羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗的特性，制備得到了用于羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，所述的耐熱凍干保護(hù)劑中含有海藻糖30～70g/L，脫脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明膠5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，維生素C1～5g/L，剩余成分為超純水。本發(fā)明的耐熱凍干保護(hù)劑可以使疫苗在2～8℃保存24個(gè)月，病毒效價(jià)不發(fā)生大的改變，疫苗產(chǎn)品凍干前后病毒損失率為0.3個(gè)滴度，在37℃條件下保存30d，病毒損失率僅為1.0個(gè)滴度。本發(fā)明解決了羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗僅能在-15℃條件下保存和運(yùn)輸?shù)钠款i技術(shù)，使疫苗的儲(chǔ)存、運(yùn)輸更為方便。
【專利說(shuō)明】羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種活疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法，特別涉及用于羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗制備的耐熱凍干保護(hù)劑及其制備方法。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]凍干保護(hù)劑及其制備工藝是活疫苗生產(chǎn)中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)疫苗的保存，運(yùn)輸和使用有很大影響。目前，動(dòng)物疫苗中，活的凍干疫苗占相當(dāng)大的比例，國(guó)內(nèi)常用的保護(hù)劑主要為牛奶、蔗糖、明膠等，雖然其外形穩(wěn)定、易溶性良好、成本低廉、保存方便，但其熱穩(wěn)定性和保護(hù)功能差，而且產(chǎn)品對(duì)冷鏈的要求高。2~8°C條件下，保存期只有3~6個(gè)月，大多需要在-15°C以下保存，這給疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸帶來(lái)很大的困難。加上基礎(chǔ)獸醫(yī)防疫部門(mén)缺乏必要的冷凍和冷藏設(shè)施，容易造成因保存條件不完善而導(dǎo)致疫苗是失活，效價(jià)降低。造成免疫失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)達(dá)國(guó)家早在20世紀(jì)80年代就已開(kāi)始進(jìn)行耐熱凍干保護(hù)劑的研究。目前國(guó)外生產(chǎn)的弱毒疫苗基本都采用耐熱凍干保護(hù)劑生產(chǎn)疫苗，但研制方法和耐熱凍干保護(hù)劑的配方未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。我國(guó)在耐熱凍干保護(hù)劑方面的研究起步較晚，雖然目前在這方面的研究取得了一定的成果，但產(chǎn)品配套還不齊全，且與國(guó)外同類產(chǎn)品相比仍有一定差距，
[0003]中國(guó)加入WTO后，我國(guó)畜牧業(yè)得到快速發(fā)展，我國(guó)動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的不斷擴(kuò)大，疫苗的使用量和種類也隨之增加，加上中國(guó)市場(chǎng)巨大，國(guó)外生物制品涌入，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)加劇。為了促進(jìn) 本國(guó)生物制品業(yè)的生存和發(fā)展，加快新型有效的耐熱保護(hù)劑的研究和應(yīng)用，提高動(dòng)物疫苗的質(zhì)量，切實(shí)做好動(dòng)物疫病防控工作，迫在眉睫。
[0004]近年來(lái)，羊傳染性膿皰病(Orf)俗稱“羊口瘡”，在世界各養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)的羊群中均有發(fā)生，被認(rèn)為呈全球性流行的趨勢(shì)。該病的發(fā)生非常頻繁，且感染狀況也日益嚴(yán)重，甚至表現(xiàn)全群暴發(fā)流行的趨勢(shì)。在國(guó)內(nèi)許多大型的種羊場(chǎng)都有該病流行，給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然，羊口瘡弱毒疫苗在青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所均被研制過(guò)，并申報(bào)過(guò)地方新獸藥證書(shū)，但因制造工藝復(fù)雜、落后，疫苗凍干保護(hù)劑組方簡(jiǎn)單，使得所制備的使得所制備的到的疫苗對(duì)抗原的保護(hù)性差，且存在保存、運(yùn)輸不便等缺點(diǎn)。目前，市面上很難買到羊口瘡疫苗。
