人源化泛her抗體組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向EGFR家族受體EGFR、HER2和HER3的人源化重組抗體，包含至少一種人源化抗EGFR抗體、至少一種人源化抗HER2抗體和至少一種人源化抗HER3抗體的組合物，和所述抗體組合物用于治療癌癥的用途。本發(fā)明還涉及靶向多種EGFR家族受體的抗體治療癌癥(例如胰腺癌)和對(duì)在前治療已獲得抗性的癌癥的用途。
【專利說(shuō)明】人源化泛HER抗體組合物
[0001] 對(duì)其他申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求來(lái)自2012年5月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/641,756和來(lái)自2013 年4月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/809, 159的優(yōu)先權(quán)。那些申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述完 整并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)家族的新穎人源化重組抗體和用于癌 癥治療的包含這些中兩種或更多種抗體的組合物。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 表皮生長(zhǎng)因子受體家族（EGFR或ErbB/HER家族）是受體酪氨酸激酶（RTK)的一 個(gè)亞組，且包含 4 個(gè)成員：EGFR/ErbB，HER2/ErbB2,HER3/ErbB3 和HER4/ErbB4。EGFR家族 成員是緊密相關(guān)的單鏈模塊糖蛋白，其具有胞外配體結(jié)合區(qū)、單跨膜域和胞內(nèi)酪氨酸激酶 域。在正常的生理學(xué)背景中，ErbB家族與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移一致調(diào)控關(guān)鍵的事件。認(rèn) 為EGFR、HER2和HER3在正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用。 已發(fā)現(xiàn)EGFR和HER2在許多上皮癌中過(guò)表達(dá)。此外，已將EGFR和HER2的過(guò)表達(dá)與幾種人 上皮癌中的疾病進(jìn)展、縮短的存活、較差應(yīng)答和化療抗性關(guān)聯(lián)。HER4在惡性轉(zhuǎn)化和癌癥進(jìn)展 中的作用仍存在爭(zhēng)議且在本文中不再贅述。
[0006]EGFR和HER2是經(jīng)驗(yàn)證的癌癥靶物，而且其酪氨酸激酶的單克隆抗體和小分子抑 制劑兩者都已被批準(zhǔn)用于治療多種癌癥。目前正在探索將HER3作為潛在治療靶物。然而， 由于獲得性抗性的發(fā)展，最初應(yīng)答這些治療的患者經(jīng)常復(fù)發(fā)。臨床前研究指出非靶定受體 之一或兩者牽涉抗性的形成。如此，似乎ErbB受體具有彼此替換以維持生長(zhǎng)刺激性信號(hào)傳 導(dǎo)和惡性表型的能力。因此，同時(shí)靶向2種或所有3種受體可以是抑制具有ErbB家族依賴 性的癌細(xì)胞的更有效途徑。
[0007]EGFR是一種170kDa細(xì)胞表面糖蛋白，其由1186個(gè)氨基酸殘基的單多肽鏈組成，如 最初通過(guò)來(lái)自人外陰癌細(xì)胞系的人cDNA的克隆和測(cè)序測(cè)定和描述的。EGFR含有3個(gè)主要 的域：胞外域、跨膜域和含有酪氨酸激酶的胞內(nèi)域。EGFR的催化活性存在于酪氨酸激酶域 (殘基685-953)中且在配體結(jié)合時(shí)被激活。
[0008]EGFR以兩種不同的構(gòu)象，即束縛（tethered)構(gòu)象（閉合）和擴(kuò)展（extended)構(gòu) 象（打開(kāi)）存在。該受體在兩種構(gòu)象之間變換。在束縛構(gòu)象中，EGFR胞外區(qū)的域II和IV 相互作用，使受體處于自身受抑制狀態(tài)。此外，域III與域I保持相當(dāng)大的距離，由此EGF 不可能同時(shí)結(jié)合兩個(gè)域。在EGFR的擴(kuò)展構(gòu)象中，域I，II和III以C形空間排列，給出EGF 結(jié)合的空間。此外，構(gòu)象變化誘導(dǎo)域II中由20個(gè)殘基的區(qū)組成的β-發(fā)夾（亦稱為"二聚 化臂"）的暴露。從EGFR的域II擴(kuò)展的二聚化臂與另一EGFR的域II進(jìn)行廣泛接觸，由此 形成EGFR同型二聚體。
[0009] 二聚化使得受體的活性細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶域足夠近以實(shí)現(xiàn)受體調(diào)控區(qū)域中酪氨 酸殘基的磷酸化。此外，兩個(gè)受體的近膜區(qū)形成反平行二聚體，發(fā)現(xiàn)其在穩(wěn)定該酪氨酸激酶 二聚體中是重要的。相比于"配體介導(dǎo)的"二聚化是最常見(jiàn)的主題的其他酪氨酸激酶受體， "受體介導(dǎo)的"二聚化機(jī)制對(duì)于ErbB家族而言是獨(dú)特的。
[0010] 已提出了EGFR的胞內(nèi)酪氨酸激酶域活化的許多模式。與其他受體酪氨酸激酶不 同，EGFR酪氨酸激酶域在默認(rèn)情況下采用一種通常僅在磷酸化且活化的激酶中觀察到的構(gòu) 象。這指示EGFR的激酶域是組成性活性的。如此，組成性酪氨酸激酶的調(diào)控會(huì)經(jīng)由將二聚 化配偶體的C末端調(diào)控區(qū)遞送用于轉(zhuǎn)磷酸化而發(fā)生。另一種可能是酪氨酸激酶域的活化牽 涉尚未在晶體學(xué)研究中看到的抑制性相互作用的置換。然而，對(duì)EGFR的近膜和酪氨酸激酶 的晶體結(jié)構(gòu)分析揭示，在兩個(gè)EGFR二聚化時(shí)形成的酪氨酸激酶的不對(duì)稱二聚體對(duì)于調(diào)控 酪氨酸激酶活性是重要的。在該不對(duì)稱同型二聚體中，一個(gè)酪氨酸激酶是接受體，而另一個(gè) 酪氨酸激酶是供體。僅接受體激酶域具有催化活性并著手磷酸化受體C末端尾部中的酪氨 酸殘基（不知道為順式還是反式，或是這兩者皆可）。
[0011] 網(wǎng)格蛋白（clathrin)介導(dǎo)的胞吞作用是EGFR下調(diào)的最重要機(jī)制。EGFR的結(jié)局 取決于配體-受體復(fù)合物的穩(wěn)定性。當(dāng)EGF結(jié)合EGFR時(shí)，EGFR同型二聚體快速靶向到經(jīng) 網(wǎng)格蛋白包被的窩（pit)并經(jīng)由配體誘導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)在化。同時(shí)，通過(guò)附接單泛素 (monoubiquitin)和聚泛素（polyubiquitin)使EGFR重度泛素化。泛素連接酶Cbl負(fù)責(zé) EGFR的泛素化。Cbl直接或經(jīng)由接頭蛋白質(zhì)如Grb2間接結(jié)合至EGFR調(diào)控區(qū)處的磷酸化酪 氨酸殘基。Cbl經(jīng)由Grb2對(duì)EGFR的結(jié)合是受體內(nèi)在化所必需的。Espl5在EGFR內(nèi)在化 中也起作用。然而，Espl5的確切作用仍是有爭(zhēng)議的。泛素化參與EGFR的胞吞作用下調(diào)和 EGFR到溶酶體的內(nèi)體分選。泛素鏈被運(yùn)輸所需內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT)和Hrs/STAM識(shí)別， 所述Hrs/STAM將泛素化蛋白質(zhì)保留在早期內(nèi)體的膜中，由此阻礙EGFR的再循環(huán)。其后， EGFR被分選至內(nèi)腔囊泡（ILV)，這導(dǎo)致EGFR遞送至后期內(nèi)體并最終在溶酶體中降解。
[0012] 相比于當(dāng)與EGF結(jié)合時(shí)EGFR的降解，TGF-α結(jié)合允許受體再循環(huán)。TGF-α配體 由于酸性環(huán)境而從在早期內(nèi)體中的EGFR快速解離，導(dǎo)致受體去磷酸化、去泛素化，和由此 受體再循環(huán)回到細(xì)胞表面。
[0013] 人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2,ErbB2或Neu)首次在1984年由Schechter等人描 述。HER2由1234個(gè)氨基酸組成且其結(jié)構(gòu)上類似于EGFR，該EGFR具有由4個(gè)亞域I-IV組 成的胞外域、跨膜域、近膜域、胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶和調(diào)控性C末端域。
