賽葵總黃酮提取物及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了賽葵總黃酮提取物，總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于1%。本發(fā)明還提供了該提取物的制備方法和用途。本發(fā)明賽葵總黃酮提取物質(zhì)量穩(wěn)定，可控，提取工藝簡便可行，不污染環(huán)境，適合大規(guī)模提取。賽葵總黃酮提取物用于治療前列腺疾病，尤其是治療前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌以及非細(xì)菌性前列腺炎，藥效明確，安全，為臨床提供了一種新的用藥選擇。
【專利說明】賽葵總黃酮提取物及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及賽葵提取物，屬藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】[0002]賽葵Malvastrum coromandelianum(L.) Garcke為錦葵科亞灌木植物,別名黃花草或黃花棉。為多年生錦葵目草本，原產(chǎn)于美洲，現(xiàn)以廣布于全球的熱帶區(qū)域。我國主要分布于臺灣、福建、廣東、香港、海南、廣西、云南。賽葵以全草入藥，性苦、淡，涼。具有清熱利濕，解毒散瘀之功效。主治濕熱瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、咽喉腫痛、痔瘡、癰腫瘡毒、跌打損傷、前列腺炎。民間常用來治療黃疸型肝炎，藥理實驗有報道證明賽葵具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用(田輝，等，賽葵的生藥學(xué)研究，中藥材第29卷第8期2006年8月)。
[0003]目前針對賽葵中的活性成分或有效部位尚無相關(guān)文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種賽葵提取物。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了該提取物的制備方法和用途。
[0005]本發(fā)明提供了一種賽葵總黃酮提取物，總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于1%。進一步的，總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于3% ;進一步優(yōu)選地，總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于20% ;更進一步優(yōu)選地，總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于55%,以楊梅素含量計不少于50%。
[0006]它是由水或有機溶劑提取制備而成。
[0007]進一步優(yōu)選地，所述的有機溶劑是濃度為70%以上的乙醇。
[0008]本發(fā)明賽葵總黃酮提取物是由由水或有機溶劑，采用回流提取、索氏提取、超聲提取、微波提取、超臨界CO2萃取、浸潰或滲漉提取方法制備而成。
[0009]本發(fā)明還提供了一種制備所述的賽葵總黃酮提取物的方法，它包括如下步驟:
[0010]a、稱取賽葵，加水或有機溶劑浸泡；
[0011]b、采用水浴加熱回流提取、索氏提取、超聲提取、微波提取、超臨界CO2萃取、浸潰或滲漉提取方法；殘渣用相應(yīng)溶劑洗滌，合同濾液，過濾，即得本發(fā)明賽葵總黃酮提取物。
[0012]其中，所述的有機溶劑為70%以上的乙醇。
[0013]其中，還包括步驟c:純化，具體純化方法如下:
[0014]①用乙醇浸泡生藥量的AB-8型大孔樹脂后，上柱進行預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇流動清洗，至流出的乙醇液至乙醇液與水1:5混合不呈白色混濁為止，然后以蒸餾水沖洗至水洗液無醇味；
[0015]②取b步驟的賽葵提取液上樣，先用4倍柱體積的水洗脫，棄去洗脫液；繼用4倍柱體積10%的乙醇洗脫，棄去洗脫液；然后用8倍40%的乙醇洗脫，收集洗脫液,減壓回收乙醇，濃縮至干，即得賽葵總黃酮；總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于55%，以楊梅素含量計不少于50%。[0016]本發(fā)明還提供了所述的賽葵總黃酮提取物在制備治療前列腺疾病的藥物中的用途。
[0017]其中，所述的藥物是治療前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌的藥物。
[0018]本發(fā)明還提供了所述的藥物是治療非細(xì)菌性前列腺炎的藥物。
