用于產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的方法
【專利摘要】提供用于產(chǎn)生包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的方法等，所述方法的特征在于包括在含有Wnt信號傳遞途徑激動劑的無血清培養(yǎng)基或血清培養(yǎng)基中，將包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體僅培養(yǎng)一段時間直至出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞，并隨后在不含有Wnt信號傳遞途徑激動劑的無血清培養(yǎng)基或血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞聚集體”的步驟，在所述視網(wǎng)膜組織中Chx10陽性細胞以20%或更高的比例存在。根據(jù)本發(fā)明，可以高效產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)。
【專利說明】用于產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的方法等。

【背景技術(shù)】
[0002]已知體內(nèi)視網(wǎng)膜的睫狀邊緣帶為結(jié)構(gòu)形成和視網(wǎng)膜組織維持執(zhí)行重要功能(參見例如,非專利文件I),并且例如，已知RdhlO基因(非專利文件2)和Otxl基因(非專利文件I)是睫狀邊緣帶的基因標志物。然而，沒有已知的用于從多能干細胞高效產(chǎn)生該睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的方法。
[0003][文件列表]
[非專利文件]
專利文件 I:W.Zac Stephens, Megan Senecal, Minhtu Nguyen,和 TatjanaP1trowski (2010) Loss of adenomatous polyposis coli (ape) Results in anExpanded Ciliary Marginal Zone in the Zebrafish Eye.DEVELOPMENTAL DYNAMICS卷:239,頁:2066-2077
專利文件 2:Fumi Kubo 和 Shinichi Nakagawa (2009) Hairyl acts as a nodedownstream of Wnt signaling to maintain retinal stem cell-like progenitor cellsin the chick ciliary marginal zone.Development 卷:136,頁:1823-1833。
[0004]發(fā)明概述本發(fā)明待解決的問題
已存在開發(fā)用于高效產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的方法的期望。
[0005]解決問題的方法
考慮到該情形，本發(fā)明人已經(jīng)進行了深入研究并實現(xiàn)本發(fā)明。
[0006]尤其是，本發(fā)明提供:
1.用于產(chǎn)生包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的方法，其包括在各自含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中，將包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體僅在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前培養(yǎng)一段時間，隨后在各自不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)因此獲得的“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”的步驟，在所述視網(wǎng)膜組織中ChxlO陽性細胞以所述組織的20%或更高的比例存在(在下文中，有時候稱為本發(fā)明的產(chǎn)生方法)；
2.上述項目I的產(chǎn)生方法，其中出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前的一段時間是這樣的一段時間，在所述時間內(nèi)ChxlO陽性細胞以組織的50%-1%的比例存在于視網(wǎng)膜組織中，并且其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體是其中Chx 1陽性細胞以組織的50%-1%的比例存在于視網(wǎng)膜組織中的細胞聚集體；
3.上述項目2的產(chǎn)生方法，其中在各自不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)因此獲得的“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”，直至視網(wǎng)膜組織中存在的ChxlO陽性細胞的比例達到所述組織的50%或更高； 4.上述項目1-3中任一項的產(chǎn)生方法，其中所述視網(wǎng)膜組織來源于人多能干細胞；
5.通過上述項目1-4中任一項的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于評估毒性或藥物效力的試劑的用途；
6.通過上述項目1-4中任一項的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于移植的生物材料的用途；
坐寸ο
[0007]發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生方法，可以高效產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)。在通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體中，所述睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)充當前進區(qū)起功能，并且可以高效形成在睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)附近具有層結(jié)構(gòu)的連續(xù)神經(jīng)視網(wǎng)膜。
[0008]附圖簡述
圖1是這樣的圖，其顯示了在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)之前細胞聚集體的冷凍切片中表達Rax基因的細胞的GFP熒光圖像。
[0009]圖2是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)之前細胞聚集體的冷凍切片使用抗ChxlO抗體的熒光免疫染色圖像。圖1(顯示全部視網(wǎng)膜組織的存在)和圖2 (顯示ChxlO陽性細胞的存在)的比較證實了加入作用于fct信號途徑的物質(zhì)之前在全部的約40%中ChxlO陽性細胞的存在。
[0010]圖3是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)后的第3天細胞聚集體的冷凍切片中表達Rax基因的細胞的GFP熒光圖像。
[0011]圖4是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)后的第3天細胞聚集體的冷凍切片使用抗ChxlO抗體的熒光免疫染色圖像。圖3(顯示全部視網(wǎng)膜組織的存在)和圖4 (顯示ChxlO陽性細胞的存在)的比較揭示了向培養(yǎng)基中加入作用于fct信號途徑的物質(zhì)后的3天中僅在全部的約3%中的ChxlO陽性細胞的存在，由此可以證實清楚的降低。
[0012]圖5是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)39天后細胞聚集體的冷凍切片中表達Rax基因的細胞的GFP熒光圖像。
[0013]圖6是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)39天后細胞聚集體的冷凍切片使用抗RdhlO抗體的熒光免疫染色圖像。圖5 (顯示全部視網(wǎng)膜組織的存在)和圖6 (顯示RdhlO陽性細胞的存在)的比較證實了通過加入作用于fct信號途徑的物質(zhì)培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的RdhlO陽性細胞的存在。
