramine),又名溴苯吡丙胺或溴抗感明，化學名為N, N- 二甲基-ga_a-(4-溴苯基)-2_吡啶丙胺順丁烯二酸鹽。其鹽類馬來酸溴苯那敏(Brompheniramine maleate)常用于藥品中。屬于第一代組胺Hl受體拮抗劑。臨床上主要用于減輕過敏癥狀。
[0006]目前，沒有見到溴苯那敏在抗流感病毒及治療流感病毒感染引起疾病的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種小分子化合物溴苯那敏在制備治療或預防流感病毒感染藥物中的應用，從而為臨床上流感的治療提供一種安全有效的小分子化合物。溴苯那敏在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制流感病毒的復制，可進一步開發(fā)為治療或預防流感病毒感染疾病的藥物，具有廣泛的應用前景。
[0008]為了證明溴苯那敏在制備治療或預防流感病毒(甲型或乙型)感染藥物中的可行性，本發(fā)明采取了以下實驗進行驗證:
[0009]溴苯那敏對 MDCK細胞的毒性實驗:犬腎細胞(MDCK)按8X IO3個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，分別用0.8μΜ、1.6μΜ、3.125μΜ、6.25μΜ、12.5μΜ、25.0 μ Μ、50.0 μ M和100.0μ M的溴苯那敏進行處理，每組重復兩個孔，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，Alamarblue檢測細胞的存活率。結(jié)果顯示，溴苯那敏對MDCK的CC5tl(半數(shù)致死濃度)大于100.0 μ M0
[0010]溴苯那敏抗流感病毒活性的評價:將MDCK細胞按照1.5X IO4細胞/孔接種于96細胞培養(yǎng)板中，37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18-24h后，用IOOTCID5q的病毒液(A/PuertoRico/8/34 (HlNl))感染細胞，同時加入不同濃度梯度藥物。細胞于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。結(jié)果顯示溴苯那敏能夠劑量依賴地抑制流感病毒的復制，其IC5tl為14.7 μ M0
[0011]溴苯那敏抗流感病毒作用的廣譜性分析:將MDCK細胞按照1.5 X IO4細胞/孔接種于96細胞培養(yǎng)板中，37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h且長成單層后，用IOOTCID5q的流感病毒液(分別為 A/human/Hubei/3/2005 (H3N2)，A/WSN/S3IN (HlNl)，B/human/Huber/1/2007)感染細胞，同時加入各梯度濃度的藥物。細胞在細胞培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶表達量的檢測。結(jié)果顯示溴苯那敏能夠明顯抑制甲型流感病毒亞型H3N2株、甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株和乙型流感病毒的復制，且均具有劑量依賴效應。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果:
[0013]1.溴苯那敏是小分子化合物，其CC5tl (半數(shù)致死濃度)大于100.0 μ M。溴苯那敏能夠劑量依賴的抑制流感病毒復制，其IC5tl (半數(shù)抑制濃度)為14.7 μ Μ。選擇指數(shù)(SI)大于6.8。而且溴苯那敏已經(jīng)在臨床上有數(shù)十年的應用，安全性良好。這說明溴苯那敏是低毒高效的抗流感病毒的藥物。
[0014]2.溴苯那敏能夠劑量依賴的抑制甲型流感病毒亞型H3N2株、甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株和乙型流感病毒的復制，具有非常廣譜的抗病毒活性。
[0015]3.利用現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將溴苯那敏作為活性成分制成片劑、膠囊、顆粒齊?、口服液、緩釋制劑、控釋制劑、納米制劑或注射劑等任何一種藥學上可接受的劑型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為溴苯那敏細胞毒性檢測示意圖。
[0017]圖2為溴苯那敏處理劑量依賴抑制流感病毒復制水平示意圖。
[0018]圖3為溴苯那敏抗流感病毒活性廣譜性檢測示意圖，其中:
[0019]圖3Α 為甲型流感病毒亞型 Η3Ν2 株(A/human/Hubei/3/2005 (H3N2))；
[0020]圖3B為甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株(A/WSN/S31N(HlNl))；
[0021]圖3C 為乙型流感病毒(B/human/Huber/1/2007)。
【具體實施方式】 [0022]為了更好地闡述本發(fā)明的內(nèi)容，下面 申請人:將結(jié)合具體實施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步的詳細說明，但本發(fā)明請求保護的范圍不局限于以下實施例。