[0019]本發(fā)明賽葵總黃酮提取物質(zhì)量穩(wěn)定，可控，提取工藝簡便可行，不污染環(huán)境，適合大規(guī)模提取。賽葵總黃酮提取物用于治療前列腺疾病，尤其是治療前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌以及非細(xì)菌性前列腺炎，藥效明確，安全，為臨床提供了一種新的用藥選擇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1各組大鼠前列腺組織的病理變化[0021 ] 圖2各組大鼠前列腺組織病理變化
【具體實施方式】
[0022]實施例1賽葵提取物的制備(回流提取法)
[0023]稱取賽葵20g，分別加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，在水浴上加熱回流提取2次.每次lh，趁熱過濾，殘渣洗滌2~3次，合并濾液回收至無醇味，加水溶解至每ImL含
0.5g生藥,離心(4000r / min) 15min,過濾,備用。取1.0mL取置于25mL量瓶中，加水6.0mL ；加入5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))亞硝酸鈉溶液1.0mL，使混勻，放置6min ;加入10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鋁1.0mL,搖勻，放置6min ;再加入4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液10.0mL,加水至刻度，搖勻，放置15min ;照分光光度法(中國藥典2010版一部附錄VB)于500nm的波長處測定吸光度A。樣品溶液中總黃酮的提取率(總黃酮提取率=總黃酮質(zhì)量/賽葵質(zhì)量X 100% )。賽葵總提取物質(zhì)量約為3.0g，總黃酮的含量以蘆丁計為0.526g，占總提取物的17.5%，總黃酮提取率為2.63%。
[0024]實施例2賽葵提取物的制備(索氏提取法)
[0025]稱取賽葵5g，分別加入50ml的70%乙醇浸泡30min后，將溫度控制在85°C，提取4h,趁熱抽濾。殘渣用相應(yīng)溶劑洗滌2~3次，合并濾液回收至無醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生藥,離心(4000r/min) 15min,過濾,備用。按上述分光光度法測定總黃酮,此法提取得到的賽葵總提取物質(zhì)量約為0.9g，總黃酮的含量以蘆丁計為0.140g,占總提取物16%，總黃酮提取率為2.79%。
[0026]實施例3賽葵提取物的制備(超聲提取法)
[0027]稱取賽葵20g，分別加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，超聲(300W)提取2次，每次30min，趁熱抽濾。殘渣用相應(yīng)溶劑洗滌2~3次，合并濾液回收至無醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生藥,離心(4000r / min) 15min,過濾,備用。按上述分光光度法測定總黃酮，此法提取得到的賽葵總提取物質(zhì)量約為3.5g，總黃酮的含量以蘆丁計為0.716g,占總提取物20%，總黃酮提取率為3.58%。
[0028]實施例4賽葵提取物的制備(微波提取法)
[0029]稱取賽葵5g，分別加入200ml的70%乙醇浸泡30min后，微波(400W)提取5min，趁熱抽濾，殘渣用相應(yīng)溶劑洗滌2~3次，合并濾液回收至無醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生藥，離心(4000r/min) 15min,過濾，備用。按上述分光光度法測定總黃酮，此法提取得到的賽葵總提取物質(zhì)量約為2.0g,總黃酮的含量以蘆丁計為0.149g,占總提取物7%，總黃酮提取率為2.97%。
[0030]實施例5賽葵提取物的制備(超臨界CO2萃取法)
[0031]稱取賽葵5g,裝入萃取爸中，在以lmL/g的無水乙醇為夾帶劑，萃取溫度60°C，萃取壓力35MPa，萃取時間lh，CO2流量SOkg/tT1的CO2超臨界萃取系統(tǒng)中萃取，收集萃取液，回收至無醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生藥,離心(4000r / min) 15min,過濾,備用。按上述分光光度法測定總黃酮，此法提取得到的賽葵總提取物質(zhì)量約為2.0g，總黃酮的含量以蘆丁計為0.099g,占總提取物5%，總黃酮提取率為1.97%。
[0032]實施例6賽葵提取物的制備(浸潰法)
[0033]稱取賽葵5g，于70%乙醇、料液比1: 20、浸潰6h、室溫條件下浸潰提取，抽濾，殘渣用相應(yīng)溶 劑洗滌2~3次，合并濾液回收至無醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生藥，離心(4000r / min)15min，過濾，備用。按上述分光光度法測定總黃酮，此法提取得到的賽葵總提取物質(zhì)量約為2.0g,總黃酮的含量以蘆丁計為0.066g,占總提取物3%，總黃酮提取率為 1.31%。