[0005]本發(fā)明針對(duì)羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗的特性，成功制備了一種羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒的耐熱凍干保護(hù)劑，該凍干保護(hù)劑可以使該疫苗在2~8°C保存24個(gè)月，病毒效價(jià)不發(fā)生大的改變。依據(jù)該疫苗的凍干工藝進(jìn)行凍干試驗(yàn)，疫苗產(chǎn)品凍干前后病毒損失率為0.3個(gè)滴度，用該凍干保護(hù)劑制備的疫苗在37°C條件下保存30d，病毒損失率僅為
1.0個(gè)滴度，且用該耐熱型凍干保護(hù)劑制備的疫苗，其塑形性和復(fù)溶性都非常好。
[0006]因此，本發(fā)明解決了羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗僅能在-15°C條件下保存和運(yùn)輸?shù)钠款i技術(shù)，使疫苗的儲(chǔ)存、運(yùn)輸更為方便。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的配方及其制備方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種配制方法簡(jiǎn)單、成本低、能夠應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)、并具有良好抗原保護(hù)性能的羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑，以便降低羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗保存條件，延長(zhǎng)保存期，從而降低疫苗的保存和使用成本。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明的一種羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑中含有:海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L,明膠5~15g/L，精氨酸0.5~4g/L,維生素Cl~5g/L,剩余成分為超純水。
[0010]優(yōu)選的，各組分的重量體積百分比為:海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C2.5g/L，剩余成分為超純水。
[0011]本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法。
[0012]一種羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法包括如下步驟如下(按配制IL計(jì)算):
[0013]I)稱取海藻糖30~70g，脫脂奶粉10~30g，聚乙烯吡咯烷酮10~30g，明膠5~15g，將稱取得到的上述物質(zhì)加入超純水中加熱至50~60°C溶解后，于116°C滅菌30分鐘后制成A液；
[0014]2)稱取精氨酸0.5~4g,維生素Cl~5g溶解于超純水中，用孔徑為0.22 μ m濾月旲過(guò)濾除囷后制成B液；
[0015]3)將完成除菌的A液和B液混合，定容至1L，即為所述的耐熱凍干保護(hù)劑。
[0016]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，稱取海藻糖50g，脫脂奶20g，聚乙烯吡咯烷酮20g，明膠IOg,精氨酸1.5g，維生素C2.5g。
[0017]本發(fā)明針對(duì)羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗的特性，制備羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗的耐熱凍干保護(hù)劑，該凍干保護(hù)劑可以使疫苗在2~8°C保存24個(gè)月，病毒效價(jià)不發(fā)生大的改變。依據(jù)該疫苗的凍干工藝進(jìn)行凍干試驗(yàn)，疫苗產(chǎn)品凍干前后病毒損失率為
0.3個(gè)滴度，用該凍干保護(hù)劑制備的疫苗在37°C條件下保存30d，病毒損失率僅為1.0個(gè)滴度。且用該耐熱型凍干保護(hù)劑制備的疫苗，其塑形性和復(fù)溶性都非常好。本發(fā)明最大的優(yōu)點(diǎn)是解決了現(xiàn)有凍干保護(hù)劑成分簡(jiǎn)單、耐熱性差，保存、運(yùn)輸不便的等缺陷，提供了一種具有耐熱性好、可有效防止羊傳染性膿皰病毒抗原成分的降解，配方成分及制備方法簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)的耐熱凍干保護(hù)劑。另外，本發(fā)明解決了羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗僅能在-15°C條件下保存和運(yùn)輸?shù)钠款i技術(shù)，使疫苗的儲(chǔ)存、運(yùn)輸更為方便。