[0014] 限制受束縛EGFR中的域排列的域II-IV接觸在HER2中不存在。對(duì)于穩(wěn)定化未活 化EGFR中的束縛（tether)重要的7個(gè)保守殘基中的3個(gè)是在HER2中不同的。如此，HER2 類似于處于其擴(kuò)展（打開(kāi)）形式的EGFR，其中二聚化臂暴露且明顯懸著以驅(qū)動(dòng)受體-受體 相互作用。受束縛HER2構(gòu)象的缺乏指示該受體缺少如對(duì)于ErbB家族的其他成員所看到的 自身抑制。亞域I-III的穩(wěn)定接口似乎將HER2保持為類似于EGFR-EGF復(fù)合物的擴(kuò)展構(gòu)型 的擴(kuò)展構(gòu)型。域I和ΠΙ之間的相互作用牽涉對(duì)應(yīng)于EGFR的域I和III中的配體結(jié)合位 點(diǎn)的區(qū)域，在空間上沒(méi)有為配體留下空間，從而使得HER2不能結(jié)合配體。域II和IV形成 兩個(gè)獨(dú)特的接口，其穩(wěn)定化HER2與另一ErbB家族成員的異二聚體形成。
[0015] 生物物理學(xué)研究未能檢測(cè)到溶液或晶體中的明顯HER2同型二聚化。EGFR和HER2 的域Π的殘基相似。然而，在二聚體接口處的Arg285在EGFR和HER2之間不是保守的。在 HER2中，殘基285是Leu。突變研究指示在該位置的Leu部分造成溶液中不存在HER2同型 二聚體。體內(nèi)的完整HER2的二聚化可能需要HER2的跨膜域中的位點(diǎn)的額外相互作用。
[0016]HER2是唯一不結(jié)合已知配體的ErbB家族成員。取而代之的是，HER2經(jīng)由與其他 ErbB家族成員形成異聚體復(fù)合物而被活化，并由此間接受到EFGR和HER3配體的調(diào)控。HER2 是3種其他ErbB受體的優(yōu)選的異二聚化配偶體。HER2增強(qiáng)其他ErbB受體對(duì)其配體的親和 力，這是通過(guò)延緩配體-受體復(fù)合物解離的速率實(shí)現(xiàn)，由此HER2增強(qiáng)并延長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)。HER2 增強(qiáng)其他ErbB受體的配體親和力的能力可以反映HER2作為異二聚化配偶體的混雜行為。 HER2與ErbB家族的另一配體結(jié)合型受體的異二聚化誘導(dǎo)交叉磷酸化，從而導(dǎo)致C末端酪氨 酸殘基的磷酸化。最具活性的HER2異二聚體是HER2-HER3復(fù)合物。HER2通過(guò)提供活性激 酶補(bǔ)償激酶缺陷性HER3。
[0017] 與EGFR相反，HER2在過(guò)表達(dá)時(shí)是內(nèi)在化抗性的。還報(bào)道了HER2的過(guò)表達(dá)抑制其 他ErbB家族成員的胞吞作用。已提出了HER2逃脫溶酶體降解并由此保留在質(zhì)膜的兩種機(jī) 制。HER2避免了內(nèi)在化，或者它被有效地從內(nèi)體再循環(huán)回到質(zhì)膜。使用標(biāo)記抗體的研究顯 示了HER2被不斷地內(nèi)在化和重復(fù)利用。相比之下，其他研究未能在用已知抑制重復(fù)利用的 化合物處理的細(xì)胞中鑒定胞內(nèi)HER2。
[0018] 已提出HER2的羧基末端不具有內(nèi)在化所需的所有信號(hào)或者其含有網(wǎng)格蛋白介導(dǎo) 的胞吞作用必要的抑制性信號(hào)。另外，研究顯示了HER2異二聚體沒(méi)有被遞送至內(nèi)體。在 HER2上也鑒定出Cbl?？浚╠ocking)位點(diǎn)，其與在EGFR上發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)相似（Y1112)。Cbl由 此能被招募至HER2,從而導(dǎo)致HER2的泛素化，但Cbl的實(shí)際結(jié)合效率不清楚。已提出HER2 由于其與膜突出（membraneprotrusion)的聯(lián)合而是內(nèi)在化抗性的。最后，其他研究顯示 了HER2-EGFR異二聚體的胞吞作用抗性與經(jīng)網(wǎng)格蛋白包被的窩的低效EGF誘導(dǎo)形成有關(guān)。
[0019]ErbB家族的第三個(gè)成員，稱為人表皮生長(zhǎng)因子受體3 (HER3,ErbB3)在1989年由 KrausM.H.等人鑒定。HER3基因編碼1342個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與EGFR和HER2具有驚人的 結(jié)構(gòu)相似性。特征如總體大小、具有兩個(gè)半胱氨酸簇（域II和IV)的4個(gè)胞外亞域（I-IV) 和酪氨酸激酶域顯示與EGFR和HER2的結(jié)構(gòu)相似性。HER3的酪氨酸激酶域與EGFR的酪氨 酸激酶域顯示59 %序列同源性。
[0020] 就如同EGFR-樣，HER3以受束縛的構(gòu)象和擴(kuò)展構(gòu)象存在。在束縛構(gòu)象中，二聚化 臂通過(guò)與域IV的相互作用而被掩埋，使得域I和III分開(kāi)太遠(yuǎn)而不能進(jìn)行有效配體結(jié)合。 配體與胞外域I和III的結(jié)合在HER3的擴(kuò)展構(gòu)象中發(fā)生且導(dǎo)致與ErbB家族的其他成員的 異二聚化。在配體結(jié)合時(shí)不形成HER3同型二聚體。擴(kuò)展的且配體結(jié)合的HER3分子優(yōu)先與 HER2異二聚化。
[0021] 與EGFR和HER2相反，HER3的酪氨酸激酶具有受損的催化活性，不足以實(shí)現(xiàn)任何 可檢測(cè)的生物學(xué)應(yīng)答。在蛋白質(zhì)激酶的催化域中高度保守的兩個(gè)氨基酸殘基在HER3的催 化域中是改變的。這些是在殘基815處將天冬酰胺取代為天冬氨酸，和在殘基740處將組 氨酸取代為谷氨酸。兩處氨基酸取代可能是HER3缺少其酪氨酸激酶域的催化活性的原因。 由于HER3的受損的內(nèi)在激酶活性，該受體需要與另一ErbB家族成員異二聚化以應(yīng)答其自 身配體結(jié)合。
[0022] 對(duì)HER3的胞吞作用知道得很少。而且，不同的研究表明HER3與HER2在相同的程 度上是胞吞作用受損的。與此一致，發(fā)現(xiàn)HER3-NRG1復(fù)合物比EGFR-EGF復(fù)合物在效率上更 小且更慢地被內(nèi)在化，從而支持以下觀點(diǎn)，即HER3不像EGFR那么有效地被胞吞。然而，當(dāng) EGFR的C末端尾部用HER3的C末端尾部替換時(shí)，EGFR變得胞吞作用受損，從而表明HER3 的C末端中區(qū)域保護(hù)受體免于內(nèi)在化。還表明由于內(nèi)體中配體-受體復(fù)合物的解離，NRGl沒(méi)有有效地將HER3靶向降解，就像其在EGF被TGFα活化時(shí)觀察到的。
[0023] 在過(guò)去十年中大量致力于將對(duì)ErbB家族的靶向作為癌癥治療策略。已探索 了不同的治療形式（modality)，如酪氨酸激酶抑制劑（ΤΚΙ)、單克隆抗體（mAb)和配體 阱（ligand-trap)。用于治療癌癥的單克隆抗體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是靶向特異性，從而確保 相比于常規(guī)細(xì)胞毒性癌癥化療的低毒性。已批準(zhǔn)將單克隆抗體用于治療具有異常高水 平EGFR或HER2的實(shí)體瘤，且靶向EGFR或HER2的大量mAb正在臨床試驗(yàn)中。TKI通過(guò) 結(jié)合EGFR和HER2的酪氨酸激酶域中的ATP結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制受體信號(hào)傳導(dǎo)。厄洛替尼 (Erlotinib) /Tarceva?.抑制EGFR的酪氨酸激酶，而拉帕替尼（Iapatinib) /Tykerb?抑 制EGFR和HER2兩者的酪氨酸激酶。厄洛替尼和拉帕替尼兩者均是FDA批準(zhǔn)的分別用于治 療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)和HER2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的TKI。
[0024] 然而，盡管單克隆抗體療法和TKI具有臨床可用性，但對(duì)治療的獲得性抗性的形 成是一項(xiàng)逐漸增加的問(wèn)題。mAb和常規(guī)細(xì)胞毒性化療的組合療法是為了增加治療功效而正 在實(shí)施的辦法之一。此外，正探索幾種策略來(lái)增加單克隆抗體的功效，包括增強(qiáng)效應(yīng)器功 能、和給抗體直接和間接裝備放射性核素或毒素。
[0025] 如此，需要另外的藥物來(lái)治療患者（包括已形成對(duì)已有治療的抗性的患者）中的 EGFR家族相關(guān)疾病。這些另外的藥物還應(yīng)當(dāng)在用于治療人患者時(shí)具有較低的引發(fā)不想要的 免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。
[0026] 發(fā)明概述
[0027] 我們發(fā)現(xiàn)同時(shí)用人源化抗體靶向兩種或更多種EGFR家族成員（例如EGFR、HER2 和HER3)導(dǎo)致對(duì)癌癥生長(zhǎng)的有效抑制。我們還發(fā)現(xiàn)靶向多種EGFR家族成員的組合物可用 于治療癌癥，如胰腺癌、骨癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌或尿道癌，包括已獲得對(duì)僅靶向一種EGFR 家族成員的藥物療法的抗性的癌癥。