[0034]實施例7賽葵提取物的制備(滲漉提取法)
[0035]稱取賽葵20g，用80%乙醇潤濕后裝入滲漉柱中，加溶劑浸泡24h后開始滲漉，控制流速3mL/min,收集滲漉液，回收至無醇味，加水溶解至每ImL含0.5g生藥,離心(4000r / min)15min，過濾，備用。按上述分光光度法測定總黃酮，此法提取得到的賽葵總提取物質(zhì)量約為2.5g，總黃酮的含量以蘆丁計為0.414g,占總提取物17%，總黃酮提取率為
2.07%。
[0036]實施例8賽葵總黃酮的純化
[0037]用乙醇浸泡4倍生藥量的AB-8型大孔樹脂24h后，上柱進行預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇流動清洗，至流出的乙醇液至乙醇液與水1:5混合不呈白色混濁為止，然后以蒸餾水沖洗至水洗液無醇味。取賽葵提取液40mL (每ImL含0.5g生藥，總黃酮含量不得少于1%)上樣，先用4倍柱體積的水洗脫，棄去洗脫液；繼用4倍柱體積10%的乙醇洗脫，棄去洗脫液；然后用8倍40%的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，即得總黃酮。純化得到的總黃酮的提取率約為3%，從提取液中的轉(zhuǎn)移率為84%。
[0038]其中，實施例1-7中提取方法得到的都是粗黃酮，經(jīng)過實施例8的純化，得到本發(fā)明賽葵總黃酮，所述的賽葵總黃酮中總黃酮的百分含量，以蘆丁計，不少于55%，以楊梅素計不得少于50%。
[0039]具體含量測定方法及檢測數(shù)據(jù)為:
[0040]以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定賽葵總黃酮含量。即精密稱取蘆丁對照品23.0mg，置50mL量瓶中，加95%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。精密吸取對照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL，分別置于25mL量瓶中，加水至6.0mL ;加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，使混勻，放置6min ;加入10%硝酸鋁1.0mL，搖勻，放置6min ;再加入4%氫氧化鈉溶液10.0mL，加水至刻度，搖勻，放置15min ;照分光光度法(中國藥典2010版一部附錄VB)于500nm的波長處測定吸光度A，計算得出回歸方程。精密吸取樣品溶液1.0mL置IOmL量瓶中，再精密吸取溶液1.0mL，按以上方法，自“加水至6.0mL”起依法測定吸光度，代入回歸方程計算出樣品溶液中總黃酮的百分含量。(總黃酮的百分含量=總黃酮的含量/總提取物)
[0041]經(jīng)三次實驗，純化得到賽葵總黃酮百分含量分別為58%、54%、61%，結(jié)果得賽葵總黃酮平均百分含量約為58%。
[0042]以楊梅素為對照品，采用紫外分光光度法測定賽葵總黃酮含量。取楊梅素對照品
14.18m g,置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，定容于25mL，制得濃度為0.1592mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，精密量取楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量0、4、8、12、16、20 μ L,分別置于ImL容量瓶中。分別加入5%氯化鋁3mL，用甲醇定容于10mL，放置20min，隨行試劑為空白，在270nm波長處測定吸光度，計算得出回歸方程。精密吸取樣品溶液1.0mL置IOmL量瓶中，再精密吸取溶液1.0mL，按以上方法，測定吸光度，代入回歸方程計算出樣品溶液中總黃酮的百分含量。(總黃酮的百分含量=總黃酮的含量/總提取物)
[0043]經(jīng)三次實驗，純化得到的賽葵總黃酮百分含量分別49%、53%、51%，結(jié)果得賽葵總黃酮平均百分含量為51%。
[0044]以下通過具體藥效學(xué)試驗或體外實驗證明本發(fā)明的有益效果。
[0045]試驗例I賽葵提取物對非細(xì)菌性前列腺炎的保護作用
[0046]1 材料 [0047]1.1動物SD大鼠，清潔級，雄性，180~220g ；KM小鼠，清潔級，雄性，體重18~22g，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。
[0048]1.2藥品與試劑賽葵提取物(實施例3制得)；舍尼通由南京美瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號20070514 ;消痔靈注射液由北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號061212 ;角叉菜膠購自Sigma公司；速尿注射液(SN)購自常州康普藥業(yè)有限公司，ELISA試劑盒均由Uscn Life Science Inc.公司提供。