[0014]圖7是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)50天后細胞聚集體的冷凍切片中表達Rax基因的細胞的GFP熒光圖像。
[0015]圖8是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)50天后細胞聚集體的冷凍切片使用抗RdhlO抗體的熒光免疫染色圖像。
[0016]圖9是這樣的圖，其顯示了在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)50天后細胞聚集體的冷凍切片使用抗Otxl抗體的熒光免疫染色圖像。圖7(顯示全部視網(wǎng)膜組織的存在)、圖8 (顯示RdhlO陽性細胞的存在)和圖9 (顯示Otxl陽性細胞的存在)的比較證實了通過加入作用于fct信號途徑的物質(zhì)培養(yǎng)3天，隨后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的RdhlO陽性細胞和Otxl陽性細胞的存在。
[0017]圖10顯示了含有在如下所示制備的細胞聚集體中含有的睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域的冷凍切片的染色圖像。將在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的細胞聚集體在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，并且在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)46天，然后在存在BrdU的情況下培養(yǎng)I天，然后在不存在BrdU的情況下培養(yǎng)13天，并在存在EdU (Invit1gen)的情況下培養(yǎng)I天。制備所獲得的細胞聚集體的冷凍切片并使其進行使用抗Ki67抗體(左圖)或抗BrdU抗體(右圖)的熒光免疫染色或利用EdU的顯色反應(yīng)(中間的圖)。
[0018]圖11顯示了含有在如下所示制備的細胞聚集體中含有的睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域的冷凍切片的染色圖像。將在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的細胞聚集體在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，并且在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)46天，然后在存在BrdU的情況下培養(yǎng)I天，然后在不存在BrdU的情況下培養(yǎng)13天,并在存在EdU (Invitrogen)的情況下培養(yǎng)I天,在不存在EdU的情況下進一步培養(yǎng)13天。制備所獲得的細胞聚集體的冷凍切片并使其進行使用抗Ki67抗體(左圖)或抗BrdU抗體(右圖)或抗RdhlO抗體(下圖)的熒光免疫染色，或利用EdU的顯色反應(yīng)(中間的圖)。
[0019]圖12是這樣的圖，其顯示了通過使在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的細胞聚集體在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，并在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)75天獲得的細胞聚集體的分析。
[0020]圖12A是所述條件下細胞聚集體的實例，并顯示了沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ)的細胞聚集體的相差圖像(A，左列，上圖)、沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體中表達Crx基因的細胞的GFP熒光圖像(A，左列，下圖)、含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的相差圖像(A，右列，上圖)、和含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體中表達Crx基因的細胞的GFP熒光圖像(A，右列，下圖)。
[0021]圖12B是與沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ-)的細胞聚集體和具有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ+)的細胞聚集體相關(guān)的圖像，其顯示了通過使用表達Crx基因的細胞的形成作為指標，在不少于10%的細胞聚集體周圍中含有連續(xù)的分層神經(jīng)視網(wǎng)膜的細胞聚集體比例的測定結(jié)果。
[0022]進行本發(fā)明的方式
下文詳細解釋了用于進行本發(fā)明的方式。
[0023]在本發(fā)明中，“干細胞”的實例包括即使在細胞分裂后仍然維持相同分化能力并且當組織損傷時可以再生組織的細胞。在本文中，“干細胞”可以是胚胎干細胞(ES細胞)或組織干細胞(也稱為組織干細胞、組織特異性干細胞或成體干細胞)，或人工多能干細胞(iPS細胞:誘導(dǎo)型多能干細胞)，但不限于這些。如從干細胞來源的組織細胞可以再生組織的事實中所理解的，已知干細胞可以分化成與活體中的正常細胞接近的正常細胞。
[0024]本發(fā)明中“多能干細胞”的實例包括可以在體外培養(yǎng)并且具有分化成構(gòu)成除胎盤以外的活體的任何細胞(三胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)來源的組織)的能力(多能性)的干細胞，包括胚胎干細胞(ES細胞)。從受精卵、克隆胚胎、生殖干細胞和組織中的干細胞獲得“多能干細胞”。其還包括在將若干種基因引入體細胞后具有與胚胎干細胞類似的人工多能性的細胞(也稱為人工多能干細胞)。可以通過本身已知的方法產(chǎn)生多能干細胞。產(chǎn)生方法的實例包括在 Cell 131(5)第 861-872 頁(2007)、Cell 126(4)第 663-676 頁(2006)等中描述的方法。
[0025]本發(fā)明中“胚胎干細胞(ES細胞)”的實例包括具有自我復(fù)制能力和多能性(multipotency)(即多能性(pluripotency) ”)的干細胞,其是來源于早期胚胎的多能干細胞。胚胎干細胞首先在1981年建立并且自從1989年以來還已經(jīng)應(yīng)用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干細胞，其也用于再生醫(yī)學(xué)。
[0026]本發(fā)明中“人工多能干細胞”的實例包括通過表達若干種基因，如0ct3/4、Sox2、Klf4和Myc直接重編程已分化的細胞如成纖維細胞等誘導(dǎo)具有多能性的細胞，其由 Yamanaka 等在 2006 年在小鼠細胞中建立(Takahashi K, Yamanaka S.Cell.2006,126(4)，第663-676頁)。在2007年，還在人成纖維細胞中建立了人工多能干細胞，并且其具有與胚胎干細胞相似的多能性(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M,Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S.Cell.2007, 131 (5)，第 861-872 頁；Yu J,Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S，Nie J,Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science.2007,318(5858)， 第 1917-1920 頁；Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, TakahashiK, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S.NatB1technol., 2008， 26(1)，第 101-106 頁)。
[0027]可以從指定機構(gòu)獲得多能干細胞，或者可以購買市售產(chǎn)品。例如，從KyotoUniversity 的 Institute for Frontier Medical Sciences 獲得人胚胎干細胞，KhES-l>KhES-2和KhES-3?？煞謩e從RIKEN獲得EB5細胞(其為小鼠胚胎干細胞)，和從ATCC獲得D3細胞系。
[0028]可以通過根據(jù)本身已知的方法培養(yǎng)來維持多能干細胞。例如，可以使用KnockoutSerum Replacement (KSR)通過培養(yǎng)來維持人干細胞。例如，可以通過加入胎牛血清(FCS)和LIF，且沒有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)來維持小鼠干細胞。