[0028] 因此，本發(fā)明涉及針對(duì)EGFR、HER2和HER3的人源化抗體，以及包含針對(duì)兩種或更 多種這些靶物的兩種或更多種人源化抗體的組合物。本發(fā)明還涉及所述抗體和組合物用于 人癌癥療法的用途。
[0029] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種重組抗體組合物，其包含至少一種人源化抗EGFR抗 體或其抗原結(jié)合片段，至少一種人源化抗HER2抗體或或其抗原結(jié)合片段，和至少一種人源 化抗HER3抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0030] 本發(fā)明的人源化抗EGFR抗體可以選自以下：包含SEQIDNO: 1的重鏈可變區(qū)序列 和SEQIDNO:3或SEQIDNO:2的輕鏈可變區(qū)序列的抗體，和包含SEQIDNO:4的重鏈可 變區(qū)序列和SEQIDN0:5的輕鏈可變區(qū)序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗EGFR抗體 可包含包括Arg44和Val83的重鏈可變區(qū)序列（SEQIDNO: 1)，及包括Alal9和Phe92的 輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:2);包括Arg44，Val83和IleKM的重鏈可變區(qū)序列（SEQID N0:1)，和包括Tyr41，Leu51和Phe92的輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:3);或包括Arg44， Val83 和IleKM的重鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:1)，和包括Leu34,Tyr41，Leu51 和Phe92 的輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:3)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗EGFR抗體可包含包括 Leu20，Ile48和Ala68的重鏈可變區(qū)序列（SEQID勵(lì):4)，及包括￥&175和？1^87的輕鏈可 變區(qū)序列（SEQIDN0:5);或包括Leu20,Ile48,Leu56,和Ala68的重鏈可變區(qū)序列（SEQ IDN0:4)，及包括Val75和Phe87的輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:5)。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋一種人源化抗EGFR抗體，其重鏈和輕鏈氨基酸序 列分別包含：SEQIDNO:43 和 44,SEQIDNO: 38 和 39,SEQIDNO:41 和 42,SEQIDNO:45 和46,或SEQIDNO: 47和48,或其抗原結(jié)合片段。
[0032] 本發(fā)明的人源化抗HER2抗體可以選自以下：包含SEQIDN0:6的重鏈可變區(qū)序列 和SEQIDNO:7的輕鏈可變區(qū)序列的抗體，和包含SEQIDNO:8的重鏈可變區(qū)序列和SEQID N0:9的輕鏈可變區(qū)序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗HER2抗體可包含包括Ser55， Leu70，Val72，Lys74和Ala79的重鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:6)，和包括Val44，Met48和 Tyr70的輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:7);或包括Ser55和Val72的重鏈可變區(qū)序列（SEQ IDN0:6)，及包括Met48和Tyr70的輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:7)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述抗HER2抗體可包含包括Ala49，Ile74和Ser77的重鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:8)， 和包括Thr56，Tyr71，Ser85和LeuKM的輕鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:9)。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋一種人源化抗HER2抗體，其重鏈和輕鏈氨基酸序 列分別包含：SEQIDNO: 51和52,SEQIDNO: 49和50,或SEQIDNO: 53和54,或其抗原結(jié) 合片段。
[0034] 本發(fā)明的人源化抗HER3抗體可以選自以下：包含SEQIDNO: 10的重鏈可變區(qū)序 列和SEQIDNO: 11的輕鏈可變區(qū)序列的抗體，和包含SEQIDNO: 12的重鏈可變區(qū)序列和 SEQIDN0:13的輕鏈可變區(qū)序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗HER3抗體可包含包 括Met49，Ser55和Ile68，或Asn44，Ser55和Thr93的重鏈可變區(qū)序列（SEQIDN0:10)，和 包括Phe36,Val44,Phe49 和Ile85,或Phe36,Phe49 和Leu73 的輕鏈可變區(qū)序列（SEQID NO: 11)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗HER3抗體可包含包括Val46，Met49,Ser55和Arg72 的重鏈可變區(qū)序列（SEQID勵(lì)：12)，和包括￥&121，￥&144和？1^87和任選地11^29的輕鏈 可變區(qū)序列（SEQIDN0:13);或包括？1^41，￥3146，]^七49,56沾5和4找72的重鏈可變區(qū)序 列（SEQIDN0:12)，和包括Val21，Val44，Tyr71，Phe87和Leul04的輕鏈可變區(qū)序列（SEQ IDNO:13)。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋一種人源化抗HER3抗體，其重鏈和輕鏈氨基酸序 列分別包含：SEQIDN0:55和56，SEQIDN0:57和58，SEQIDN0:59和60,或SEQIDN0:61 和62,或其抗原結(jié)合片段。
[0036] 本發(fā)明還涵蓋包含2、3、4、5或6種上述抗體的抗體組合物。在一些實(shí)施方案中， 所述抗體組合物可以包含⑴11294和/或11302 ;(ii) 11249和/或11145 ;和（iii) 10738 和/或11052。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含所有6種抗體。
[0037] 所述抗體組合物可包含（a)抗EGFR抗體10292,10460或11294;(b)抗EGFR抗 體 10560 或 11302 ; (c)抗HER2 抗體 10704 或 11249 ; (d)抗HER2 抗體 11145 ; (e)抗HER3 抗體10738或10810 ;和（f)抗HER3抗體11006或11052。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所 述抗體組合物包含抗EGFR抗體11294和11302、抗HER2抗體11249和11145、以及抗HER3 抗體 10738 和 11052?？贵w 10292,10460,11294,10560,11302,10704,11249,11145,10738， 10810,11006,或11052可在任意重鏈和/或輕鏈氨基酸殘基中包含至少一個(gè)另外的取代， 在表4中指示為"Xaa"。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體組合物可包含（a)包含SEQIDNO:43的重鏈可變區(qū) 序列和SEQIDN0:44的輕鏈可變區(qū)序列的抗體；(b)包含SEQIDN0:47的重鏈可變區(qū)序 列和SEQIDN0:48的輕鏈可變區(qū)序列的抗體；（c)包含SEQIDN0:51的重鏈可變區(qū)序列 和SEQIDNO:52的輕鏈可變區(qū)序列的抗體；（d)包含SEQIDNO:53的重鏈可變區(qū)序列和 SEQIDNO:54的輕鏈可變區(qū)序列的抗體；（e)包含SEQIDNO:55的重鏈可變區(qū)序列和SEQ IDN0:56的輕鏈可變區(qū)序列的抗體；和（f)包含SEQIDN0:61的重鏈可變區(qū)序列和SEQ IDN0:62的輕鏈可變區(qū)序列的抗體。
