基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，包括留置針，留置針外表面包覆有可吸附蛋白的材料，可吸附蛋白的材料上吸附有用于特異性識別與捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞特異性抗體。本發(fā)明還公開了利用該捕獲裝置捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法：采用本發(fā)明的留置針給癌癥患者輸液，在輸液過程中，癌癥患者血管中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞即被留置針上修飾的特異性抗體捕獲；輸液過程完成后，將留置針拔出，從而將捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞清除出體外，用洗脫液洗脫，洗脫下來的細(xì)胞可以置于顯微鏡下觀察計數(shù)，或針對細(xì)胞內(nèi)待測目標(biāo)分子做免疫染色，共聚焦顯微鏡觀測。本發(fā)明的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲方法，操作簡單，可以實現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)胞高效率和高選擇性的捕獲。
【專利說明】基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]幾十年前人們就已經(jīng)認(rèn)識到癌癥的轉(zhuǎn)移很大程度上是由于原位癌將癌細(xì)胞播散到血液里，由血液攜帶至其他器官，從而形成新的腫瘤。目前，對于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)的捕獲與檢測已經(jīng)被用作一種新的液體診斷方法,用于追蹤癌癥的擴(kuò)散或者預(yù)測治療的預(yù)后效果。迄今為止，幾乎所有關(guān)于CTCs捕獲與檢測的方法都是基于從血液中取若干毫升樣品，進(jìn)而捕獲檢測此樣品中的CTCs。分析化學(xué)中取樣的基本規(guī)律是樣品要具有代表性，而CTCs的播散是無規(guī)律的，間或會有一團(tuán)細(xì)胞播散到血液中，因此血液中CTCs的分布是不均勻的。這勢必會導(dǎo)致隨機(jī)從血液中取到的樣品是不具有代表性的，從而會造成此類基于取樣的檢測方法極有可能出現(xiàn)假陰性。即便所建立的檢測方法能檢測到I毫升血液里的I個細(xì)胞，相對于全身血液中CTCs的不均勻分布來說，這也不是一個準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，有必要研發(fā)一種更加準(zhǔn)確有效的捕獲與檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述關(guān)于CTCs捕獲與檢測方法的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置及方法?？捎糜趯TCs實現(xiàn)更加準(zhǔn)確有效的檢測。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0005]一種基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，包括留置針，留置針外表面包覆有可吸附蛋白的材料，可吸附蛋白的材料上吸附有用于特異性識別與捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞特異性抗體。
[0006]所述留置針，是指可以用于輸液、并能在體內(nèi)留置Ih以上的所有不同規(guī)格、類型的輸液針。
[0007]所述可吸附蛋白的材料，是指可以通過共價偶聯(lián)、氫鍵作用、疏水作用或者分子間作用力等吸附蛋白質(zhì)的材料，優(yōu)選聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane) ,PDMS)?？晌降鞍椎牟牧峡梢晕锢砀街诹糁冕樛獗砻?。
[0008]所述上皮細(xì)胞特異性抗體,包括針對循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的所有抗體種類，可以是多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，以及核酸適配體。
[0009]所述上皮細(xì)胞特異性抗體，根據(jù)需要捕獲的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞而選擇，比如:需要捕獲乳腺癌細(xì)胞時，可選用抗上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抗體。
[0010]所述基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置的制備方法為:
[0011] (I) PDMS包覆:PDMS前體液及其固化劑(PDMS前體液及其固化劑都是現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)產(chǎn)品)按體積比5:1比例混合均勻，得混合液，然后將留置針浸沒于該混合液中，順時針旋轉(zhuǎn)留置針I(yè)周以上使包覆均勻，然后取出，置于65°C干燥箱中固化3小時，得包覆有PDMS的留置針；
[0012](2)抗體的吸附:將包覆有PDMS的留置針浸沒于濃度為I~500 μ g.mL—1的(優(yōu)選100μ g.ml-1)上皮細(xì)胞特異性抗體溶液中，輕輕振搖2小時(目的是使上皮細(xì)胞特異性抗體充分吸附在PDMS上)，取出后用PBS緩沖液清洗3次，置于4°C環(huán)境下保存，待用。
[0013]利用上述基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法:利用基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置給攜帶有目標(biāo)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的癌癥患者輸液時，在輸液過程中，癌癥患者血管中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞即被留置針上修飾的特異性抗體捕獲；輸液過程完成后，將留置針拔出，即可將捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞清除出體外，用洗脫液洗脫，即可將循環(huán)腫瘤細(xì)胞洗下，洗脫下來的細(xì)胞可以置于顯微鏡(光學(xué)顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡)下觀察計數(shù)，或針對細(xì)胞內(nèi)待測目標(biāo)分子做免疫染色，共聚焦顯微鏡觀測。
[0014]所述洗脫液，選自磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4,0.1mol.L—1)、甘氨酸緩沖溶液(pH2.7，
0.1mol.I71)或氫氧化鈉溶液(pH13.6,0.4mol.L-1)。
[0015]本發(fā)明的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置及方法，留置針采用上皮細(xì)胞特異性抗體修飾，可以實現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)胞高選擇性和高特異性的捕獲。臨床采用此種經(jīng)過修飾的留置針輸液時，即可同時實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲。輸液完成后，留置針拔出時即可將捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞清除出體外。在體外將留置針上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞洗脫后，即可對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行各種目的的檢測(早期診斷、治療反應(yīng)等)。本發(fā)明的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲方法，無需抽血，對人體不會造成任何額外傷害，成本低廉且高效，操作簡單，可用于癌癥患者的早期診斷及治療反應(yīng)的預(yù)測。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0017]實施例1