[0018]因此，本發(fā)明還提出所述的羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑在制備羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗中的應(yīng)用。
[0019]優(yōu)選的，制備疫苗時(shí)，將所述的羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑和羊傳染性膿皰病毒抗原按體積比1:1比例混合均勻后，進(jìn)行分裝、冷凍干燥。
[0020]其中，優(yōu)選的，所述的冷凍干燥包括以下步驟:在疫苗裝箱前，首先將凍干箱預(yù)冷2h，箱內(nèi)溫度達(dá)-45°C后，將分裝好疫苗裝箱，保持_45°C，預(yù)凍3h，然后開(kāi)始抽真空至IO-4Pa,接著開(kāi)始升溫，16h內(nèi)升溫至_20°C，之后以5°C /h的速度升溫至20°C，維持6h后壓塞子出箱。
[0021]本發(fā)明的耐熱凍干保護(hù)劑可以使羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒凍干疫苗在2~8°C條件下保存24個(gè)月以上，達(dá)到了《中華人民共和國(guó)獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023][實(shí)施例1]耐熱凍干保護(hù)劑的制備(按配制IL計(jì)算)
[0024]羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法，包括如下步驟:
[0025]I)稱取海藻糖50g，脫脂奶20g，聚乙烯吡咯烷酮20g，明膠10g，將稱取得到的上述物質(zhì)加入500mL超純水中加熱至55°C溶解后，于116°C滅菌30分鐘后制成A液；
[0026]2)稱取精氨酸1.5g，維生素C2.5g溶解于200mL超純水中，用孔徑為0.22μπι濾月旲過(guò)濾除囷后制成B液；
[0027]3)將完成除菌的A液和B液混合，定容至1L，即為凍干保護(hù)劑。
[0028][實(shí)施例2]耐熱凍干保護(hù)劑的制備(按配制IL計(jì)算)
[0029]羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法，包括如下步驟:
[0030]1)稱取海藻糖30g，脫脂奶粉30g，聚乙烯吡咯烷酮10g，明膠15g，將稱取得到的上述物質(zhì)加入500mL超純水中加熱至50°C溶解后，于116°C滅菌30分鐘后制成A液；
[0031]2)稱取精氨酸0.5g,維生素C3.5g,溶解于200mL超純水中,用孔徑為0.22μηι濾月旲過(guò)濾除囷后制成B液；
[0032]3)將完成除菌的A液和B液混合，定容至1L，即為凍干保護(hù)劑。
[0033][實(shí)施例3]耐熱凍干保護(hù)劑的制備(按配制IL計(jì)算)
[0034]1)稱取海藻糖70g，脫脂奶粉10g，聚乙烯吡咯烷酮30g，明膠5g，將稱取得到的上述物質(zhì)加入500mL超純水中加熱至60°C溶解后，于116°C滅菌30分鐘后制成A液；
[0035]2)稱取精氨酸4g，維生素Clg溶解于200mL超純水中，用孔徑為0.22 μ m濾膜過(guò)濾除囷后制成B液；
[0036]3)將完成除菌的A液和B液混合，定容至1L，即為凍干保護(hù)劑。
[0037][實(shí)施例4]羊傳染性膿皰病毒弱毒抗原及弱毒疫苗的制備
[0038]將羊傳染性膿皰病毒HCE株弱毒株(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所分離、保存)90代細(xì)胞種毒，以5%的接種量接種生長(zhǎng)良好的犢牛睪丸原代細(xì)胞后，培養(yǎng)40~72小時(shí)，細(xì)胞病變達(dá)到75%以上時(shí)收獲，置-20°C凍融兩次，細(xì)胞菌檢、安全檢驗(yàn)合格且病毒毒價(jià)達(dá)到制苗標(biāo)準(zhǔn)(病毒抗原TCID5tl均不低于106/0.1mL為合格)即為羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗抗原。將該抗原與耐熱凍干保護(hù)劑(實(shí)施例1制備)以體積比1:1的比例混勻后，以2mL/瓶在無(wú)菌條件下封裝于鏈瓶?jī)?nèi)，在低溫冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，即為成品弱毒疫苗，將其在8°C以下溫度保存。
[0039]其中，冷凍干燥的過(guò)程包括如下步驟:在疫苗裝箱前，首先將凍干箱預(yù)冷2h，箱內(nèi)溫度達(dá)_45°C后，將分裝好的疫苗裝箱，保持_45°C，預(yù)凍3h，然后開(kāi)始抽真空至10_4Pa，接著開(kāi)始升溫，16h內(nèi)升至_20°C，之后以5°C /h的速度升溫至20°C，維持6h后壓塞子出箱。