[0039] 本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及用于生成本發(fā)明的抗體和抗體組合物的方法；包含本 發(fā)明的抗體或抗體組合物和藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物組合物；用于治療 人或其他哺乳動(dòng)物中癌癥的方法，包括對(duì)有此需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的重 組抗體組合物或藥物組合物；本發(fā)明的重組抗體組合物或藥物組合物用于制備供治療癌癥 用的藥物的用途；和本發(fā)明的重組抗體組合物或藥物，其用作治療癌癥的藥物。對(duì)于人治 療，抗體優(yōu)選針對(duì)人HER家族成員。在一些實(shí)施方案中，這些組合物中每一種均包含超過(guò)一 種單克隆抗體，所述單克隆抗體各自結(jié)合靶定的HER中的不同表位。在一些實(shí)施方案中，至 少一種抗體與抗癌劑（例如細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、毒素或放射性核素）綴合。
[0040] 可通過(guò)本發(fā)明的方法治療的癌癥包括但不限于胰腺癌（包括由KRAS突變促進(jìn)的 胰腺癌）、頭和頸癌、乳腺癌、乳癌、結(jié)腸癌（包括結(jié)腸直腸癌）、子宮內(nèi)膜癌、尿道癌、皮膚 癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、其他表皮癌、和對(duì)EGFR，HER2及HER3的一種或多 種有依賴性的癌癥。
[0041] 可以先前已經(jīng)對(duì)患者治療癌癥。例如，患者可以已經(jīng)用靶向單個(gè)EGFR家族成員的 藥物治療過(guò)且對(duì)該藥物（例如西妥昔單抗（cetuximab)、曲妥珠單抗（trastuzumab)或帕妥 珠單抗（pertuzumab))已獲得抗性。
[0042] 本發(fā)明還涉及一種核酸分子，其包含編碼本文描述的任意抗體重鏈或輕鏈或重鏈 或輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含這類核酸分子的表達(dá)載體和包含這類核酸 分子或載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以能表達(dá)本文所述的任意抗體。
[0043] 附圖簡(jiǎn)述
[0044] 圖1 :抗EGFR人源化單克隆抗體10292,10460,和11294的可變鏈與由嫁接到完 全人框架區(qū)中的初始鼠CDR構(gòu)成的計(jì)算機(jī)（inSilico)設(shè)計(jì)序列的氨基酸序列比對(duì)。點(diǎn) 指示同一性，而不同位置用其一字母氨基酸縮寫(xiě)標(biāo)記。陰影區(qū)域指示如通過(guò)IMGT限定 的CDR。上部：與CDR嫁接序列（1277_CDR嫁接-H;SEQIDN0:62)比對(duì)的 10292(SEQID N0:38)，10460(SEQIDN0:40)，和 11294(SEQIDN0:42)的可變重鏈。中部：與CDR嫁接 序列（11277_CDR嫁接-L;SEQIDN0:63)比對(duì)的 10292 的可變輕鏈（SEQIDN0:39)。底 部：與CDR嫁接序列（1277A_CDR嫁接-L;SEQIDN0:64)比對(duì)的 10460(SEQIDN0:41)和 11294(SEQIDNO:43)的可變輕鏈。
[0045] 圖2 :抗EGFR人源化單克隆抗體10560和11302的可變鏈與由嫁接到完全人框架 區(qū)中的初始鼠CDR構(gòu)成的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)序列的氨基酸序列比對(duì)。點(diǎn)指示同一性，而不同位置 用其一字母氨基酸縮寫(xiě)標(biāo)記。陰影區(qū)域指示如通過(guò)MGT限定的CDR。上部：與CDR嫁接序列 (1565_CDR嫁接-H;SEQIDN0:65)比對(duì)的 10560(SEQIDN0:44)和 11302(SEQIDN0:46) 的可變重鏈。底部：與CDR嫁接序列（1565_CDR嫁接-L;SEQIDN0:66)比對(duì)的10560(SEQ IDNO:45)和 11302(SEQIDNO:47)的可變輕鏈。
[0046] 圖3 :抗HER2人源化單克隆抗體10704和11249的可變鏈與由嫁接到完全人框架 區(qū)中的初始鼠CDR構(gòu)成的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)序列的氨基酸序列比對(duì)。點(diǎn)指示同一性，而不同位置 用其一字母氨基酸縮寫(xiě)標(biāo)記。陰影區(qū)域指示如通過(guò)MGT限定的CDR。上部：與CDR嫁接序列 (4384_CDR嫁接-H;SEQIDN0:67)比對(duì)的 10704(SEQIDN0:48)和 11249(SEQIDN0:50) 的可變重鏈。底部：與CDR嫁接序列（4384_CDR嫁接-L;SEQIDN0:68)比對(duì)的10704(SEQ IDN0:49)和 11249(SEQIDN0:51)的可變輕鏈。
[0047] 圖4 :抗HER2人源化單克隆抗體11145的可變鏈與由嫁接到完全人框架區(qū)中的初 始鼠CDR構(gòu)成的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)序列的氨基酸序列比對(duì)。點(diǎn)指示同一性，而不同位置用其一字 母氨基酸縮寫(xiě)標(biāo)記。陰影區(qū)域指示如通過(guò)頂GT限定的⑶R。上部：與⑶R嫁接序列（4517_ CDR嫁接-H;SEQIDNO:69)比對(duì)的11145的可變重鏈（SEQIDNO: 52)。底部：與CDR嫁接 序列（4517_CDR嫁接-L;SEQIDN0:70)比對(duì)的 11145 的可變輕鏈（SEQIDN0:53)。
[0048] 圖5 :抗HER3人源化單克隆抗體10738和10810的可變鏈與由嫁接到完全人框架 區(qū)中的初始鼠CDR構(gòu)成的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)序列的氨基酸序列比對(duì)。點(diǎn)指示同一性，而不同位置 用其一字母氨基酸縮寫(xiě)標(biāo)記。陰影區(qū)域指示如通過(guò)MGT限定的CDR。上部：與CDR嫁接序列 (5038_CDR嫁接-H;SEQIDN0:71)比對(duì)的 10738(SEQIDN0:54)和 10810(SEQIDN0:56) 的可變重鏈。底部：與CDR嫁接序列（5038_CDR嫁接-L;SEQIDNO: 72)比對(duì)的10738(SEQ IDNO: 55)和 10810(SEQIDNO: 57)的可變輕鏈。
[0049] 圖6 :抗HER3人源化單克隆抗體11006和11052的可變鏈與由嫁接到完全人框架 區(qū)中的初始鼠CDR構(gòu)成的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)序列的氨基酸序列比對(duì)。點(diǎn)指示同一性，而不同位置 用其一字母氨基酸縮寫(xiě)標(biāo)記。陰影區(qū)域指示如通過(guò)MGT限定的CDR。上部：與CDR嫁接序列 (5082_CDR嫁接-H;SEQIDN0:73)比對(duì)的 11006(SEQIDN0:58)和 11052(SEQIDN0:60) 的可變重鏈。底部：與CDR嫁接序列（5082_CDR嫁接-L;SEQIDN0:74)比對(duì)的11006(SEQ IDNO:59)和 11052(SEQIDNO:61)的可變輕鏈。
[0050] 圖7 :與其嵌合抗EGFR配偶抗體組合的人源化抗EGFR抗體變體10292的體外活 性。將A431NS細(xì)胞（上部小圖）和H358細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0051] 圖8:與其嵌合抗EGFR配偶抗體組合的人源化抗EGFR抗體變體10460的體外活 性。將A431NS細(xì)胞（上部小圖）和H358細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0052] 圖9:與其嵌合抗EGFR配偶抗體組合的人源化抗EGFR抗體變體10560的體外活 性。將A431NS細(xì)胞（上部小圖）和H358細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0053] 圖10:與其嵌合抗HER2配偶抗體組合的人源化抗HER2抗體變體10704的體外活 性。將0E19細(xì)胞（上部小圖）和BT474細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0054] 圖11:與其嵌合抗HER2配偶抗體組合的人源化抗HER2抗體變體11145的體外活 性。將0E19細(xì)胞（上部小圖）和BT474細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0055] 圖12 :與其嵌合抗HER3配偶抗體組合的人源化抗HER3抗體變體10738的體外活 性。將MBA-MD-175VII細(xì)胞（上部小圖）和MCF-7細(xì)胞（在存在InM調(diào)蛋白（heregulin)beta的情況下；下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值 土SEM。