[0023]目前，抗流感病毒藥物體外篩選模型分為細胞培養(yǎng)模型和病毒酶的無細胞系統(tǒng)篩選模型。酶反應篩選模型具有高通量的特點，但篩選的化合物仍需進行更多的細胞學、組織學和體內(nèi)毒性、藥效實驗等以確定其效果。細胞培養(yǎng)模型是最常用的篩選模型，其優(yōu)點在于:可提供大量遺傳性狀相同的細胞為研究對象，操作方便，可消除其它外界因素的影響，并可以檢測藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機理研究提供更多基礎(chǔ)。本發(fā)明采用MDCK細胞培養(yǎng)篩選法檢測溴苯那敏對流感病毒感染的影響，基于對上清中代表流感病毒復制水平的神經(jīng)氨酸酶表達水平的檢測，定量分析溴苯那敏的抗流感病毒活性。
[0024]實施例1:溴苯那敏抗流感病毒活性的評價
[0025]1.實驗材料
[0026]1.1細胞、病毒和藥物
[0027]MDCK細胞購自美國模式菌種保藏中心(ATCC);病毒株:A/PuertoRi co/8/34(HlNl);藥物:溴苯那敏(CAS:86-22-6)，購于Sigma公司。
[0028]1.2實驗儀器
[0029]多標記微孔板讀取儀(Perkin Elmer)。
[0030]2.實驗方法與結(jié)果
[0031]2.1細胞培養(yǎng):37°C，5%C02加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10% FBSU00U/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細胞至90%匯合度后傳代，傳代比例1/3 - 1/4。
[0032]2.2病毒培養(yǎng):取9~11日齡SPF雞胚，接種病毒前用驗蛋器檢查，并在遠離胚胎的位置標記，消毒并打孔后按0.2ml/枚接種24血凝效價的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒溫箱孵育48h (接種24h后死亡的雞胚一般為操作不當致死，棄之)。取出雞胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒雞胚氣室，無菌操作剪去氣室外殼，毛細吸管吸取雞胚尿囊液和羊水，3000rpm4°C離心30min，檢測血凝效價，200 μ I/管分裝并置_70°C凍存?zhèn)溆谩0033]2.3溴苯那敏的細胞毒性檢測播0(細胞按8父103細胞/孔(10(^1)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后備用；用細胞維持液(DMEM+2%血清)將藥物以100.0 μ M為最高濃度按照2梯度稀釋共計6個梯度進行處理，每梯度2個復孔。培養(yǎng)48h后棄掉培養(yǎng)上清，于每孔中加入100 μ I含有10%Alamarblue試劑的新DMEM培養(yǎng)基，置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh，Ih后用多功能檢測儀分別測量熒光和吸光值，計算細胞存活率。
[0034]結(jié)果顯示(圖1)溴苯那敏在100.0μ M范圍內(nèi)對MDCK細胞完全沒有細胞毒性，說明溴苯那敏有比較安全的適用范圍，即溴苯那敏的給藥劑量按照細胞實驗用量為0.0~100.0 μ Mo
[0035]2.4溴苯那敏對流感病毒株A/PuertoRico/8/34 (HlNl)的抗病毒活性評價[0036]2.4.1.實驗原理:MUNANA (4-methylumbelliferyl- a -N-acetyl-neuraminate)是流感病毒神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的催化產(chǎn)物在355nm激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生460nm突光,突光強度的強弱代表了病毒神經(jīng)氨酸酶表達量的多少，反映了培養(yǎng)細胞上清中的病毒量。
[0037]2.4.2.將MDCK細胞按1.5 X IO4細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細胞長成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS清洗兩遍后，加入IOOTCID5q病毒液(100 μ I)和不同濃度藥物(100 μ I)于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物以100.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，每梯度設(shè)置兩個復孔。培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。實驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組(利巴韋林)、陰性對照組(病毒感染后無藥物處理)和實驗藥物組。
