納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用，所述納米金是由以下粒徑的納米金顆粒組成：粒徑范圍9~15nm、平均粒徑11±0.5nm1份；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27±0.5nm1份；粒徑范圍41~63nm、平均粒徑48.5±0.5nm1份；粒徑范圍50~76nm、平均粒徑68±0.5nm1份；粒徑范圍93~114nm、平均粒徑104±0.5nm1份；粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.5±0.5nm1份；粒徑范圍151~176nm、平均粒徑166±0.5nm1份，按重量比計(jì)。本發(fā)明利用不同粒徑的納米金顆粒完成對(duì)腦外傷動(dòng)物血腦屏障通透性的定量測(cè)量，不僅可以測(cè)得滲入血腦屏障的納米金數(shù)量，還能通過(guò)滲入血腦屏障的納米金粒徑估算出血腦屏障開(kāi)放的最大孔隙，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各種血腦屏障損傷模型的提供了定量測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于利用材料測(cè)量的領(lǐng)域，具體涉及納米金在制備測(cè)量血腦屏障(BloodBrain Barrier, BBB)通透性試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血腦屏障是存在于人類(lèi)與動(dòng)物血液和腦組織之間的主要生理屏障。正常狀況下，血腦屏障的開(kāi)放程度只有幾納米，但在病理狀態(tài)下(特別是各種顱腦損傷)，血腦屏障可能將會(huì)開(kāi)放達(dá)到幾十甚至幾百納米，這將導(dǎo)致一系列繼發(fā)腦損傷。
[0003]血腦屏障的通透性極大程度地影響著各種顱腦損傷模型的預(yù)后。國(guó)內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血腦屏障通透性的檢測(cè)是判斷損傷程度與預(yù)后的重要實(shí)驗(yàn)手段?，F(xiàn)行主流的測(cè)量血腦屏障通透性的方法有十幾種，然而沒(méi)有一種可以定量地對(duì)血腦屏障通透性進(jìn)行測(cè)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的:
[0006]納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用。
[0007]上述納米金是由以下粒徑的納米金顆粒組成:粒徑范圍9~15nm、平均粒徑
11±0.5nml份；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27±0.5nml份；粒徑范圍41~63nm、平均粒徑48.5±0.5nml份；粒徑范圍50~76nm、平均粒徑68±0.5nml份；粒徑范圍93~114nm、平均粒徑104±0.5nml份；粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.5±0.5nml份；粒徑范圍151~176nm、平均粒徑166±0.5nml份,按重量比計(jì)。本發(fā)明不僅可以測(cè)得滲入血腦屏障的納米金數(shù)量，還能通過(guò)滲入血腦屏障的納米金粒徑估算出血腦屏障開(kāi)放的最大孔隙，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各種血腦屏障損傷模型的提供了定量測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0008]優(yōu)選地,上述納米金用水配制成溶液,溶液濃度為65~75ug/ml。所述納米金能迅速到達(dá)腦組織，并具靶向性的穩(wěn)定牢固的沉積于血腦屏障的開(kāi)放孔隙，且易于檢測(cè)。
[0009]上述納米金的制備方法，采用氯金酸與檸檬酸三鈉反應(yīng)制得，其特征在于:以質(zhì)量份數(shù)計(jì)，氯金酸1份，檸檬酸三鈉分別為5份、1.5份、1份、0.6份、0.42份、0.32份、0.25份在水溶液中反應(yīng)，氯金酸質(zhì)量濃度為1%，分別制得粒徑范圍9~15nm、平均粒徑11.05nm ；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27.33nm ;粒徑范圍41~63nm、平均粒徑53nm ;粒徑范圍50~76nm、平均粒徑68.12nm ;粒徑范圍93~114nm、平均粒徑103.97nm ;粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.66nm ;粒徑范圍151~176nm、平均粒徑165.96nm的納米金顆粒。
[0010]為了使納米金粒徑在恰當(dāng)范圍，上述納米金的制備方法，所述反應(yīng)溫度為90°C，時(shí)間為IOmin。