[0056] 圖13:與其嵌合抗HER3配偶抗體組合的人源化抗HER3抗體變體10810的體外活 性。將MBA-MD-175VII細(xì)胞（上部小圖）和MCF-7細(xì)胞（在存在InM調(diào)蛋白beta的情況 下；下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0057] 圖14:與其嵌合抗HER3配偶抗體組合的人源化抗HER3抗體變體11006的體外活 性。將MBA-MD-175VII細(xì)胞（上部小圖）和MCF-7細(xì)胞（在存在InM調(diào)蛋白beta的情況 下；下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0058] 圖15:與其嵌合抗HER3配偶抗體組合的人源化抗HER3抗體變體11052的體外活 性。將MBA-MD-175VII細(xì)胞（上部小圖）和MCF-7細(xì)胞（在存在InM調(diào)蛋白beta的情況 下；下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0059] 圖16:嵌合的和人源化的抗體與人、獼猴和鼠HER家族抗原的交叉反應(yīng)性模式。 使用ELISA讀數(shù)器在450nm測(cè)量的來(lái)自40nM抗體的OD信號(hào)在陰性（-;0D〈0. 1)到強(qiáng)陽(yáng)性 (+++ ;0D>2. 5)打分。
[0060] 圖17:與其嵌合抗EGFR配偶抗體組合的人源化抗EGFR抗體變體11294的體外活 性。將A431NS細(xì)胞（上部小圖）和FaDu細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0061] 圖18:與其嵌合抗EGFR配偶抗體組合的人源化抗EGFR抗體變體11302的體外活 性。將A431NS細(xì)胞（上部小圖）和FaDu細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗體混合物 處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0062] 圖19:與其人源化抗HER2配偶抗體11145組合的人源化抗HER2抗體變體11249 的體外活性。將0E19細(xì)胞（上部小圖）和BT474細(xì)胞（下部小圖）用不同濃度的指定抗 體混合物處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均值土SEM。
[0063]圖 20:人源化抗體（變體 11294,11302,11249,11145,10738 和 11052;人源化 泛-HER)的混合物和嵌合抗體（1277,1565,4384,4517, 5038和5082;嵌合泛-HER)的混合 物的體外活性。將指定細(xì)胞系用不同濃度的指定抗體混合物處理96小時(shí)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為均 值土SEM。
[0064] 圖21A是顯示泛-HER與其EGFR(左），HER2 (中）和HER3 (右）靶蛋白的相互作 用的不意圖。
[0065] 圖21B是分別顯示用EGFR(左），HER2(中）和HER3(右）抗體處理對(duì)A431NS， HCC202,和MDA-MB-175-VII細(xì)胞系的代謝活性的影響的一系列圖。左邊小圖中的圖注從上 部到下部列出：陰性對(duì)照、1277,1565,1277+1565。中間小圖的圖注從上部到下部列出：陰 性對(duì)照、4384,4517,4384+4517。右邊小圖的圖注從上部到下部列出：陰性對(duì)照、5038, 5082， 5038+5082。
[0066] 圖21C是分別顯示在已用指定抗體和抗體混合物處理過(guò)的A431NS，HCC202和 MDA-MB-175-VII癌細(xì)胞的總細(xì)胞裂解物中的EGFR(左），HER2 (中）和HER3 (右）水平的 一系列Western印跡圖。
[0067]圖 22 是顯示在用泛-HER(1277,1565,4384,4517, 5038 和 5082;嵌合泛-HER)處 理的73種癌細(xì)胞系中的EGFR(左），HER2 (中）和HER3 (右）的受體磷酸化水平的圖像。
[0068]圖 23 是在用泛-HER混合物（1277,1565,4384,4517, 5038 和 5082;嵌合泛-HER)， 泛-HER亞組分和陰性對(duì)照抗體處理后以占未處理（無(wú)調(diào)蛋白或EGF)對(duì)照細(xì)胞（設(shè)為 100% )的百分?jǐn)?shù)顯示最大代謝活性的表。
[0069] 圖24是在存在5nM調(diào)蛋白的情況下用泛-HER(1277，1565,4384,4517,5038和 5082 ;嵌合泛-HER)，泛-HER亞組分和陰性對(duì)照抗體處理后以占在不存在配體時(shí)未處理對(duì) 照細(xì)胞（設(shè)為100%)的百分?jǐn)?shù)顯示最大代謝活性的表。將細(xì)胞暴露于含有抗體和配體的 培養(yǎng)基達(dá)96小時(shí)。（即同時(shí)向細(xì)胞加入配體和抗體）。
[0070]圖25是在存在InMEGF的情況下用泛-HER(1277,1565,4384,4517, 5038和5082; 嵌合泛-HER)，泛-HER亞組分和陰性對(duì)照抗體處理后以占在不存在配體時(shí)未處理對(duì)照細(xì)胞 (設(shè)為100%)的百分?jǐn)?shù)顯示最大代謝活性的表。將細(xì)胞暴露于含有抗體和配體的培養(yǎng)基 達(dá)96小時(shí)。（即同時(shí)向細(xì)胞加入配體和抗體）。
[0071]圖26是顯示 7 種胰腺癌細(xì)胞系（CAPAN-l，PK-l，CFPAC-l，BxPC3，ASPCl，CAPAN-2， Pan08. 13,PANC-1，KP4,MiaPaca-2和PSNl)圖上方所列的基因的突變狀態(tài)的圖。
[0072]圖27是一系列圖，顯示在缺乏（左）或存在調(diào)蛋白（中）和EGF(右）配體的情 況下CAPAN-I細(xì)胞系對(duì)泛-HER處理的劑量應(yīng)答。"泛-HER"指抗體1277,1565,4384,4517， 5038,和5082的混合物。
[0073] 圖25是一系列圖，顯示泛-HER和參照抗體對(duì)親本細(xì)胞系（上部）和已獲得對(duì)西 妥昔單抗、曲妥珠單抗或帕妥珠單抗的抗性的相應(yīng)抗性克?。ǖ撞浚┑拇x活性的作用。 "泛-HER"指抗體1277,1565,4384,4517,5038,和5082的混合物。左上小圖中的圖注從 上部到底部列為：泛-HER、西妥昔單抗、陰性對(duì)照。中上小圖中的圖注從上部到底部列為： 泛-HER、曲妥珠單抗、陰性對(duì)照。右上小圖中的圖注從上部到底部列為：泛-HER、帕妥珠單 抗、陰性對(duì)照。
[0074] 圖28是一系列圖，顯示泛-HER和參照抗體對(duì)親本細(xì)胞系（上部）和已獲得對(duì)西 妥昔單抗、曲妥珠單抗或帕妥珠單抗的抗性的相應(yīng)抗性克隆（底部）的代謝活性的作用。 "泛-HER"指抗體1277,1565,4384,4517,5038,和5082的混合物。左上小圖中的圖注從 上部到底部列為：泛-HER、西妥昔單抗、陰性對(duì)照。中上小圖中的圖注從上部到底部列為： 泛-HER、曲妥珠單抗、陰性對(duì)照。右上小圖中的圖注從上部到底部列為：泛-HER、帕妥珠單 抗、陰性對(duì)照。
[0075] 圖29是一系列Western印跡圖，其顯示在抗體處理后H292(上部）和0VCAR-8(底 部）細(xì)胞系的全細(xì)胞裂解物中EGFR、HER2和HER3的水平。"泛-HER"指抗體1277,1565， 4384,4517, 5038,和 5082 的混合物。
[0076] 圖30是顯示用泛-HER或其亞組分治療對(duì)BxPC-3異種移植物模型中的腫瘤體積 的影響的圖。"泛_冊(cè)1?"指抗體1277，1565,4384,4517,5038，和5082的混合物。16?1?"指 抗體1277和1565的混合物。"HER2"指抗體4384和4517的混合物。"HER3"指抗體5038 和5082的混合物。16?1?+冊(cè)1?2"指抗體1277，1565,4384，和4517的混合物。16?1?+冊(cè)1?3" 指抗體 1277,1565, 5038,和 5082 的混合物。"HER2+HER3"指抗體 4384,4517, 5038,和 5082 的混合物。
[0077] 圖31是一系列圖，其顯示經(jīng)EGFR和HER2免疫標(biāo)記的腫瘤切片，所述腫瘤在退出 治療后3天從經(jīng)媒介物和泛-HER處理的BxPC-3異種移植物切出。"泛-HER"指抗體1277， 1565.4384.4517, 5038,和 5082 的混合物。