[0029]本發(fā)明中“組織”的實例包括細胞群的結(jié)構(gòu)，其具有這樣的構(gòu)象，其中多于一種類型的形狀和性質(zhì)不同的細胞以指定模式進行立體成形。
[0030]在發(fā)明中，“視網(wǎng)膜組織”的實例包括視網(wǎng)膜組織等，其中在體內(nèi)視網(wǎng)膜中構(gòu)成各視網(wǎng)膜層的至少兩種或多種類型的細胞，如光受體、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、其前體細胞、其視網(wǎng)膜祖細胞等在層中立體排列。對于各細胞，可以通過已知方法，例如存在或不存在細胞標志物的表達或其水平等證實哪種細胞構(gòu)成哪一視網(wǎng)膜層。
[0031]視網(wǎng)膜細胞標志物的實例包括Rax (視網(wǎng)膜的祖細胞)、PAX6 (祖細胞)、ChxlO (神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細胞)、神經(jīng)上皮干細胞蛋白(在下丘腦神經(jīng)元的祖細胞中表達，但不在視網(wǎng)膜祖細胞中表達)、Soxl (在下丘腦神經(jīng)上皮中表達，但不在視網(wǎng)膜中表達)、Crx(光受體的前體細胞)等。上述視網(wǎng)膜層特異神經(jīng)元的標志物的實例包括ChxlO (神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細胞或雙極細胞)、L7 (雙極細胞)、Tujl (神經(jīng)節(jié)細胞)、Brn3 (神經(jīng)節(jié)細胞)、鈣視網(wǎng)膜蛋白(無長突細胞)、鈣結(jié)合蛋白(水平細胞)、視紫紅質(zhì)(光受體)、恢復(fù)蛋白(光受體)、RPE65 (色素上皮)、Mitf (色素上皮)、Nrl (視桿細胞)、Rxr- Y (視錐細胞)等。
[0032]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜層”表示構(gòu)成視網(wǎng)膜的各層。其具體實例包括視網(wǎng)膜色素上皮層、光受體層、外界膜、外核層、外網(wǎng)層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜。
[0033]本發(fā)明中“睫狀邊緣帶(CMZ) ”的實例包括體內(nèi)視網(wǎng)膜中的視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)和視網(wǎng)膜色素上皮的邊緣區(qū)中存在的組織，其是包括視網(wǎng)膜的組織干細胞(視網(wǎng)膜干細胞)的區(qū)域。睫狀邊緣帶的標志物基因的實例包括RdhlO基因(陽性)、Otxl基因(陽性)等。已知睫狀邊緣帶在向視網(wǎng)膜組織供應(yīng)視網(wǎng)膜祖細胞和分化的細胞，維持視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)等中起重要作用。
[0034]本發(fā)明中“前進區(qū)”的實例包括定位在一部分組織中的未分化的細胞群，并且其實例包括具有在發(fā)育和再生過程中持續(xù)生長以促進組織生長為整體的性質(zhì)和/或通過分泌生長因子等促進周圍組織生長的性質(zhì)的細胞群。前進區(qū)的具體實例包括在肢芽尖端的未分化的細胞群。
[0035]本發(fā)明中“聚集體”的實例包括在培養(yǎng)基中分散但聚集以形成聚集體的大量細胞。本發(fā)明中的“聚集體”包括由在懸浮培養(yǎng)開始時分散的細胞形成的聚集體和在懸浮培養(yǎng)開始時早已經(jīng)形成的聚集體。
[0036]當細胞聚集形成細胞聚集體并且聚集體進行懸浮培養(yǎng)時，“形成聚集體”表示“快速聚集指定數(shù)量的分散的干細胞”以形成性質(zhì)上均勻的細胞聚集體。
[0037]實驗操作以形成聚集體的實例包括涉及通過使用具有小孔的平板(96孔板)、微孔等將細胞保持在小空間中的方法、涉及通過使用小的離心管短時間離心聚集細胞的方法坐寸ο
[0038]可以從作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基中制備待用于本發(fā)明中的“培養(yǎng)基”?；A(chǔ)培養(yǎng)基的實例包括可以用于培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基，如BME培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基、CMRL1066培養(yǎng)基、Glasgow MEM培養(yǎng)基、改良的MEM Zinc Opt1n培養(yǎng)基、頂DM培養(yǎng)基、Mediuml99培養(yǎng)基、Eagle MEM培養(yǎng)基、a MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、ham培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、Fischer’ s培養(yǎng)基及其混合培養(yǎng)基等。
[0039]本發(fā)明中“無血清培養(yǎng)基”的實例包括沒有未調(diào)整的或未純化的血清的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，除非其中含有未調(diào)整的或未純化的血清，無血清培養(yǎng)基中還包括含有純化的血液來源組分和動物組織來源組分(例如，生長因子)的培養(yǎng)基。
[0040]為了避免復(fù)雜的制劑，加入適當量(例如，1-20%)的市售KSR的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.1 mM 2-巰基乙醇，0.1 mM非必需氨基酸混合物，I mM丙酮酸鈉)可以作為無血清培養(yǎng)基被優(yōu)選提及。
[0041 ] 此外，無血清培養(yǎng)基可以含有血清替代物。血清替代物的實例包括白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂肪酸、膠原前體、微量元素、2-巰基乙醇或3’巰基甘油(th1lglycerol)、適當含有這些的等同物等的一種替代物等?？梢酝ㄟ^例如W098/30679等中描述的方法制備此類血清替代物。此外，血清替代物可以是市售產(chǎn)品。此類市售血清替代物的實例包括濃縮的化學(xué)定義的脂質(zhì)(由Gibco制造)、Glutamax (由Gibco制造)等。
[0042]待用于懸浮培養(yǎng)的“無血清培養(yǎng)基”可以含有脂肪酸、脂質(zhì)、氨基酸(例如，非必需氨基酸)、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩沖劑、無機鹽等。
[0043]本發(fā)明中“含血清培養(yǎng)基”的實例包括含有未調(diào)整的或未純化的血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以含有脂肪酸、脂質(zhì)、氨基酸(例如，非必需氨基酸)、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩沖劑、無機鹽等。
[0044]本發(fā)明中“懸浮培養(yǎng)”的實例包括在對細胞培養(yǎng)容器非粘附的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞聚集體等。
[0045]待用于懸浮培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)容器沒有特別限定，只要它使得細胞能夠懸浮培養(yǎng)。此類細胞培養(yǎng)容器的實例包括燒瓶、組織培養(yǎng)瓶、皿、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、復(fù)合皿(multidish)、微量培養(yǎng)板、微孔板、微孔、復(fù)合板(multiplate)、多孔板、腔室玻片、培養(yǎng)皿(schale)、管、托盤、培養(yǎng)袋、滾瓶等。優(yōu)選的容器是細胞非粘附容器。
[0046]作為細胞非粘附容器，可以使用其表面未被人工處理以提高細胞粘附性(例如，利用細胞外基質(zhì)的包被處理等)的一種容器等。
[0047]在本發(fā)明中待加入培養(yǎng)基中的“血清”的實例包括哺乳動物血清，如牛血清、小牛血清、胎牛血清、馬血清、小馬血清、胎馬血清、兔血清、小兔血清、胎兔血清和人血清等。