[0040][實(shí)施例5]羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的篩選 [0041]1、凍干保護(hù)劑對(duì)病毒抗原的保護(hù)、凍干保護(hù)劑的塑形性、復(fù)溶性試驗(yàn)
[0042]按照表1配方，將各組耐熱凍干保護(hù)劑的干物質(zhì)組份按比例混合，保護(hù)劑的有效物質(zhì)組份進(jìn)行除菌處理:(1)對(duì)可高壓滅菌的物質(zhì):海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脫脂奶粉、明膠等按各自比例溶于超純水中，加熱至50~60°C溶解后，116°C滅菌30分鐘；
(2)將不耐高溫的物質(zhì)精氨酸、脯氨酸、維生素C、尿素、谷氨酸鈉等也按各自比例溶于超純水中，用孔徑為0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌:各組分別將(I )、(2)兩組份混合，分別得到各自的耐熱凍干保護(hù)劑。
[0043]按照實(shí)施例4的方法，將抗原與分別按各組配方制備得到的耐熱凍干保護(hù)劑以體積比1:1的比例混勻后，無(wú)菌條件下以2mL/瓶封裝于鏈瓶?jī)?nèi)，在低溫冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干，對(duì)制備得到的凍干疫苗中抗原含量進(jìn)行測(cè)定，各配方凍干保護(hù)劑對(duì)病毒抗原的保護(hù)、凍干保護(hù)劑的塑形性、復(fù)溶性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0044]表1凍干保護(hù)劑對(duì)病毒抗原的保護(hù)及塑形性和復(fù)溶性
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于所述耐熱凍干保護(hù)劑中含有海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L，明膠5~15g/L,精氨酸0.5~4g/L,維生素Cl~5g/L,剩余成分為超純水。
2.如權(quán)利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑，其特征在于所述耐熱凍干保護(hù)劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L,維生素C2.5g/L,剩余成分為超純水。
3.權(quán)利要求1或2所述的羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑在制備羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于制備疫苗時(shí)將權(quán)利要求1或2所述的羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑和羊傳染性膿皰病毒抗原按體積比1:1比例混合均勻后，進(jìn)行分裝，冷凍干燥。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的冷凍干燥包括以下步驟:在疫苗裝箱前，首先將凍干箱預(yù)冷2小時(shí)，箱內(nèi)溫度達(dá)_45°C后，將分裝好的疫苗裝箱，保持_45°C，預(yù)凍3小時(shí)，然后開(kāi)始抽真空至10_4Pa，接著開(kāi)始升溫，16h內(nèi)升溫至-20°C，之后以5°C /h的速度升溫至20°C，維持6h后壓塞子出箱。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗耐熱凍干保護(hù)劑的方法，按配制IL計(jì)算，其特征在于包括以下步驟: 1)稱取海藻糖30~70g，脫脂奶粉10~30g，聚乙烯吡咯烷酮10~30g，明膠5~15g，將稱取得到的上述物質(zhì)加入超純水中加熱至50~60°C溶解后，于116°C滅菌30分鐘后制成A液； 2)稱取精氨酸0.5~4g，維生素Cl~5g溶解于超純水中，用孔徑為0.22 μ m濾膜過(guò)濾除囷后制成B液； 3)將完成除菌的A液和B液混合，定容至1L，即為所述的耐熱凍干保護(hù)劑。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于稱取海藻糖50g，脫脂奶20g，聚乙烯吡咯烷酮20g，明膠1Og,精氨酸1.5g，維生素C2.5g。
【文檔編號(hào)】A61K47/46GK103893776SQ201410101828
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】劉湘濤, 王光祥, 尚佑軍, 張志東, 王艷華, 黎攝兒, 田宏, 吳錦艷, 陳妍, 逯忠新 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所