[0049]2 方法
[0050]2.1賽葵提取物對慢性非細(xì)菌性前列腺炎的保護作用將SD大鼠麻醉后剪除下腹部被毛，在無菌條件下腹部切口深入腹腔，暴露前列腺，以25%消痔靈注射液注射至2個前列腺側(cè)葉，縫合腹壁。術(shù)后第7天將大鼠隨機分成6組，即空白組，模型組，賽葵提取物低、中、高劑量組(8、4、2g*kg-l)，陽性藥舍尼通組(60mg ^kg-1),每組10只，按體重連續(xù)灌胃給藥30d，每天給藥I次，空白組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后處死大鼠，腹主動脈取血，離心，取血清，采用ELISA法檢測大鼠血清IL-1 β，IL-2及TNF- α的含量各組大鼠腹主動脈取血，2000Xg離心lOmin，取血清。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。剖取前列腺組織，肉眼觀察前列腺病變狀態(tài)并稱濕重，計算前列腺指數(shù)；取前列腺按摩液10 μ L放入白細(xì)胞稀釋液中，光學(xué)顯微鏡下觀察，計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)；另取一滴前列腺液涂片，鏡下觀察卵磷脂小體密度，評分標(biāo)準(zhǔn)為:卵磷脂小體滿視野(+++)為4分，1/2視野(++)為3分，1/4視野(+)為2分，低倍鏡下僅見數(shù)個為I分。取另一側(cè)前列腺側(cè)葉，置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)脫水透明，石蠟切片一部分HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。
[0051]2.2角叉菜膠致大鼠急性前列腺炎試驗將SD大鼠(350~400g)隨機分成6組，即空白組、模型組、賽葵提取物低劑量組(2g/kg)、賽葵提取物中劑量組(4g/kg)、賽葵提取物高劑量組(8g/kg)、陽性藥舍尼通組(60mg/kg),每組10只。按體重預(yù)先連續(xù)灌胃給藥7d,每天給藥一次，空白組和模型組給予等量生理鹽水。第6天給藥后30min，將大鼠麻醉，下腹部正中切口，暴露前列腺，在前列腺側(cè)葉上的精液囊注入0.1%無菌角叉菜膠生理鹽水溶液，然后縫合腹壁。24h后稱重，處死大鼠，剖取前列腺稱濕重，計算前列腺指數(shù)；取前列腺按摩液IOyL放入白細(xì)胞稀釋液中，光學(xué)顯微鏡下觀察，計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)(WBC);另取一滴前列腺液涂片，鏡下觀察卵磷脂小體密度，評分標(biāo)準(zhǔn)為:卵磷脂小體滿視野(+++)為4分，1/2視野(++)為3分，1/4視野(+)為2分，低倍鏡下僅見數(shù)個為I分。
[0052]2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗將KM小鼠隨機分為6組，即空白組、模型組、賽葵提取物低劑量組(2g/kg)、賽葵提取物中劑量組(4g/kg)、賽葵提取物高劑量組(8g/kg)、陽性藥舍尼通組(60mg/kg)，每組10只。每鼠左耳兩面涂致炎液0.05mL，右耳作空白對照。分別灌胃給藥7d，每天給藥一次，空白組和模型組給予等量生理鹽水。最后一天給藥0.5h后處死小鼠，分別在同一部位打孔，分析天平稱重，計算腫脹率。
[0053]2.4小鼠棉球肉芽腫試驗將KM小鼠隨機分為6組，即空白組、模型組、賽葵提取物低劑量組(2g/kg)、賽葵提取物中劑量組(4g/kg)、賽葵提取物高劑量組(8g/kg)、陽性藥舍尼通組(60mg/kg)，每組10只。除空白組外，小鼠腋窩皮下手術(shù)植入滅菌棉球(10.0±0.5)mg。連續(xù)灌胃給藥7d，每天給藥一次，空白組和模型組給予等量生理鹽水。7d后稱重，處死小鼠。剝離肉芽組織，于60°C烘箱中烘干，稱重，計算肉芽腫重量。
[0054]2.5對雌性小鼠熱板致痛的影響取體重20±2g的雌性小鼠，按熱板法于試驗前在熱板測痛儀上測定痛閾值在5s-30s內(nèi)的小鼠60只，按體重隨機分為6組，即空白組、模型組、賽葵提取物低劑量組(2g/kg)、賽葵提取物中劑量組(4g/kg)、賽葵提取物高劑量組(8g/kg)、陽性藥舍尼通組(60mg/kg)，每組10只。以出現(xiàn)舔后足反應(yīng)為觀察指標(biāo)。分別于每鼠灌胃以上藥物，0.2mL/只。0.5h后按上法測定痛閾值，然后按前法給藥，測定lh、l.5h、2h的痛閾值。比較給藥前后痛閾的變化，并按(用藥后-用藥前平均痛閾值)/用藥前平均痛閾值X 100%計算痛閾提高百分率。