[0048]本發(fā)明的產(chǎn)生方法特征性地包括在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中，將包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體僅在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前培養(yǎng)一段時間，隨后在各自不含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)因此獲得的“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”的步驟，在所述視網(wǎng)膜組織中ChxlO陽性細胞以所述組織的20%或更高的比例存在。通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的“包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體”可用作用于評估化學(xué)物質(zhì)等的毒性或藥物效力的試劑，或用作用于旨在細胞治療等的測試或治療的材料。
[0049]待在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中用作起始材料的“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”是這樣的細胞聚集體，其中ChxlO陽性細胞以組織的20%或更高的比例存在于視網(wǎng)膜組織中。上述“ChxlO陽性細胞的比例”是例如優(yōu)選不低于40%，更優(yōu)選不低于60%，特別優(yōu)選不低于80%。
[0050]例如，可以從多能干細胞(優(yōu)選人多能干細胞)制備待在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中用作起始材料的“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”。尤其是，例如，其可以通過包括以下步驟(O- (3)的方法制備。
[0051](I)第一步，使多能干細胞在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，以形成多能干細胞的聚集體，
(2)第二步，使在第一步中形成的聚集體在含有基膜制劑的無血清培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，和
(3)第三步，使在第二步中培養(yǎng)的聚集體在含血清培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。
[0052]待用于第一步中的抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)沒有特別限定，只要其可以抑制fct介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的實例包括Dkkl、Cerberus蛋白、Wnt受體抑制齊U、可溶型Wnt受體、Wnt抗體、酪蛋白激酶抑制劑、顯性負相fct蛋白、CK1-7 (N-(2-氨乙基)-5-氯-異喹啉-8-氨磺酰)、D4476 (4-{4-(2，3-二氫苯并[1，4] 二噁英_6_基)_5_吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯甲酰胺)、IWR-l-endo (IffRle)、IWP-2等。抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度僅需要是在該濃度下形成多能干細胞聚集體的濃度。例如，以約0.1 μ M-1OOμ Μ,優(yōu)選約I μ M -10 μ Μ,更優(yōu)選約3 μ M的濃度加入抑制Wnt信號途徑的常見物質(zhì)，如IWRle。
[0053]可以在懸浮培養(yǎng)開始之前向無血清培養(yǎng)基中加入，或在懸浮培養(yǎng)開始的幾天內(nèi)(例如5天內(nèi))向無血清培養(yǎng)基中加入抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)。優(yōu)選地，在懸浮培養(yǎng)開始的5天內(nèi)，更優(yōu)選3天內(nèi)，最優(yōu)選懸浮培養(yǎng)開始的同時向無血清培養(yǎng)基中加入抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)。此外，從加入抑制fct信號途徑的物質(zhì)懸浮培養(yǎng)開始的高達第18天，更優(yōu)選第12天進行懸浮培養(yǎng)。
[0054]可以適當?shù)卮_定第一步中的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度和CO2濃度。盡管培養(yǎng)溫度沒有特別限定，其是例如約30-40°C，優(yōu)選約37°C。CO2濃度是例如約1_10%，優(yōu)選大約5%。
[0055]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以適當?shù)卮_定第一步中多能干細胞的濃度，以更均勻和有效地形成多能干細胞的聚集體。當形成聚集體時，多能干細胞的濃度沒有特別限定，只要其允許形成均勻的干細胞聚集體。例如，當使用96孔微孔板使人ES細胞進行懸浮培養(yǎng)時，每孔加入制備成約I X 13-約5 X 14個細胞，優(yōu)選約3 X 13-約3 X 14個細胞，更優(yōu)選約
5X 13-約2 X 14個細胞，最優(yōu)選大約9 X 10 3個細胞的液體，并使平板靜置以形成聚集體。
[0056]可以根據(jù)待使用的多能干細胞適當?shù)卮_定用于形成聚集體所必需的懸浮培養(yǎng)的時間，只要細胞可以快速聚集。為了形成均勻的聚集體，希望盡可能地短。例如，在人ES細胞的情況下，期望優(yōu)選在24小時，更優(yōu)選在12小時內(nèi)形成聚集體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過控制用于聚集細胞的工具、離心條件等適當?shù)卣{(diào)整用于聚集體形成的時間。
[0057]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以基于聚集體的大小和細胞數(shù)量、肉眼可見的形態(tài)、通過組織染色分析的顯微形態(tài)及其均勻度、分化和未分化標志物的表達及其均勻度、分化標志物的表達控制及其同步性、聚集體之間分化效率的重復(fù)性等確定是否已經(jīng)形成多能干細胞的聚集體。
[0058]待用于第二步中的基膜制劑指含有基膜組成成分的一種制劑，所述基膜組成成分具有控制細胞形態(tài)、分化、生長、運動性、功能表達等功能，其與上皮細胞的那些功能類似，當將能夠形成基膜的預(yù)期細胞在其上涂布并培養(yǎng)時。在本文中，“基膜組成成分”指以在動物組織中上皮細胞層和間質(zhì)細胞層等之間存在的薄膜形態(tài)的細胞外基質(zhì)分子。例如，可以利用能夠溶解細胞的脂質(zhì)的溶液、堿溶液等去除能夠形成基膜的細胞(其通過基膜附著到支持物上)來產(chǎn)生基膜制劑。優(yōu)選的基膜制劑的實例包括可以作為基膜組分可商購的產(chǎn)品(例如Matri ge I (下文中有時候稱為Matri ge I)),和稱為基膜組分的細胞外基質(zhì)分子(例如，層粘連蛋白、IV型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、內(nèi)功素等)。
[0059]Matrigel是從來源于Engelbreth Holm Swarn (IiHS)小鼠肉瘤的基膜制備的產(chǎn)品。Matrigel的主要組分是IV型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和內(nèi)功素。除了這些，還含有TGF-β、成纖維細胞生長因子(FGF)、纖溶酶原激活物和EHS腫瘤天然產(chǎn)生的生長因子。Matrigel的“生長因子減少(GFR)產(chǎn)品”具有比常規(guī)Matrigel低的生長因子濃度。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用GFR產(chǎn)品。
[0060]盡管待加入無血清培養(yǎng)基中用于在第二步中懸浮培養(yǎng)的基膜制劑的濃度沒有特別限定，只要穩(wěn)定維持神經(jīng)組織(例如，視網(wǎng)膜組織)的上皮結(jié)構(gòu)，但是例如，當使用Martigel時，其優(yōu)選為培養(yǎng)基的1/20-1/200體積，更優(yōu)選為大約1/100體積。盡管當干細胞培養(yǎng)開始時可以已經(jīng)向培養(yǎng)基中加入了基膜制劑，但是優(yōu)選在懸浮培養(yǎng)開始的5天內(nèi)，更優(yōu)選2天內(nèi)向無血清培養(yǎng)基中加入。