[0011]上述納米金的制備方法，包括以下步驟:在室溫下，將氯金酸晶體溶解于雙蒸水中配制成100ml濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱至90°C，維持10分鐘；分別迅速加入5.0ml、1.5ml、1.0ml,0.60ml,0.42ml,0.32ml,0.25ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌30分
鐘，攪拌速度設(shè)為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到納米金溶液；過(guò)濾后將納米金溶液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，棄除上清液，再用100ml雙蒸水溶解后在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，重復(fù)三次，最后用雙蒸水定容至100ml。
[0012]采用上述納米金測(cè)量血腦屏障通透性的方法，利用乙炔火焰法測(cè)定腦組織溶液中納米金的含量。
[0013]采用上述納米金測(cè)量血腦屏障通透性的方法，選取同樣程度腦外傷后24小時(shí)的雄性體重220-260g Sprague-Dawley大鼠,分別通過(guò)尾靜脈注射2ml上述納米金溶液；2小時(shí)后，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，灌注500ml生理鹽水后完整取出腦組織，去除小腦，對(duì)半切開(kāi)左右半腦，取傷測(cè)腦稱(chēng)重，置于IOml離心管中，按重量加入3ml/g的65%濃硝酸，加熱至900C I分鐘，于37°C恒溫箱孵育24小時(shí)，然后見(jiàn)腦組織完全溶解，過(guò)濾，最后每管用雙蒸水定容IOml制得樣本；采用乙炔火焰法測(cè)量每管樣本溶液中金元素的濃度:調(diào)節(jié)原子吸收分光光度計(jì)(日立NITACHI180-80)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為242.8nm,空氣壓力設(shè)為1.65kg/cm3,乙炔
0.25kg/cm3 ;通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)含金元素溶液標(biāo)定儀器，然后將樣本進(jìn)樣，進(jìn)樣Iml后開(kāi)始讀數(shù)，連續(xù)讀數(shù)五次取平均值，得到各粒徑納米金含量。
[0014]有益效果
[0015]1.本發(fā)明利用不同粒徑的納米金顆粒完成對(duì)腦外傷動(dòng)物血腦屏障通透性的定量測(cè)量，不僅可以測(cè)得滲入血腦屏障的納米金數(shù)量，還能通過(guò)滲入血腦屏障的納米金粒徑估算出血腦屏障開(kāi)放的最大孔隙，首次建立為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中各種血腦屏障損傷模型的提供了定量測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)。
[0016]2.本發(fā)明原料簡(jiǎn)單，操作方便快捷，所述納米金能迅速到達(dá)腦組織，并具靶向性的穩(wěn)定牢固的沉積于血腦屏障的開(kāi)放孔隙，且易于檢測(cè)，能準(zhǔn)確、真實(shí)的反映血腦屏障的開(kāi)放情況。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1實(shí)施例1制得的納米金顆粒的粒徑參數(shù)
[0018]圖2實(shí)施例1中乙炔火焰法測(cè)得各組樣本金含量
[0019]圖3實(shí)施例1中制得的納米金的電鏡圖(粒徑25nm)
[0020]圖4實(shí)施例1蛛網(wǎng)膜下腔出血后滲入血腦屏障的納米金的電鏡圖
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
[0022]實(shí)施例1
[0023]在室溫條件下，將氯金酸晶體溶解于雙蒸水中配制成100ml濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱至 90°C，維持 10 分鐘;迅速加入 5.0ml、1.5ml、1.0ml,0.60ml,0.42ml,0.32ml、
0.25ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌30分鐘，攪拌速度設(shè)為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到納米金溶液；過(guò)濾后將納米金溶液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，棄除上清液，再用100ml雙蒸水溶解后在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，重復(fù)三次，最后用雙蒸水定容至100ml。得到表1的納米金顆粒。使用馬爾文納米粒度儀檢測(cè)納米金粒徑，詳見(jiàn)圖1。