[0018]一種基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，包括留置針，留置針外表面包覆有PDMS，PDMS上吸附有用于特異性識別與捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞特異性抗體(目標(biāo)循環(huán)腫瘤細(xì)胞為MCF-7細(xì)胞，所選用的上皮細(xì)胞特異性抗體為抗EpCAM抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。
[0019]所述留置針的規(guī)格型號，為24GX0.75 "，0.7_X19mm。
[0020]所述基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置的制備方法為:
[0021](I)PDMS包覆:PDMS前體液及其固化劑按體積比5:1比例混合均勻，得混合液，然后將留置針浸沒于該混合液中，順時針旋轉(zhuǎn)留置針使包覆均勻，然后取出，置于65°C干燥箱中固化3小時，得包覆有PDMS的留置針；
[0022](2)抗體的吸附:將包覆有PDMS的留置針浸沒于100 μ g -ml-1的上皮細(xì)胞特異性抗體溶液中，輕輕振搖2小時，取出后用PBS緩沖液清洗3次，置于4°C環(huán)境下保存，待用。
[0023]試驗例:選取兔子和小鼠兩種動物作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲的實驗動物，以可商業(yè)化購得的乳腺癌細(xì)胞株一MCF-7為例，驗證在體捕獲方法的有效性。
[0024]為了考察動物免疫系統(tǒng)對注入MCF-7細(xì)胞的清除作用，選取免疫缺陷的裸鼠用于在體捕獲實驗。將配制好的含有一定MCF-7細(xì)胞數(shù)(具體見表1)的溶液，分別注入兔左耳耳緣靜脈，小鼠、裸鼠尾部一條靜脈中，將實施例1制備的經(jīng)過修飾的留置針刺入兔右耳耳緣靜脈，小鼠、裸鼠尾部另一條靜脈中，3小時后將留置針取出，用pH為2.7、濃度為
0.1mol.L—1的Gly-HCl溶液將捕獲的MCF-7細(xì)胞從留置針上洗脫至酶標(biāo)板的孔中，置于顯微鏡下觀測，計數(shù)細(xì)胞數(shù)。
[0025]表1統(tǒng)計了添加不同細(xì)胞數(shù)時實際捕獲的細(xì)胞數(shù)及捕獲效率。由表1可見，注入兔子、小鼠及裸鼠的不同數(shù)目的MCF-7細(xì)胞均可被成功捕獲，由于留置針表面面積及對細(xì)胞的吸附容量限制，捕獲效率隨添加細(xì)胞數(shù)增加而降低，由于病人血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目非常少，因此，此方法用于臨床檢測時，這種捕獲效率的降低不會產(chǎn)生實質(zhì)性的影響。由于裸鼠有免疫缺陷，注入裸鼠靜脈的MCF-7不會被免疫系統(tǒng)破壞，因此留置針用于裸鼠的捕獲效率遠(yuǎn)高于野生小鼠，這也進(jìn)一步驗證了本方法的可行性。由于留置針表面修飾有抗體，起到了對PDMS吸附位點的封閉作用，可大大降低非特異性吸附，實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)修飾的留置針不會比未經(jīng)PDMS包被及抗體吸附的留置針吸附出更多的紅細(xì)胞與白細(xì)胞。
[0026]表1
【權(quán)利要求】
1.一種基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，其特征在于:包括留置針，留置針外表面包覆有可吸附蛋白的材料，可吸附蛋白的材料上吸附有用于特異性識別與捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞特異性抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，其特征在于:所述可吸附蛋白的材料是指可通過共價偶聯(lián)、氫鍵作用、疏水作用或者分子間作用力吸附蛋白質(zhì)的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，其特征在于:所述可吸附蛋白的材料選自聚二甲基硅氧烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，其特征在于:所述上皮細(xì)胞特異性抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體或核酸適配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，其特征在于:所述上皮細(xì)胞特異性抗體根據(jù)需要捕獲的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞而選擇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置，其特征在于:需要捕獲乳腺癌細(xì)胞時，所述上皮細(xì)胞特異性抗體選自抗上皮細(xì)胞粘附分子抗體。
7.權(quán)利要求1~6中任一項所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置的制備方法，其特征在于:步驟如下: (DPDMS包覆:PDMS前體液及其固化劑按體積比5:1比例混合均勻，得混合液，然后將留置針浸沒于該混合液中，順時針旋轉(zhuǎn)留置針I(yè)周以上使包覆均勻，然后取出，置于65°C干燥箱中固化3小時，得包覆有PDMS的留置針； (2)抗體的吸附:將包覆有PDMS的留置針浸沒于濃度為I~500 μ g -mr1的上皮細(xì)胞特異性抗體溶液中，振搖2小時，取出后用PBS緩沖液清洗3次，即得。
8.利用權(quán)利要求1~6中任一項所述的基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于:利用基于留置針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體捕獲裝置給攜帶有目標(biāo)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的癌癥患者輸液，在輸液過程中，癌癥患者血管中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞即被留置針上修飾的特異性抗體捕獲；輸液過程完成后，將留置針拔出，從而將捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞清除出體外，用洗脫液洗脫，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞洗下。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述洗脫液選自磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4，0.1mol .L-1)、甘氨酸緩沖溶液(pH2.7,0.1mol 噸―1)或氫氧化鈉溶液(pH13.6,0.4mol.L—1)。
【文檔編號】A61B10/02GK103908306SQ201410153597
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】張鴻雁, 賈真珍, 武傳琛, 唐波 申請人:山東師范大學(xué)