[0055]2.6水負(fù)荷大鼠排尿量試驗將健康SD雄性大鼠(180~220g)預(yù)先放置于代謝籠中I~2d適應(yīng)環(huán)境，選取自由飲水條件下尿量穩(wěn)定的大鼠50只，隨機分為正常對照組、陽性對照組(速尿注射液10mg/kg)和賽葵提取物低、中、高劑量組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7d，最后一天給藥前18h禁食不禁水，給藥前各組按2mL/100g體重劑量腹腔注射生理鹽水，然后灌胃給藥，對照組給予等量蒸餾水。給藥后立即將大鼠放入代謝籠中，每籠一只，1、2，4h后分別測量各組動物的尿量。
[0056]2.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以i ± S表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。
[0057]3 結(jié)果
[0058]3.1賽葵提取物對消痔靈誘導(dǎo)的慢性非細(xì)菌性前列腺炎的影響肉眼所見前列腺組織外觀:空白組大鼠前列腺組織呈粉紅色，質(zhì)軟、有光澤，與周圍組織無粘連；模型組大鼠前列腺腺體呈暗紅色或棕黃色，普遍與周圍組織粘連，質(zhì)硬，有明顯的硬結(jié)，并有水腫；舍尼通組大鼠前列腺腺體與周圍組織粘連較輕，部分腺體質(zhì)硬，有結(jié)節(jié)，色棕黃；賽葵提取物8、4g.kg-1劑量組前列腺腺體與周圍組織粘連輕，硬結(jié)小，部分腺體呈棕黃色，有輕度水腫，個別腺體柔軟、紅潤、有光澤，外觀與正常前列腺組織相似。
[0059]賽葵提取物的抗炎作用:模型組與空白組比較，前列腺液中WBC數(shù)增加、卵磷脂小體密度減少，呈現(xiàn)慢性前列腺炎的病理變化，表明造模成功。賽葵提取物8g.kg-1劑量組與模型組比較，WBC數(shù)減少、卵磷脂小體密度增加，表明該藥對消痔靈誘導(dǎo)的慢性前列腺炎有一定的抗炎作用，見表1。
[0060]表1賽葵提取物對消痔靈誘導(dǎo)的大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎的影響(無士s，n=10)
【權(quán)利要求】
1.賽葵總黃酮提取物，其特征在于:總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于1%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的賽葵總黃酮提取物，其特征在于:總黃酮的重量百分含量以蘆丁計，不少于55%，以楊梅素重量百分含量計不少于50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的賽葵總黃酮提取物，其特征在于:它是由水或有機溶劑提取制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的賽葵總黃酮提取物，其特征在于:所述的有機溶劑是70%以上的乙醇。
5.一種制備權(quán)利要求1-4任意一項所述的賽葵總黃酮提取物的方法，它包括如下步驟: a、稱取賽葵,加水或有機溶劑浸泡； b、采用水浴加熱回流提取、索氏提取、超聲提取、微波提取、超臨界CO2萃取、浸潰或滲漉提取方法；殘渣用相應(yīng)溶劑洗滌，合同濾液，過濾，即得本發(fā)明賽葵總黃酮提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述的有機溶劑為70%以上的乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:還包括步驟c:純化，具體純化方法如下: ①用乙醇浸泡生藥量的AB-8型大孔樹脂后，上柱進行預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇流動清洗，至流出的乙醇液至乙醇液與水1:5混合不呈白色混濁為止，然后以蒸餾水沖洗至水洗液無醇味； ②取b步驟的賽葵提取液上樣，先用4倍柱體積的水洗脫，棄去洗脫液；繼用4倍柱體積10%的乙醇洗脫，棄去洗脫液；然后用8倍40%的乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，即得賽葵總黃酮。
8.權(quán)利要求1-4任意一項所述的賽葵總黃酮提取物在制備治療前列腺疾病的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán) 利要求8所述的用途，其特征在于:所述的藥物是治療前列腺增生、前列腺炎或前列腺癌的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述的藥物是治療非細(xì)菌性前列腺炎的藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK103830288SQ201410089748
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】徐偉, 洪振豐 申請人:福建中醫(yī)藥大學(xué)