[0024]采用同樣程度腦外傷蛛網(wǎng)膜下腔出血后24小時(shí)的雄性Sprague-Dawley大鼠(體重 250-300g) 7 組(n=6)和正常對(duì)照 Sprague-Dawley 大鼠 I 組(n=6)(體重 250_300g)，分別通過(guò)尾靜脈注射2ml上述制得的組I~7的納米金溶液及等量0.9%生理鹽水。2小時(shí)后，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，灌注500ml生理鹽水后完整取出腦組織。去除小腦，對(duì)半切開(kāi)左右半腦，取傷測(cè)腦稱(chēng)重，置于IOml離心管中，按重量加入3ml/g的65%濃硝酸。加熱至90°C I分鐘，于37°C恒溫箱孵育24小時(shí)。然后見(jiàn)腦組織完全溶解，過(guò)濾。最后每管用雙蒸水定容
IOml o
[0025]采用乙炔火焰法測(cè)量每管溶液中金元素的濃度:調(diào)節(jié)原子吸收分光光度計(jì)(日立NITACHI 180-80)，吸收波長(zhǎng)設(shè)為242.8nm,空氣壓力設(shè)為1.65kg/cm3,乙炔0.25kg/cm3。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)含金元素溶解標(biāo)定儀器。然后將樣本進(jìn)樣，進(jìn)樣Iml后開(kāi)始讀數(shù)，每個(gè)樣讀數(shù)五次，記錄其平均值，詳見(jiàn)圖2。
[0026]由不同腦樣本含金濃度計(jì)算出各腦樣本含金量(含金量=濃度X 10ml)，再根據(jù)不同粒徑納米金滲入血腦屏障的量的差值計(jì)算出血腦屏障開(kāi)放孔隙在各個(gè)范圍所占比例，詳見(jiàn)表2。
[0027]
【權(quán)利要求】
1.納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用，所述納米金是由以下粒徑的納米金顆粒組成:粒徑范圍9~15nm、平均粒徑11 ±0.5nm 1份；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27±0.5nm 1份；粒徑范圍41~63nm、平均粒徑48.5±0.5nm 1份；粒徑范圍5(T76nm、平均粒徑68±0.5nm 1份；粒徑范圍93~114nm、平均粒徑104±0.5nm1份；粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.5±0.5nm 1份；粒徑范圍151~176nm、平均粒徑166±0.5nm 1份，按重量比計(jì)。
3.如權(quán)利要求2所述的納米金在制備測(cè)量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用，所述納米金用水配制成溶液，溶液濃度為65~75ug/ml。
4.如權(quán)利要求1~3任一所述納米金的制備方法，采用氯金酸與檸檬酸三鈉反應(yīng)制得，其特征在于:以質(zhì)量份數(shù)計(jì)，氯金酸1份，檸檬酸三鈉分別為5份、1.5份、1份、0.6份、0.42份、0.32份、0.25份在水溶液中反應(yīng)，氯金酸質(zhì)量濃度為1%，分別制得粒徑范圍擴(kuò)15nm、平均粒徑11.05nm ;粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27.33nm ;粒徑范圍41~63nm、平均粒徑53nm ；粒徑范圍5(T76nm、平均粒徑68.12nm ;粒徑范圍93~114nm、平均粒徑103.97nm ;粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.66nm ;粒徑范圍151~176nm、平均粒徑165.96nm的納米金顆粒。
5.如權(quán)利要求4所述納米金的制備方法，所述反應(yīng)溫度為90°C，時(shí)間為lOmin。
6.如權(quán)利要求4或5所述納米金的制備方法，包括以下步驟:在室溫下，將氯金酸晶體溶解于雙蒸水中配制成100ml濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱至90°C，維持10分鐘；分別迅速加入 5.0ml、1.5ml、1.0ml,0.60ml,0.42ml,0.32ml,0.25ml 的 1%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌30分鐘，攪拌速度設(shè)為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到納米金溶液；過(guò)濾后將納米金溶液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，棄除上清液，再用100ml雙蒸水溶解后在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，重復(fù)三次，最后用雙蒸水定容至100ml。
7.權(quán)利要求1-3任一所述納米金測(cè)量血腦屏障通透性的方法，利用乙炔火焰法測(cè)定腦組織溶液中納米金的濃度。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK103800920SQ201410036178
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】譚亮, 李飛, 胡榮, 李文龑, 馮華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院