[0078] 圖32是顯示用泛-HER或其亞組分治療對(duì)Calu-3異種移植物模型中的腫瘤體積 的影響的圖。"泛_冊(cè)1?"指抗體1277，1565,4384,4517,5038，和5082的混合物。16?1?"指 抗體1277和1565的混合物。"HER2"指抗體4384和4517的混合物。"HER3"指抗體5038 和5082的混合物。16?1?+冊(cè)1?2"指抗體1277，1565,4384，和4517的混合物。16?1?+冊(cè)1?3" 指抗體 1277,1565, 5038,和 5082 的混合物。"HER2+HER3"指抗體 4384,4517, 5038,和 5082 的混合物。
[0079] 圖33(上部）是一系列Western印跡圖，其顯示在抗體處理后BxPC-3腫瘤裂解物 中EGFR，HER2,HER3和β-肌動(dòng)蛋白加載對(duì)照的水平。對(duì)Western印跡條帶強(qiáng)度中EGFR、 HER2和HER3水平的相對(duì)定量顯示在圖30的一系列圖（底部）中。"泛-HER"指抗體1277， 1565.4384.4517, 5038,和 5082 的混合物。"EGFR" 指抗體 1277 和 1565 的混合物。"HER2" 指抗體4384和4517的混合物。"HER3"指抗體5038和5082的混合物。"EGFR+HER2"指抗 體 1277,1565,4384,和 4517 的混合物。"EGFR+HER3"指抗體 1277,1565, 5038,和 5082 的混 合物。"HER2+HER3" 指抗體 4384,4517, 5038,和 5082 的混合物。
[0080]圖 34 是一系列圖，其顯示泛-HER對(duì)ST191，ST204,ST383,STS021，ST179,ST385， STS064,ST334,STS059,和STS058患者衍生的KRAS突變性胰腺癌腫瘤異種移植物模型中腫 瘤體積的作用。"泛-HER"指抗體1277,1565,4384,4517, 5038,和5082的混合物。
[0081] 圖35是一系列圖，其顯示用泛-HER或其亞組分治療對(duì)ST179和ST383患者衍生的 KRAS突變性胰腺癌腫瘤異種移植物模型中腫瘤體積的作用。"泛-HER"指抗體1277,1565， 4384.4517, 5038,和5082的混合物。"EGFR"指抗體1277和1565的混合物。"HER2"指抗 體4384和4517的混合物。"HER3"指抗體5038和5082的混合物。"EGFR+HER2"指1277， 1565,4384,和 4517 的混合物。"EGFR+HER3" 指抗體 1277,1565,5038,和 5082 的混合物。 "HER2+HER3" 指抗體 4384,4517, 5038,和 5082 的混合物。
[0082] 圖36是顯示獲得性西妥昔單抗抗性HN5克隆的形成和克隆的圖。
[0083] 圖37是顯示西妥昔單抗處理對(duì)親本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2，HN5 CR6,HN5CR13,和HN5CR14的劑量-應(yīng)答效果的圖。
[0084] 圖38是顯示西妥昔單抗對(duì)固定的HN5親本細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2， HN5CR6，HN5CR13,和HN5CR14的結(jié)合曲線的圖。
[0085] 圖39是顯示在親本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2，HN5CR6，HN5CR13， 和HN5CR14中通過(guò)熒光流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)的EGFR的相對(duì)表面水平的圖。
[0086] 圖40是一系列Western印跡圖，其顯示在來(lái)自未經(jīng)處理（左）或用EGF刺激（右） 的親本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2,HN5CR6,HN5CR13,和HN5CR14的細(xì)胞 裂解物中EGFR，磷酸化EGFR種類和β-肌動(dòng)蛋白加載對(duì)照的總水平。
[0087] 圖41是一系列Western印跡圖，其顯示在來(lái)自未經(jīng)處理（左）或用EGF刺激（右） 的親本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2,HN5CR6,HN5CR13,和HN5CR14的細(xì)胞 裂解物中EGFR，AKT，pAKT(Ser473)，ERK1/2,pERKl/2(Thr202/Tyr204)和β-肌動(dòng)蛋白加 載對(duì)照的總水平。
[0088] 圖42是顯示用EGFR-LNA，西妥昔單抗，EGFR-2mix(抗體1277和1565)或?qū)φ仗?理的親本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2和HN5CR14的存活力的圖。
[0089] 圖43是一系列Western印跡圖，其顯示在用EGFR-LNA，西妥昔單抗， EGFR-2mix(抗體1277和1565)或?qū)φ仗幚淼挠H本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5CR2 和HN5CR14中EGFR的總水平。
[0090] 圖44是顯示用指定EGFR抗體處理的親本HN5細(xì)胞和西妥昔單抗抗性克隆HN5 CR2，HN5CR6，HN5CR13,和HN5CR14 的存活力的圖。"EGFR2mix"指抗體 1277 和 1565 的 混合物。"Her3 2mix"指抗體5038和5082的混合物。
[0091] 圖45是一系列圖，其顯示親本HN5細(xì)胞（圖45A)和西妥昔單抗抗性克隆HN5 CR2(圖45B)存活力對(duì)用指定抗體處理的劑量應(yīng)答。"EGFR2mix"指抗體1277和1565的混 合物。"Her3 2mix"指抗體 5038 和 5082 的混合物。"EGFR+HER3 4mix"指抗體 1277,1565， 5038和5082的混合物。
[0092] 發(fā)明詳述
[0093] 盡管一些單克隆抗體（例如西妥昔單抗、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗）已用于治療 EGFR家族相關(guān)疾病，但這些治療并非對(duì)所有患者均有效。另外，患者經(jīng)常在初始使用后形成 對(duì)這類藥物的抗性。本發(fā)明基于我們發(fā)現(xiàn)靶向EGFR家族成員EGFR、HER2和HER3的新人源 化抗體及這類人源化抗體的混合物（人源化泛-HER抗體組合物）能有效下調(diào)靶物并抑制 多種癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。我們還發(fā)現(xiàn)了，靶向EGFR家族成員EGFR、HER2和HER3的抗體混合 物有效抑制多種人癌癥異種移植物模型（包括難治性患者衍生的胰腺癌模型）中的腫瘤生 長(zhǎng)。我們還已顯示靶向超過(guò)一種EGFR家族成員的抗體混合物在已獲得對(duì)治療性單克隆抗 體（如西妥昔單抗、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗）的抗性的細(xì)胞中保留其抑制性效果。
[0094] 人源化抗體
[0095] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及結(jié)合EGFR家族成員EGFR、HER2和HER3的人源化抗體。術(shù) 語(yǔ)"抗體"或"抗體分子"描述了血清的功能性組分且經(jīng)常指代為分子（抗體或免疫球蛋白） 的集合或一種分子（抗體分子或免疫球蛋白分子）?？贵w能結(jié)合特定的抗原決定簇（抗原 或抗原表位）或與之反應(yīng)，這繼而可以導(dǎo)致免疫學(xué)效應(yīng)器機(jī)制的誘導(dǎo)。單個(gè)抗體通常認(rèn)為 是單特異性的，而抗體組合物可以是單克隆（即由相同抗體分子組成）或多克?。从膳c 相同抗原或甚至獨(dú)特的不同抗原上的相同或不同表位反應(yīng)的兩種或更多種不同抗體組成） 的。每種抗體具有使其能夠與其相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，且所有天然抗體具有兩 條相同輕鏈和兩條相同重鏈的同樣的總體基本結(jié)構(gòu)?？贵w也統(tǒng)稱為免疫球蛋白。
[0096]除非另外指示，術(shù)語(yǔ)"（一種或多種）抗體"用于本文意圖包括單鏈抗體以及抗體 的片段，如Fab、F(ab'）2、Fv片段或單鏈Fv(scFv)片段、和多聚體形式如二聚體IgA分子 或五價(jià)IgM。因此，在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，對(duì)"抗體"的指代均意圖具體涵蓋結(jié)合片段和 單鏈抗體，除非另外指示或從上下文明顯看出并非這一情況。