[0061]因為在第二步中將使用無血清培養(yǎng)基，所以可以直接使用用于第一步中的無血清培養(yǎng)基，或者可以用新鮮的無血清培養(yǎng)基替換。
[0062]當用于第一步的無血清培養(yǎng)基直接用于該步驟時，可以向培養(yǎng)基中加入“基膜制劑”。
[0063]可以適當?shù)卮_定第二步中的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度和CO2濃度。盡管培養(yǎng)溫度沒有特別限定，但其是例如約30-40°C，優(yōu)選大約37°C。CO2濃度是例如約1_10%，優(yōu)選大約5%。
[0064]因為在第三步中將使用含血清培養(yǎng)基，可以使用在第二步培養(yǎng)中使用的無血清培養(yǎng)基，向其中直接加入血清，或用新鮮的含血清培養(yǎng)基替換。
[0065]在懸浮培養(yǎng)開始的第7天或第7天后，更優(yōu)選開始的第9天或第9天后，最優(yōu)選開始的第12天或第12天后加入血清。待加入的血清濃度是約1_30%，優(yōu)選約3-20%，更優(yōu)選大約10%。
[0066]在第三步中，除血清外，可以通過加入作用于Shh信號途徑的物質(zhì)來增加視網(wǎng)膜組織的產(chǎn)生效率。
[0067]作用于Shh信號途徑的物質(zhì)沒有特別限定，只要其可以增強由Shh介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于Hedgehog家族的蛋白質(zhì)(例如，Shh)> Shh受體、Shh受體激動劑、Purmorphamine> SAG等。
[0068]用于該步驟中的作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的濃度例如，在作用于Shh信號途徑上的常見物質(zhì)，如SAG的情況下，是約0.1 ηΜ-10 μ M，優(yōu)選約10 ηΜ_1 μ Μ，更優(yōu)選大約100
ηΜο
[0069]呈遞因此產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織以覆蓋聚集體的表面?？梢酝ㄟ^免疫染色方法等證實視網(wǎng)膜組織是否產(chǎn)生。
[0070]例如，使第三步中培養(yǎng)的聚集體在含血清培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。待用于懸浮培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)容器的實例包括上文提及的那些?？梢赃m當?shù)卮_定懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度、CO2濃度和O 2濃度。盡管培養(yǎng)溫度沒有特別限定，但其是例如約30_40°C，優(yōu)選約37°C。CO2濃度是例如約1-10%，優(yōu)選約5%。O 2濃度是例如20-70%，優(yōu)選20_60%，更優(yōu)選30-50%。盡管培養(yǎng)期限沒有特別限定，但其一般不少于48小時，優(yōu)選不少于7天。
[0071]懸浮培養(yǎng)結(jié)束后，利用固定劑，如低聚甲醒(para-formaldehyde)溶液等固定聚集體，并制備冷凍切片。免疫染色所獲得的冷凍切片，并證實視網(wǎng)膜組織的層結(jié)構(gòu)的形成。因為視網(wǎng)膜組織的各層由不同的視網(wǎng)膜祖細胞(光受體、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)構(gòu)成，可以使用針對在這些細胞中表達的上述標志物的抗體通過免疫染色證實層結(jié)構(gòu)的形成。
[0072]可以通過例如以下方法檢查如上述產(chǎn)生的細胞聚集體中含有的視網(wǎng)膜組織中的“ChxlO陽性細胞的比例”。
[0073](I)首先，制備“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”的冷凍切片。
[0074](2)然后，使用熒光顯微鏡等觀察Rax蛋白質(zhì)的免疫染色，或當使用通過改變表達Rax基因的細胞以表達熒光蛋白質(zhì)，如GFP獲得的基因重組細胞時，觀察上述熒光蛋白質(zhì)的表達，由此明確表達Rax基因的視網(wǎng)膜組織區(qū)域。
[0075](3)使用與其中已經(jīng)明確了表達Rax基因的視網(wǎng)膜組織區(qū)域的冷凍切片相同的部分或鄰近部分作為樣品，利用核染劑如Dapi對核進行染色。然后，計數(shù)上文明確的表達Rax基因的視網(wǎng)膜組織區(qū)域中染色核的數(shù)量，由此測定視網(wǎng)膜組織區(qū)域中細胞的數(shù)量。
[0076](4)使用與其中已經(jīng)明確了表達Rax基因的視網(wǎng)膜組織區(qū)域的冷凍切片相同的部分或鄰近部分作為樣品，免疫染色ChxlO蛋白質(zhì)。計數(shù)上文明確的視網(wǎng)膜組織區(qū)域中的ChxlO陽性細胞的數(shù)量。
[0077](5)基于上述(3)和⑷中測量的核的各自數(shù)量，將ChxlO陽性細胞中核的數(shù)量除以上文明確的視網(wǎng)膜組織區(qū)域中ChxlO陽性細胞中核的數(shù)量，由此計算“ChxlO陽性細胞的比例”。
[0078]在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，首先，在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中，將包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體僅在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前培養(yǎng)一段時間，在所述視網(wǎng)膜組織中ChxlO陽性細胞以所述組織的20%或更高的比例存在。
[0079]作為本文優(yōu)選的培養(yǎng)，可以提及懸浮培養(yǎng)。作為本文優(yōu)選的培養(yǎng)基，可以提及無血清培養(yǎng)基。
[0080]可以適當?shù)卦O(shè)定培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度、CO2濃度。培養(yǎng)溫度是例如在約30°C -約40°C范圍內(nèi)，優(yōu)選例如是大約37°C。0)2濃度是例如在約1%-約10%的范圍內(nèi)，優(yōu)選例如是大約5%。
[0081]當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”時，待包含于無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中的作用于fct信號途徑的物質(zhì)沒有特別限定，只要其可以增強由fct介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作用于fct信號途徑的物質(zhì)的具體實例包括屬于Wnt家族的蛋白質(zhì)、Wnt受體、Wnt受體激動劑、GSK3 β抑制劑(例如，6-溴靛玉紅_3’ -月虧(B1)、CHIR99021、Kenpaullone)等。
[0082]待包含于無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中的作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度在作用于Wnt信號途徑的常見物質(zhì)如CHIR99021的情況下是例如在約0.1 μ Μ-100 μΜ范圍內(nèi)，優(yōu)選例如在約I μΜ-30 μ M范圍內(nèi)，更優(yōu)選例如是大約3 μ M0
[0083]在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中“僅在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前培養(yǎng)一段時間”表示在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前的整個或部分時期中培養(yǎng)。即，滿足在整個或部分時期(任何時期)中培養(yǎng)，在所述時期過程中培養(yǎng)系統(tǒng)中的“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”由基本上不表達RPE65基因的細胞構(gòu)成。通過使用此類培養(yǎng)，可以獲得其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體。