[0038]2.4.3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES, ρΗ6.5,4mmol/LCaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實驗孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37 °C避光孵育60min，加入反應終止液(0.014μΜ NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，微孔讀板儀上測定熒光值(激發(fā)光波長355nm,發(fā)射光波長465nm)。
[0039]2.4.4.計算各檢測孔中藥物對流感病毒復制的抑制率。
[0040]抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對照)/ (酶活對照-空白對照)*100%
[0041]結(jié)果顯示:隨著溴苯那敏藥物濃度的增加，藥物對流感病毒復制的抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)很明顯的劑量依賴效果。其在14.7 μ M濃度能夠抑制50%的病毒復制，選擇指數(shù)大于6.8，在50.0 μ M濃度時達到接近100%抑制率。(見圖2)。
[0042]實施例2:溴苯那敏抗流感病毒作用廣譜性的評價
[0043]在實施例1的基礎(chǔ)上，本實施例進一步檢測了溴苯那敏對甲型流感病毒亞型Η3Ν2株、甲型流感病毒亞型HlNl金剛烷胺耐藥株和乙型流感病毒的抗病毒活性。
[0044]1.實驗使用病毒株包括:A/human/Hubei/3/2005(H3N2)，A/WSN/S31N(HlNl)，B/human/Huber/1/2007
[0045]2.將MDCK細胞按1.5 X IO4細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細胞長成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS清洗兩遍后，加入IOOTCId50病毒液(100 μ I)和不同濃度藥物(100 μ I)于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物以100.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，每梯度設(shè)置兩個復孔。培養(yǎng)48h后取各實驗孔上清進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。
[0046]3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES，pH6.5,4mmol/LCaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實驗孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反應終止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能檢測儀上測定熒光值(激發(fā)光波長355nm,發(fā)射光波長465nm)。
[0047]4.計算各檢測孔中神經(jīng)氨酸酶被抑制率。
[0048]抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對照)/ (酶活對照-空白對照)*100%
[0049] 結(jié)果顯示溴苯那敏在藥物濃度范圍內(nèi)明顯抑制了各種流感病毒毒株的復制，并且均呈劑量依賴關(guān)系(見圖3)。其對甲型流感病毒H3N2、甲型流感病毒金剛烷胺耐藥株和乙型流感病毒的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為16.3 μ M、28.4 μ M和12.5 μ Μ,對應的選擇指數(shù)分別大于6.1,3.5和8.0。表明溴苯那敏是一種廣譜的抗流感病毒藥物。
【權(quán)利要求】
1.溴苯那敏在制備治療或預防流感病毒感染藥物中的應用。
2.如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:所述的流感病毒為甲型流感病毒或乙型流感病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:所述的藥物是以溴苯那敏或其各種鹽形式作為藥物活性成分。
4.如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:所述的藥物為口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或經(jīng)皮給藥劑型。
5.如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:所述的藥物為任何一種藥學上可接受的劑型。
6.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于:所述的藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或注射液。
7.如權(quán)利要求5所述的 應用，其特征在于:所述的藥物為緩釋制劑、控釋制劑或納米制劑。
【文檔編號】A61P31/16GK103893175SQ201410157329
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】吳建國, 陳緒林, 鄔開朗, 劉映樂, 潭秋萍, 劉芳 申請人:武漢勝達康生物科技有限公司