[0097] 抗體的每條重鏈典型地包含重鏈可變區(qū)（VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)通常包 含3個(gè)域，稱為CHl，CH2和CH3。每條抗體輕鏈通常包含輕鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈恒定區(qū)。 輕鏈恒定區(qū)通常包含單個(gè)域，稱為CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成高變性區(qū)（"高變區(qū)"， 其可以在序列和/或結(jié)構(gòu)限定的環(huán)中是高變的）。見(jiàn)于抗體可變域的"高變"區(qū)主要負(fù)責(zé) 決定抗體的結(jié)合特異性。這些亦稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，其散布有稱為框架區(qū)（FR)的更保 守的區(qū)?？贵w的每條重鏈和輕鏈含有3個(gè)⑶R區(qū)，稱為⑶R1，⑶R2和⑶R3,其中⑶R3顯示 最大可變性。每個(gè)VH和VL通常包含3個(gè)⑶R和4個(gè)FR,從氨基末端至羧基末端以如下順 序排列：FR1，CDRl，F(xiàn)R2,CDR2,FR3,CDR3,FR4?？勺儏^(qū)中的氨基酸殘基經(jīng)常使用稱為Kabat 編號(hào)方案（Kabat等人（1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest, 5th Ed.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,USA)的標(biāo)準(zhǔn) 化編號(hào)方法來(lái)編號(hào)，盡管也存在其他編號(hào)方案如Chothia和頂GT。
[0098] 術(shù)語(yǔ)"重組抗體"指從用包含抗體編碼序列的表達(dá)載體（或者可能有超過(guò)一種表 達(dá)載體，例如兩種表達(dá)載體）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)的抗體，其中所述編碼序列不與該 細(xì)胞自然聯(lián)系。
[0099] 本文中使用的四數(shù)字抗體編號(hào)，S卩1277，1565,4384,4517,5038和5082,指在WO 2012/059857中公開(kāi)的嵌合親本抗體，本發(fā)明的人源化抗體是從其衍生而來(lái)的。下表1顯示 抗體1277,1565,4384,4517, 5038和5082的重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈（LC)的DNA和氨基酸 序列的SEQIDN0,如表8中所列的。
[0100] 表1 :嵌合抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈的DNA和氨基酸序列的SEQIDNO
[0101]
【權(quán)利要求】
1. 一種重組抗體組合物，其包含至少一種人源化抗EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段、至少 一種人源化抗J1ER2抗體或其抗原結(jié)合片段、和至少一種人源化抗HER3抗體或其抗原結(jié)合 片段。
2. 權(quán)利要求1的抗體組合物，其中： 所述至少一種人源化抗EGFR抗體選自以下： (a) 抗體，其包含SEQ ID NO: 1的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 2的輕 鏈可變區(qū)序列，和 (b) 抗體，其包含SEQ ID NO:4的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO:5的輕鏈可變區(qū)序列； 所述至少一種人源化抗J1ER2抗體選自以下： (c) 抗體，其包含SEQ ID N0:6的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:7的輕鏈可變區(qū)序列， 和 (d) 抗體，其包含SEQ ID NO:8的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO:9的輕鏈可變區(qū)序列； 和 所述至少一種人源化抗J1ER3抗體選自以下： (e) 抗體，其包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO: 11的輕鏈可變區(qū)序 列，和 (f) 抗體，其包含SEQ ID NO: 12的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID NO: 13的輕鏈可變區(qū)序 列。
3. 權(quán)利要求2的抗體組合物，其包含： (a) 抗體，其包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:44的輕鏈可變區(qū)序 列； (b) 抗體，其包含SEQ ID N0:47的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:48的輕鏈可變區(qū)序 列； (c) 抗體，其包含SEQ ID N0:51的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:52的輕鏈可變區(qū)序 列； (d) 抗體，其包含SEQ ID N0:53的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:54的輕鏈可變區(qū)序 列； (e) 抗體，其包含SEQ ID N0:55的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:56的輕鏈可變區(qū)序 列；和 (f) 抗體，其包含SEQ ID N0:61的重鏈可變區(qū)序列和SEQ ID N0:62的輕鏈可變區(qū)序 列。
4. 權(quán)利要求2的抗體組合物，其包含抗EGFR抗體（a)和（b)，抗HER2抗體（c)和（d)， 和抗HER3抗體（e)和（f)。
5. 權(quán)利要求2的抗體組合物，其包含： ⑴抗EGFR抗體（a)，抗HER2抗體（c)，和抗HER3抗體（e); (ii) 抗EGFR抗體（a)，抗HER2抗體（c)，和抗HER3抗體（f); (iii) 抗EGFR抗體（a)，抗HER2抗體（d)，和抗HER3抗體（e); (iv) 抗EGFR抗體（a)，抗HER2抗體（d)，和抗HER3抗體（f); (v) 抗EGFR抗體（b)，抗HER2抗體（c)，和抗HER3抗體（e); (vi) 抗EGFR抗體（b)，抗HER2抗體（c)，和抗HER3抗體（f); (vii) 抗EGFR抗體（b)，抗HER2抗體（d)，和抗HER3抗體（e);或 (viii) 抗EGFR抗體（b)，抗HER2抗體（d)，和抗HER3抗體（f)。
6. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體組合物，其中所述抗EGFR抗體（a)包含： (i) 包含SEQ ID N0:1且具有Arg44, Val83和Ilel04的重鏈可變區(qū)序列，和包含SEQ ID N0:3且具有Leu34, Tyr41，Leu51和Phe92的輕鏈可變區(qū)序列； (ii) 包含SEQ ID N0:1且具有Arg44，Val83和Ilel04的重鏈可變區(qū)序列，和包含SEQ ID N0:3且具有Tyr41，Leu51和Phe92的輕鏈可變區(qū)序列；或 (iii) 包含SEQ ID N0:1且具有Arg44和Val83的重鏈可變區(qū)序列，和包含SEQ ID N0:2 且具有Alal9和Phe92的輕鏈可變區(qū)序列。
7. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體組合物，其中所述抗EGFR抗體（b)包含： (i) 包含SEQ ID N0:4且具有Leu20，Ile48和Ala68的重鏈可變區(qū)序列，和包含SEQ ID N0:5且具有Val75和Phe87的輕鏈可變區(qū)序列；或 (ii) 包含SEQ ID N0:4且具有1^1120，11648，1^1156，和41368的重鏈可變區(qū)序列，和包 含SEQ ID N0:5且具有Val75和Phe87的輕鏈可變區(qū)序列。
8. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體組合物，其中所述抗HER2抗體（c)包含： (i) 包含 SEQ ID N0:6 且具有 Ser55, Leu70, Val72, Lys74 和 Ala79 的重鏈可變區(qū)序 列，和包含SEQ ID N0:7且具有Val44, Met48和Tyr70的輕鏈可變區(qū)序列；或 (ii) 包含SEQ ID N0:6且具有Ser55和Val72的重鏈可變區(qū)序列，和包含SEQ ID N0:7 且具有Met48和Tyr7的輕鏈可變區(qū)序列。
9. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體組合物，其中所述抗HER2抗體（d)包含包含SEQ ID N0:8且具有Ala49，Ile74和Ser77的重鏈可變區(qū)序列，和包含SEQ ID N0:9且具有Thr56， Tyr71，Ser85和Leul04的輕鏈可變區(qū)序列。
10. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體組合物，其中所述抗J1ER3抗體（e)包含包含SEQ ID 勵(lì)：10且具有]^丨49,36沾5和11668或481144,36沾5和11^93的重鏈可變區(qū)序列，和包含 SEQ ID NO: 11 且具有 Phe36, Val44, Phe49 和 Ile85,或具有 Phe36, Phe49 和 Leu73 的輕鏈 可變區(qū)序列。
11. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體組合物，其中所述抗ffiR3抗體（f)包含： (i) 包含SEQ ID勵(lì):12且具有￥&146，]^丨49,56沾5和4找72的重鏈可變區(qū)序列，和包 含SEQ ID勵(lì)：13且具有￥&121，11^29，￥3144，和？11687的輕鏈可變區(qū)序列；或 (ii) 包含SEQ ID勵(lì)：12且具有？1^41，￥3146，]^七49,56沾5和4找72的重鏈可變區(qū)序 列，和包含SEQ ID NO: 13且具有Val21，Val44，Tyr71，Phe87和Leul04的輕鏈可變區(qū)序列。
12. 權(quán)利要求2的抗體組合物，其包含3、4、5或6種抗體。
13. 權(quán)利要求2的抗體組合物，其包含： (a) 抗 EGFR 抗體 1〇292,1046〇 或 11294 ; (b) 抗 EGFR 抗體 10560 或 11302 ; (c) 抗 HER2 抗體 1〇7〇4 或 11?9 ; (d) 抗 HER2 抗體 11145 ; (e) 抗 HER3 抗體 10738 或 10810 ;和 (f)抗 HER3 抗體 11006 或 11052。
14. 一種藥物組合物，其包含依照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的人源化重組抗體組合物和 至少一種藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
15. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求3的抗體組合物和至少一種藥學(xué)可接受的稀釋劑、載 體或賦形劑。
16. 權(quán)利要求14或15的藥物組合物，其中所述組合物中的至少一種抗體是免疫綴合 物，其中所述抗體與抗癌劑綴合。
17. -種人源化抗EGFR抗體或其抗原結(jié)合片段，所述人源化抗EGFR抗體的重鏈和輕鏈 氨基酸序列分別包含： SEQ ID NO:43 和 44， SEQ ID NO:38 和 39， SEQ ID NO:41 和 42， SEQ ID NO:45 和 46,或 SEQ ID NO :47 和 48。
18. -種人源化抗HER2抗體或其抗原結(jié)合片段，所述人源化抗HER2抗體的重鏈和輕鏈 氨基酸序列分別包含： SEQ ID NO:51 和 52， SEQ ID NO:49 和 50,或 SEQ ID NO:53 和 54。
19. 一種人源化抗HER3抗體或其抗原結(jié)合片段，所述人源化抗HER3抗體的重鏈和輕鏈 氨基酸序列分別包含： SEQ ID NO:55 和 56， SEQ ID NO:57 和 58， SEQ ID NO:59 和 60,或 SEQ ID NO:61 和 62。
20. -種核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段的重 鏈、或輕鏈、或兩者的核苷酸序列。
21. 包含依照權(quán)利要求20的核酸分子的表達(dá)載體。
22. -種宿主細(xì)胞，其包含依照權(quán)利要求21的核酸分子或依照權(quán)利要求21的表達(dá)載 體，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)由所述核酸分子編碼的所述抗體或抗原結(jié)合片段。
23. -種用于生成抗體的方法，包括提供依照權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)所 述抗體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并分離所得抗體。
24. -種用于生成重組抗體組合物的方法，所述組合物包含至少一種人源化重組抗 EGFR抗體、至少一種人源化重組抗HER2抗體和至少一種人源化重組抗HER3抗體，所述方法 包括： 提供至少第一、第二和第三種宿主細(xì)胞，其中所述第一種宿主細(xì)胞能表達(dá)如權(quán)利要求 17限定的重組抗EGFR抗體，所述第二種宿主細(xì)胞能表達(dá)如權(quán)利要求18限定的重組抗HER2 抗體，且所述第三種宿主細(xì)胞能表達(dá)如權(quán)利要求18限定的重組抗HER3抗體， 在適于表達(dá)所述抗EGFR抗體、所述抗HER2抗體和所述抗HER3抗體的條件下培養(yǎng)所述 第一、第二和第三種宿主細(xì)胞，并 分離所得抗體。
25. -種用于治療患者中癌癥的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用依照權(quán)利要求 1-13中任一項(xiàng)的重組抗體組合物或依照權(quán)利要求14或15的藥物組合物。
26. -種用于治療患有以EGFR、HER2和/或HER3的表達(dá)或過(guò)表達(dá)為特征的病癥的患 者的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用依照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的重組抗體組合物 或依照權(quán)利要求14或15的藥物組合物。
27. -種用于治療對(duì)用抗體和/或酪氨酸激酶抑制劑治療已獲得抗性的患者中的癌癥 的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用有效量的依照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的重組抗體 組合物或依照權(quán)利要求14或15的藥物組合物。
28. -種用于抑制患者中的癌癥生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用依照權(quán)利 要求1-13中任一項(xiàng)的重組抗體組合物或依照權(quán)利要求14或15的藥物組合物。
29. -種用于在癌癥患者中降低EGFR、HER2或HER3表達(dá)，或防止EGFR、HER2或HER3 上調(diào)的方法，包括對(duì)所述患者施用依照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的重組抗體組合物或依照 權(quán)利要求14或15的藥物組合物。
30. 依照權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述患者患有胰腺癌、骨癌、結(jié)腸癌、子 宮內(nèi)膜癌或尿道癌。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述患者具有胰腺癌和KRAS突變。
32. 權(quán)利要求25-31中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種所述抗體與抗癌劑綴合。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述抗癌劑是細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、毒素或放射性核素。
34. 權(quán)利要求25-33中任一項(xiàng)的方法，其中先前尚未對(duì)所述患者治療癌癥。
35. 權(quán)利要求25-33中任一項(xiàng)的方法，其中先前已經(jīng)對(duì)所述患者治療癌癥。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述患者先前已經(jīng)用西妥昔單抗（cetuximab)、曲妥珠單 抗（trastuzumab)或帕妥珠單抗（pertuzumab)治療。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述患者中的癌癥已獲得對(duì)西妥昔單抗、曲妥珠單抗或 帕妥珠單抗的抗性。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104428318SQ201380033627
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月2日
【發(fā)明者】J.蘭托, K.V.安德森, P.S.安德森, M.斯特蘭德, K.凱福德, L.S.尼爾森, M.W.佩德森, H.雅各布森, M.克拉格, I.克杰爾, T.T.波爾森 申請(qǐng)人:西福根有限公司