[0084]為了確定該特定時期，“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”用作樣品，并且樣品中含有的RPE65基因表達的存在或不存在僅需要通過一般的遺傳改造方法來測定。尤其是，例如，如下文所述實施例中所述，可以使用針對RPE65蛋白質(zhì)的抗體，通過使上述“包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體”的冷凍切片進行免疫染色方法來檢查RPE65基因表達的存在或不存在或其水平。
[0085]優(yōu)選的“在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前的一段時間”是例如這樣的一段時間，在所述時間內(nèi)ChxlO陽性細胞以組織的50%-1%的比例存在于視網(wǎng)膜組織中。在這種情況下，所獲得的“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”是這樣的細胞聚集體，其中ChxlO陽性細胞以組織的50%-1%的比例存在于視網(wǎng)膜組織中。
[0086]盡管“在出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞之前的一段時間”的天數(shù)根據(jù)作用于fct信號途徑的物質(zhì)的種類、無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基的種類、其他培養(yǎng)條件等而變化，但其例如是在5天內(nèi)。上述時期優(yōu)選為例如，在4天內(nèi)，更優(yōu)選例如2天至3天。
[0087]然后，在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過如上述培養(yǎng)獲得的“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”。
[0088]本文的優(yōu)選培養(yǎng)是例如懸浮培養(yǎng)。
[0089]優(yōu)選的培養(yǎng)時間的實例包括用于培養(yǎng)直至視網(wǎng)膜組織中存在的ChxlO陽性細胞的比例達到組織的50%或更高的時間。
[0090]可以適當?shù)卦O(shè)定培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度、CO2濃度。培養(yǎng)溫度是例如在約30°C -約40°C范圍內(nèi)，優(yōu)選例如是大約37°C。此外，0)2濃度是例如在約1%-約10%的范圍內(nèi)，優(yōu)選例如是大約5%。
[0091]盡管直至獲得“包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體”的上述培養(yǎng)天數(shù)根據(jù)無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基的種類、其他培養(yǎng)條件等而變化，但其例如是在100天內(nèi)。上述培養(yǎng)天數(shù)優(yōu)選為例如，20天-70天，更優(yōu)選例如30天-60天。
[0092]在因此產(chǎn)生的“包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體”中，視網(wǎng)膜色素上皮和視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)存在于同一細胞聚集體中的睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)附近。可以通過顯微鏡觀察等容易地證實結(jié)構(gòu)。
[0093]可以利用鑷子等從上述“包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體”中物理切掉視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)來制備高度純的視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)。高度純的視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)可以進一步持續(xù)培養(yǎng)(尤其是，長期培養(yǎng)例如60天或更長)，同時維持其具有的良好組織結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度、O 2濃度可以是一般用于組織培養(yǎng)的那些。在這種情況下，可以在存在血清、已知生長因子、添加劑和促進生長的化學(xué)物質(zhì)等的情況下進行培養(yǎng)。已知生長因子的實例包括EGF、FGF等。促進生長的添加劑的實例包括N2添加物(Invitrogen)、B27添加物(Invitrogen)等。
[0094]本發(fā)明還包括通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于評估毒性或藥物效力的試劑的用途，通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于移植等的生物材料的用途。
[0095]〈包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于評估毒性或藥物效力的試劑的用途〉
通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體可以用于篩選用于由視網(wǎng)膜細胞病癥引起的疾病的治療藥物、用于研究疾病的材料或藥物開發(fā)材料。其還可用于評估化學(xué)物質(zhì)等的毒性或藥物效力，以及研究毒性(如光毒性、神經(jīng)毒性等)、毒性測試等。
[0096]<包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于移植的生物材料的用途>
通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體可以用作用于移植(其用于補充本身處于細胞損傷狀態(tài)中的患病組織)的生物材料(例如，用于移植操作)坐寸O
實施例
[0097]在下文中通過參考實施例(其不解釋為限制性的)更詳細地解釋本發(fā)明。
[0098]實施例1 (使用人ES細胞的含有視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體的產(chǎn)生實施例-1) 根據(jù)在 “Ueno, Μ.等 PNAS 2006, 103(25), 9554-9559” 和 “Watanabe, K.等 Nat
B1tech 2007, 25，681-686”中描述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細胞(來源于KhES-1; Nakano, T.等 Cell Stem Cell 2012，10(6), 771-785)。作為培養(yǎng)基，使用加入了 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen) >0.1 mM 2-疏基乙醇、I mM丙酮酸和5-10 ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。將上述培養(yǎng)的ES細胞單個分散在0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)中，并且使單個分散的ES細胞漂浮在100 μ I無血清培養(yǎng)基中，達到在非細胞粘附96孔培養(yǎng)板(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITEC0., LTD.)中每孔9父103個細胞，并在371:、5% CO2下懸浮培養(yǎng)。然后使用的無血清培養(yǎng)基是通過向G-MEM培養(yǎng)基中加入20% KSR、0.1 mM 2-巰基乙醇、I mM丙酮酸、20 μ M Υ27632和Wnt信號途徑抑制物質(zhì)(3 μ M IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)的過程中，從懸浮培養(yǎng)開始的第2天以每體積1/100的量加入GFR Matrigel (Invitrogen)。在懸浮培養(yǎng)開始的第12天加入每體積1/10的量的胎牛血清和作用于Shh信號途徑的物質(zhì)(100 nMSAG)，并進行懸浮培養(yǎng)共18天。
[0099]利用4%的低聚甲醛固定因此產(chǎn)生的細胞聚集體，以產(chǎn)生冷凍切片。使所制備的冷凍切片進行熒光顯微鏡觀察GFP熒光圖像(圖1)并利用ChxlO (其是神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細胞標志物之一)進行免疫染色(圖2)。在如上述產(chǎn)生的細胞聚集體中含有的視網(wǎng)膜組織中，在大約40%的組織中發(fā)現(xiàn)了 ChxlO陽性細胞(參見圖2)。
[0100]實施例2 (使用人ES細胞的含有視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體的產(chǎn)生實施例-2) 通過與實施例1中的類似的方法，將懸浮培養(yǎng)進行更長的時間。結(jié)果，在懸浮培養(yǎng)開始的第25天，也獲得了含有視網(wǎng)膜組織(其中在約80%或約90%的組織中發(fā)現(xiàn)了 ChxlO陽性細胞)的細胞聚集體。
[0101]實施例3 (在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體)
將在懸浮培養(yǎng)開始的第18天的含有視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體(其通過實施例1中所述的方法產(chǎn)生)在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)(3 μ M CHIR99021)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天。
[0102]利用4%的低聚甲醛固定所獲得的細胞聚集體，以制備冷凍切片。使所制備的冷凍切片進行熒光顯微鏡觀察GFP熒光圖像(圖3)并利用ChxlO (其是神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細胞標志物之一)進行免疫染色(圖4)。在上述細胞聚集體(其已經(jīng)在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)了 3天)中含有的視網(wǎng)膜組織中，僅在約3%的組織中發(fā)現(xiàn)了ChxlO陽性細胞并且觀察到ChxlO陽性細胞的比例明顯下降(參見圖4)。在那時，表達RPE65基因的細胞在上述細胞聚集體中沒有出現(xiàn)。
[0103]實施例4 (在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”-1) 將通過實施例1和實施例3中所述方法產(chǎn)生的在懸浮培養(yǎng)開始的第21天(上述“第18天”和“第3天”的總天數(shù))的細胞聚集體(ChxlO陽性細胞的比例:約3%)在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基(含有DMEM/F12、10%胎牛血清、N2添加物、0.5 μ M視黃酸等)中在40% O2條件下進一步懸浮培養(yǎng)39天。
[0104]利用4%的低聚甲醛固定所獲得的細胞聚集體，以制備冷凍切片。使所制備的冷凍切片進行熒光顯微鏡觀察GFP熒光圖像(圖5)并利用RdhlO (其是睫狀邊緣帶標志物之一)進行免疫染色(圖6)。以上文提及的方式，可以證實在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)39天后的細胞聚集體中，RdhlO陽性細胞(即，表達作為睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的標志物基因的RdhlO基因的細胞)在視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)和視網(wǎng)膜色素上皮的邊緣區(qū)中存在的組織中以接近均勻的組區(qū)(group reg1n)存在，并且高效產(chǎn)生含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體(參見圖6)。
[0105]實施例5 (在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)“其中不出現(xiàn)表達RPE65基因的細胞的細胞聚集體”_2)
將通過實施例1和實施例3中所述方法產(chǎn)生的在懸浮培養(yǎng)開始的第21天(上述“第18天”和“第3天”的總天數(shù))的細胞聚集體(ChxlO陽性細胞的存在比例:約3%)在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基(含有DMEM/F12、10%胎牛血清、N2添加物、0.5μ M視黃酸等)中在40% 02條件下，以與實施例4中相同的方式進一步懸浮培養(yǎng)50天。
[0106]利用4%的低聚甲醛固定所獲得的細胞聚集體，以制備冷凍切片。使所制備的冷凍切片進行熒光顯微鏡觀察GFP熒光圖像(圖7)并利用RdhlO (圖8)或Otxl (圖9)(其是睫狀邊緣帶標志物之一)進行免疫染色。以上文提及的方式，在不含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)50天后的細胞聚集體中，RdhlO陽性細胞(即，表達作為睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的標志物基因的RdhlO基因的細胞)在視網(wǎng)膜組織(尤其是，神經(jīng)視網(wǎng)膜)和視網(wǎng)膜色素上皮的邊緣區(qū)中存在的組織中以接近均勻的組區(qū)存在(參見圖8)，并且Otxl陽性細胞(即，表達作為睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的標志物基因的Otxl基因的細胞)也類似地存在(參見圖9)。從這些結(jié)果可以證實，通過產(chǎn)生方法高效產(chǎn)生含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體。
[0107]實施例6 (含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的增殖能力的分析-1)
將通過實施例1所述方法產(chǎn)生的在懸浮培養(yǎng)開始的第18天的細胞聚集體在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，然后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中，以與實施例4和實施例5中相同的方式懸浮培養(yǎng)46天。然后，將細胞聚集體在存在BrdU的情況下培養(yǎng)I天，以標記生長的細胞，然后在不存在BrdU的情況下培養(yǎng)13天,并且在存在EdU (Invitrogen)的情況下培養(yǎng)I天。利用4%的低聚甲醒固定所獲得的細胞聚集體，以制備冷凍切片。使所制備的冷凍切片進行使用抗Ki67抗體的免疫熒光染色(圖10，左圖)或使用抗BrdU抗體的免疫熒光染色(圖10，右圖)，或EdU顯色反應(yīng)(圖10，中間的圖)。
[0108]結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以上述方式在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)46天后的細胞聚集體中，睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)是Ki67陽性生長細胞(圖10，左圖，通過箭顯示)。發(fā)現(xiàn)90%或更多的生長細胞可以通過EdU吸收I天而被標記，因為90%或更多的Κ?67陽性細胞是EdU陽性的(圖10，中間的圖，箭)。另一方面，因為在睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)中的Ki67陽性細胞顯示弱的BrdU信號(圖10，右圖，箭)，假設(shè)上述Ki67陽性細胞在BrdU標記后繼續(xù)生長14天并稀釋被吸收到DNA中的BrdU。從這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如上述培養(yǎng)的細胞聚集體中的睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)是前進區(qū)。
[0109]實施例7 (含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的增殖能力的分析-2)
將通過實施例1中所述方法產(chǎn)生的在懸浮培養(yǎng)開始的第18天的細胞聚集體在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，然后在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中，以與實施例4、實施例5和實施例6中相同的方式懸浮培養(yǎng)46天。然后，將細胞聚集體在存在BrdU的情況下培養(yǎng)I天，以標記生長的細胞，然后在不存在BrdU的情況下培養(yǎng)13天,在存在EdU (Invitrogen)的情況下培養(yǎng)I天，并在不存在EdU的情況下進一步培養(yǎng)13天。產(chǎn)生所獲得的細胞聚集體的冷凍切片，并使其進行使用抗Ki67抗體(圖11，左圖)、抗BrdU抗體(圖11，右圖)或抗RdhlO抗體(圖11，下圖)的免疫熒光染色，或EdU顯色反應(yīng)(圖11，中間的圖)。
[0110]結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以上述方式在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)46天后的細胞聚集體中，RdhlO陽性的睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(圖11，下圖，通過箭顯示)是Ki67陽性的(圖11，左圖)。發(fā)現(xiàn)睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)中的上述Ki67陽性細胞顯示弱的EdU(圖11，中間的圖)和BrdU (圖11，右圖)信號。因而，假設(shè)上述睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)中的上述Κ?67陽性細胞繼續(xù)生長27天并且稀釋被吸收到DNA中的EdU和BrdU。從這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如上述培養(yǎng)的細胞聚集體中的睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)是前進區(qū)。
[0111]實施例8 (含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體中的神經(jīng)視網(wǎng)膜的形態(tài)分析) 將通過實施例1中所述方法產(chǎn)生的在懸浮培養(yǎng)開始的第18天的細胞聚集體在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3天，并在不含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的含血清培養(yǎng)基中，以與實施例4、實施例5、實施例6和實施例7中相同的方式懸浮培養(yǎng)75天，并分析所獲得的細胞聚集體。作為細胞聚集體的一個實施方案，顯示了沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ)的細胞聚集體的相差圖像(A，左列，上圖)、沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的表達Crx基因的細胞的GFP熒光圖像(A，左列，下圖)、含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的相差圖像(A，右列，上圖)，和含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的表達Crx基因的細胞的GFP熒光圖像(A，右列，下圖)。在含有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體中表達Crx基因的細胞的GFP熒光圖像(A，右列，下圖)中，在右下部分發(fā)現(xiàn)具有層結(jié)構(gòu)的連續(xù)神經(jīng)視網(wǎng)膜存在于睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)附近(通過箭顯示)。
[0112]在沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ-)的細胞聚集體中和具有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ+)的細胞聚集體中，通過使用表達Crx基因的細胞的形態(tài)作為指標測量在不少于10%的細胞聚集體周圍含有具有層結(jié)構(gòu)的連續(xù)神經(jīng)視網(wǎng)膜的細胞聚集體的比例(圖12B)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與沒有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ-)的細胞聚集體相比，具有睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)(CMZ+)的細胞聚集體具有更高比例的含有具有層結(jié)構(gòu)的連續(xù)神經(jīng)視網(wǎng)膜的細胞聚集體。
[0113]工業(yè)實用性
根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生方法，可以高效產(chǎn)生睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)。在通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體中，睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)充當前進區(qū)起功能，并且具有層結(jié)構(gòu)的連續(xù)神經(jīng)視網(wǎng)膜可以在睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)附近高頻率地形成。
[0114]該申請基于在日本提交的專利申請?zhí)?012-130521(提交日期:2012年6月8日)，其內(nèi)容完整并入本文。說明書中引用的所有出版物、專利和專利出版物由此通過引用并入。
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體的方法，其包括在各自含有作用于胃社信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中，將包含視網(wǎng)膜組織的細胞聚集體僅在出現(xiàn)表達1？？265基因的細胞之前培養(yǎng)一段時間，隨后在各自不含有作用于信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)因此獲得的“其中不出現(xiàn)表達1^265基因的細胞的細胞聚集體”的步驟，在所述視網(wǎng)膜組織中01x10陽性細胞以所述組織的20%或更高的比例存在。
2.權(quán)利要求1的產(chǎn)生方法，其中出現(xiàn)表達基因的細胞之前的一段時間是這樣的一段時間，在所述時間內(nèi)(3^10陽性細胞以組織的50%-1%的比例存在，并且其中不出現(xiàn)表達尺？265基因的細胞的細胞聚集體是其中(3^10陽性細胞以組織的50%-1%的比例存在于視網(wǎng)膜組織中的細胞聚集體。
3.權(quán)利要求2的產(chǎn)生方法，其中在各自不含有作用于信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)因此獲得的“其中不出現(xiàn)表達1^265基因的細胞的細胞聚集體”，直至視網(wǎng)膜組織中存在的￠3^10陽性細胞的比例達到所述組織的50%或更高。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的產(chǎn)生方法，其中所述視網(wǎng)膜組織來源于人多能干細胞。
5.通過權(quán)利要求1-4中任一項的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于評估毒性或藥物效力的試劑的用途。
6.通過權(quán)利要求1-4中任一項的產(chǎn)生方法產(chǎn)生的包含睫狀邊緣帶樣結(jié)構(gòu)的細胞聚集體作為用于移植的生物材料的用途。
【文檔編號】A61L27/38GK104508125SQ201380041868
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月8日
【發(fā)明者】中野德重, 安藤覺, 笹井芳樹, 永樂元次 申請人:住友化學(xué)株式會社, 獨立行政法人理化學(xué)研究所